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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Di seguito è descritta una procedura operativa standard semplificata per la profilazione del microbioma che utilizza il sequenziamento e l'analisi metagenomica del rRNA 16S utilizzando strumenti liberamente disponibili. Questo protocollo aiuterà i ricercatori che non hanno familiarità con il campo del microbioma e quelli che richiedono aggiornamenti sui metodi per ottenere una profilazione batterica a una risoluzione più elevata.

Abstract

L'intestino umano è colonizzato da trilioni di batteri che supportano le funzioni fisiologiche come il metabolismo alimentare, la raccolta di energia e la regolazione del sistema immunitario. È stato suggerito che la perturbazione del microbioma intestinale sano svolga un ruolo nello sviluppo di malattie infiammatorie, compresa la sclerosi multipla (MS). I fattori ambientali e genetici possono influenzare la composizione del microbioma; pertanto, l'identificazione delle comunità microbiche legate a un fenotipo della malattia è diventata il primo passo verso la definizione del ruolo del microbioma nella salute e nella malattia. L'uso del sequenziamento metagenomico di rRNA 16S per la profilazione della comunità batterica ha contribuito a far progredire la ricerca sul microbioma. Nonostante il suo ampio uso, non esiste un protocollo uniforme per l'analisi di profilazione tassonomica basata su rRNA 16S. Un'altra limitazione è la bassa risoluzione dell'assegnazione tassonomica a causa di difficoltà tecniche come letture di sequenziamento più piccole, così come l'uso di letture solo in avanti (R1) in ultima analisi a causa della bassa qualità delle letture inverse (R2). È necessario un metodo semplificato con alta risoluzione per caratterizzare la diversità batterica in una determinata biocampione. I progressi nella tecnologia di sequenziamento con la capacità di sequenziare letture più lunghe ad alta risoluzione hanno contribuito a superare alcune di queste sfide. L'attuale tecnologia di sequenziamento combinata con una pipeline di analisi metagenomica disponibile al pubblico, come l'Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) basato su R, ha contribuito a far progredire la profilazione microbica ad alta risoluzione, poiché DADA2 può assegnare la sequenza al genere e i livelli delle specie. Di seguito è descritta una guida per l'esecuzione della profilazione batterica utilizzando l'amplificazione in due fasi della regione V3-V4 del gene rRNA 16S, seguita dall'analisi mediante analisi liberamente disponibili (ad esempio, DADA2, Phyloseq e METAGENassist). Si ritiene che questo flusso di lavoro semplice e completo servirà come un ottimo strumento per i ricercatori interessati a eseguire studi di profilazione del microbioma.

Introduzione

Microbiota si riferisce a una raccolta di microrganismi (batteri, virus, archea, batteriofagi e funghi) che vivono in un particolare ambiente, e il microbioma si riferisce al genoma collettivo dei microrganismi residenti. Poiché i batteri sono uno dei microbi più abbondanti negli esseri umani e nei topi, questo studio si concentra solo sulla profilazione batterica. L'intestino umano è colonizzato da trilioni di batteri e centinaia di ceppi batterici1. Il microbiota intestinale normale svolge un ruolo vitale nel mantenere uno stato sano nell'ospite regolando le funzioni (cioè il mantenimento di una barriera intestinale intatta, il metabolismo alimentare, l'omeostasi energetica, l'inibizione della colonizzazione da parte di organismi patogeni, e regolazione delle risposte immunitarie)2,3,4,5. Le perturbazioni compositive del microbiota intestinale (disbiosi intestinale) sono state collegate a una serie di malattie umane, tra cui disturbi gastrointestinali6, obesità7,8, ictus9, cancro10, diabete8,11, artrite reumatoide12, allergie13, e malattie del sistema nervoso centrale come la sclerosi multipla (MS)14,15 e Morbo di Alzheimer malattia (AD)8,16. Pertanto, negli ultimi anni, c'è stato un crescente interesse per gli strumenti per identificare la composizione batterica in diversi siti del corpo. Un metodo affidabile dovrebbe avere caratteristiche come essere ad alto consumo e facile da usare, avere la capacità di classificare microbiota batterico ad alta risoluzione ed essere a basso costo.

Le tecniche microbiologiche basate sulla cultura non sono abbastanza sensibili da identificare e caratterizzare il complesso microbioma intestinale a causa del fallimento di diversi batteri intestinali a crescere in coltura. L'avvento della tecnologia basata sul sequenziamento, in particolare il sequenziamento metagenomico basato su rRNA 16S, ha superato alcune di queste sfide e ha trasformato la ricerca sul microbioma17. La tecnologia avanzata di sequenziamento basata sull'rRNA 16S ha contribuito a stabilire un ruolo fondamentale per il microbioma intestinale nella salute umana. Il Progetto microbioma umano, l'iniziativa18dei National Institutes of Health e il progetto MetaHIT (un'iniziativa europea)19 hanno entrambi contribuito a stabilire un quadro di base per l'analisi del microbioma. Queste iniziative hanno contribuito a dare il via a più studi per determinare il ruolo del microbioma intestinale nella salute umana e nella malattia.

Un certo numero di gruppi hanno mostrato disbiosi intestinale in pazienti con malattie infiammatorie12,14,15,20,21,22. Nonostante sia ampiamente usato per la profilazione tassonomica a causa della capacità di multiplex e dei bassi costi, non esistono protocolli uniformi per la profilazione tassonomica basata su rRNA 16S. Un'altra limitazione è la bassa risoluzione dell'assegnazione tassonomica a causa di letture di sequenziamento più piccole (150 bp o 250 bp) e l'uso di sola lettura di sequenziamento in avanti (R1) a causa di letture di sequenziamento inverso di bassa qualità (R2). Tuttavia, i progressi nella tecnologia di sequenziamento hanno contribuito a superare alcune di queste sfide, come la possibilità di sequenziare letture più lunghe utilizzando letture a coppie (ad esempio, Illumina MiSeq 2x300bp).

L'attuale tecnologia di sequenziamento è in grado di sequenziare letture di buona qualità da 600 bp, che consentono la fusione di letture R1 e R2. Queste letture R1 e R2 più lunghe consentono migliori assegnazioni tassonomiche, in particolare con la piattaforma Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) basata su R ad accesso aperto. DADA2 utilizza assegnazioni basate su variante di sequenza di ampiezza (ASV) anziché assegnazioni operative di unità tassonomiche (OTU) basate sulla somiglianza del 97% utilizzata da QIIME23. Le partite ASV generano una corrispondenza esatta nella sequenza nel database all'interno di 1–2 nucleotidi, il che porta all'assegnazione a livello di genere e specie. Così, la combinazione di letture accoppiate accoppiate più lunghe e di buona qualità e migliori strumenti di assegnazione tassonomica (come DADA2) hanno trasformato gli studi sul microbioma.

Di seguito è fornita una guida passo-passo per eseguire la profilazione batterica utilizzando l'amplificazione in due fasi della regione V3-V4 di rRNA 16S e l'analisi dei dati utilizzando pipeline DADA2, Phyloseq e METAGENassist. Per questo studio, vengono utilizzati topi transgenici di classe II dell'antigene leucocito umano (HLA), poiché alcuni alleli di classe HLA II sono collegati con una predisposizione a malattie autoimmuni come MS20,24,25. Tuttavia, l'importanza dei geni di classe II HLA nella regolazione della composizione del microbiota intestinale è sconosciuta. Si ipotizza che la molecola di classe HLA II influenzerà la comunità microbica intestinale selezionando per batteri specifici. I principali topi da knockout di classe II (MHC) di classe II (AE.KO) o topi che esprimono molecole umane HLA-DQ8 (HLA-DQ8)24,25,26 sono stati utilizzati per comprendere l'importanza delle molecole HLA di classe II plasmare la comunità microbica intestinale. Si ritiene che questo flusso di lavoro completo e semplificato con l'analisi dei dati basata su R servirà come un eccellente strumento per i ricercatori interessati a eseguire studi di profilazione del microbioma.

La generazione di topi privi di geni murini MHC di classe II (AE.KO) e AE-/-. I topi transgenici HLA-DQA1-0103, DQB1-0302 (HLA-DQ8) con sfondo C57BL/6J sono stati descritti in precedenza26. I campioni fecali sono raccolti da topi di entrambi i sessi (8-12 settimane di età). I topi sono stati precedentemente allevati e mantenuti nella struttura animale dell'Università dell'Iowa in base alle linee guida NIH e istituzionali. Le strategie di controllo della contaminazione come lo svebilamento dei topi all'interno di un armadio di flusso laminare, il cambio dei guanti tra diversi ceppi di topi e la corretta manutenzione dei topi sono i passaggi fondamentali per la profilazione del microbioma intestinale.

Durante l'intera procedura sono altamente raccomandati dispositivi di protezione personale (PPE) adeguati. Quando si eseguono l'isolamento del DNA, l'amplificazione PCR1 e PCR2 e i passaggi di sequenziamento, è necessario includere controlli negativi appropriati. Si raccomanda l'uso di forniture sterili, prive di DNase, senza RNase e pirogeni. Per tutto il protocollo è necessario utilizzare il pipettor designato per il lavoro con microbioma e le punte filtrate delle pipette. L'analisi microbiota è costituita da sette fasi: 1) raccolta e lavorazione dei campioni fecali; 2) estrazione del DNA; 3) 16S amplificazione del gene rRNA; 4) costruzione della libreria del DNA mediante PCR indicizzato; 5) pulizia e quantificazione della PCR indicizzata (libreria); 6) Sequenziamento MiSeq; e 7) elaborazione dei dati e analisi delle sequenze. Nella Figura 1viene illustrato un diagramma schematico di tutti i passaggi di protocollo.

Protocollo

Il protocollo è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università dell'Iowa.

1. Raccolta e movimentazione dei campioni fecali

  1. Sterilizzare le caselle divisorie (vedere Tabella dei materiali, Figura supplementare 1) con 70% di etanolo.
  2. Tubi di microcentrifuga pre-etichetta (uno per mouse) con l'ID del campione e il gruppo di trattamento (se applicabile).
  3. Mettere i topi in scatole divisorie sterilizzate e lasciarli defecare normalmente fino a 1 h.
  4. Raccogliere i pellet fecali in un tubo di microcentrifuga vuoto da 1,5 ml con pinze sterili e chiudere il tubo in modo sicuro. Sterilizzare le pinze dopo aver raccolto da ogni topo.
  5. Collocare il tubo di microcentrifuga contenente pellet fecali in un congelatore a -80 gradi centigradi fino a un'ulteriore lavorazione.
    NOT: I divisori sono vantaggiosi perché consentono la raccolta simultanea di campioni fecali da più topi (fino a 12) contemporaneamente.

2. Estrazione di DNA

  1. Rimuovere i campioni fecali (topo o umano) dal congelatore e scongelare a temperatura ambiente (RT).
    NOT: Si consiglia di scongelare i campioni di feci umane durante la notte a 4 gradi centigradi, se necessario, per raccogliere 200 mg o la quantità richiesta da campioni di magazzino.
  2. Utilizzare 200 mg di materiali di partenza ed eluire il DNA ad un volume finale di 50 .L.
  3. Includere un kit di isolamento del DNA vuoto in cui non viene aggiunto alcun campione fecale, ma viene elaborato attraverso tutte le fasi di estrazione del DNA.
    NOT: È stato utilizzato uno specifico kit di isolamento del DNA (vedi Tabella dei materiali),in quanto contiene reagenti specifici per rimuovere materiali inibitori come biosolidi, materiale vegetale non digerito e composti ezoi dai globuli rossi lisci presenti nelle feci umane e murine Campioni.
  4. Mettere il tubo di perline in un omogeneizzatore (vedi Tabella dei materiali)e omogeneizzare i campioni per 45 s a RT e una velocità di 4,5 m/s.
    NOT: È possibile utilizzare l'omogeneizzatore perline di qualsiasi produttore. Tuttavia, si consiglia di standardizzare il metodo, in particolare la velocità e la durata dell'omogeneizzazione, quando si utilizza l'omogeneizzatore pertine da un altro fornitore.
  5. Isolare il DNA da singoli campioni fecali del topo utilizzando un kit di isolamento del DNA batterico seguendo il protocollo del produttore (vedi Tabella dei materiali)con piccole modifiche. Quantificare il DNA isolato caricando 1 oL del DNA su un fluorimetro o sul chip di elettroforesi ad alta sensibilità (vedere Tabella dei materiali).
    NOT: La resa prevista di DNA può variare da 500 a 2.500 ng quando si inizia con 200 mg del campione fecale.
  6. Regolare la concentrazione del DNA a 4-20 ng/L utilizzando il buffer di eluizione. Riquanti il DNA (come fatto al punto 2.5) prima di procedere all'amplificazione genica rRNA 16S (PCR1), se PCR1 non viene eseguito nello stesso giorno.

3. 16S rRNA Gene Amplification (PCR1)

  1. Impostare l'amplificazione del gene rRNA 16S (PCR1) in una piastra PCR da 96 pozzetti utilizzando un volume di reazione di 25.
  2. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 12,5 ll di 2 volte miscela di enzimi polimerasi ad alta fedeltà incluso buffer, oltre a dNTP (vedi Tabella dei materiali): 40 ng di DNA in un massimo di 10,5 l volume totale (regolare il volume totale con acqua di grado PCR): 1 (ciascuno) di in avanti e primer invertiti a una concentrazione di M.
    NOT: Le sequenze dei primer sono le seguenti:
    primer in avanti 5'-TCGTCGGCGTCA GATGTATAAGAGACACACACACAAGGGNGGGGGGGGCWGCAG-3' invertito primer 5'-GTCTCGTGGGCTGGAGATGTA TAAGAGACAGGGGAACHVGGGTATCTATCtAATC C-3'. Includere un kit vuoto dal passaggio 2.3 (controllo del reagente del kit) nella piastra PCR.
  3. Sigillare la piastra PCR e la centrifuga a 1.000 x g a 20 s per 1 min in una centrifuga piastra da tavolo (vedi Tabella dei materiali)ed eseguire la PCR in un ciclore termico programmato per: 95 s per 3 min; 25 cicli di 1) 95 gradi centigradi per 30 s, 2) 55 gradi centigradi per 30 s, 3) 72 gradi centigradi per 30 s; estensione finale a 72 gradi centigradi per 5 min; e tenere a 4 gradi centigradi.
    NOT: Anche se questo metodo di amplificazione genica rRNA 16S dovrebbe funzionare con diversi tipi di biocampioni, si consiglia di standardizzare il numero di cicli di amplificazione quando si avvia un nuovo progetto.
  4. Confermare le dimensioni del prodotto PCR1 caricando 1 -L del DNA su un chip di elettroforesi ad alta sensibilità. In alternativa, eseguire 5 Ll di 16S prodotto amplificato rRNA su un gel di agarose dell'1,5% per confermare 550 bp del prodotto PCR1.
    NOT: La pulizia del prodotto amplificato rRNA 16S è facoltativa e dipende dall'utilizzo del kit/metodo di isolamento del DNA. Se si utilizza un metodo interno di isolamento del DNA, il prodotto PCR1 può essere pulito utilizzando un kit di purificazione del DNA microbioma in base al protocollo del produttore (vedere Tabella dei materiali). Il kit di isolamento del DNA qui utilizzato produce un DNA ultrapuro e non richiede la pulizia del prodotto PCR1.

4. Costruzione della libreria del DNA utilizzando PCR indicizzato (PCR2)

  1. Inserire le prime primer Con codice a barre Index 1 e Index 2 in un rack speciale (vedere Tabella dei materiali) per 96 librerie.
    1. Disporre l'indice 1 primer nelle colonne 1–12 e Indice 2 nelle righe A–H del rack speciale.
    2. Aggiungete 2,5 L dell'indice 1 nelle colonne 1–12 e indice 2 nelle righe A–H utilizzando pipette multicanale. Posizionare il nuovo tappo (vedere Tabella dei materiali)sui primer dell'indice 1 e dell'indice 2 e conservarlo in un congelatore a -20 gradi centigradi.
  2. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 12,5 L di 2 volte miscela di enzimi polimerasi ad alta fedeltà contenente un buffer, oltre ai dNTP(vedere Tabella dei materiali); 5 -L di acqua di grado PCR e 2,5 l l di 16S prodotto amplificato da rRNA.
    NOT: Aggiungere indici univoci a ogni campione per il multiplexing di più di 96 librerie in un'unica esecuzione, come descritto in Kiernan et al.27. Il presente protocollo utilizza adattatori di un kit commerciale (ad esempio, Nextera XT Index Kit) in base alle istruzioni fornite dal produttore nel metodo di sequenziamento della metagenomica 16S (ad esempio, Illumina).
  3. Sigillare e centrifugare la piastra PCR indicizzata a 1.000 x g a 20 s per 1 min ed eseguire la PCR in un ciclore termico programmato per: 95 s per 3 min; 8 cicli di 1) 95 gradi centigradi per 30 s, 2) 55 gradi centigradi per 30 s, 3) 72 gradi centigradi per 30 s; e l'estensione finale a 72 gradi centigradi per 5 min.
  4. Confermare la 630 dimensioni di base del prodotto PCR indicizzato caricando 1 : L di DNA su un chip di elettroforesi ad alta sensibilità. In alternativa, eseguire 5 L di prodotto PCR indicizzato su un gel di agarose dell'1,5% per confermare le dimensioni e l'intensità del prodotto.

5. Pulizia della PCR indicizzata (PCR2) e quantificazione

  1. Pool 5 - L di amplificatore PCR2 utilizzando pipette multicanale da ogni pozzo in un vassoio serbatoio multicanale privo di DNase rilevabili, RNase, DNA umano e batteri pirogenici (vedere Tabella dei materiali).
  2. Trasferire il prodotto in pool dal vassoio del serbatoio multicanale in un tubo di microcentrizzazione e vortice da 1,5 ml vuoti e preetichettati da 1,5 ml da mescolare.
  3. Purificare il prodotto PCR2 utilizzando il kit di perline magnetiche standard(vedere Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore. Sigillare e conservare i restanti 20 gradi di PCR2 nella stessa piastra a -80 gradi centigradi per un ulteriore utilizzo, se necessario.
  4. Preparare l'80% di etanolo fresco aggiungendo 4 mL di 100% di etanolo a 1 mL di acqua di grado PCR.
  5. E' il tallone magnetico a RT e vortice per 30 s per disperdere le perline in modo uniforme.
  6. Vortice brevemente e girare verso il basso i campioni di amplificatore PCR2 in pool.
  7. Aggiungete 80 gradi di perline magnetiche in un tubo di microcentrifuga sterile da 1,5 ml sterile con 80 ll di prodotti PCR in pool, quindi vortice e girate brevemente per rimettere in modo uniforme le perline magnetiche.
  8. Incubare il contenuto a RT senza disturbare i tubi per 15 min.
  9. Posizionare il tubo con il DNA e le perle magnetiche su un supporto magnetico (vedi Tabella dei materiali) per 5 min.
  10. Rimuovere e scartare con cura 150 l del super-natante.
  11. Aggiungere 200 l di etanolo appena preparato all'80% senza disturbare le perline e incubare per 30 s.
  12. Rimuovere con attenzione, e scartare tutti i supernatali.
  13. Ripetere i passaggi da 5.11 a 5.12. Rimuovere il volume rimanente con una pipetta P10. Lasciare asciugare all'aria le perline per 15 minuti, con l'indice tubo PCR rimanente sul supporto magnetico.
  14. Togliere dal supporto magnetico. Aggiungere 33 l di tampone di eluizione (il buffer di eluizione del kit DNA è accettabile). Vorticare bene, ed eseguire un rapido giro per rimuovere il liquido rimanente sul lato. Incubare per 2 min e posizionare sul supporto magnetico per 5 min.
  15. Trasferire 30 -L del supernatore (prodotti PCR puliti) in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml pre-etichettato.
  16. Quantificare la piscina purificata caricando 1 OL della piscina purificata su un chip di elettroforesi fluorimetrico o ad alta sensibilità, in quanto ciò sarà necessario durante il sequenziamento. Eseguire MiSeq come descritto di seguito.

6. Sequenziamento MiSeq

  1. Creare un foglio di esempio contenente informazioni sui codici a barre specifici del campione per il flusso di lavoro della metagenomica e il demultiplexing sullo strumento MiSeq(vedere Tabella dei materiali). Caricare questo foglio di esempio nel software (ad esempio, Illumina Experiment Manager).
  2. Diluire le librerie in pool dal passaggio 5.15 a 4 nM.
  3. Denature ha unito le librerie combinando 5.L della piscina della biblioteca 4 nM con 5 -L di 0,2 M NaOH appena preparati in un tubo di microcentrismo da 1,5 ml. Vortice brevemente per mescolare, centrifugare brevemente e incubare per 5 min a temperatura ambiente RT.
  4. Aggiungere 990 ldi di cuscinetto di ibridazione ghiacciato (tamponi HB) e pipetta delicatamente da mescolare. Questo produrrà una libreria di 20 pM.
  5. Unire 2 l l della libreria di controllo da 10 nM con 3 l l di buffer EBT (10 mM Tris-HCl, pH 8,5, con 0,1% Tween 20) per produrre una libreria di controllo da 4 nM. Aggiungere brevemente 5 OL di 0,2 N NaOH appena preparati e il vortice per mescolare. Incubare per 5 min a RT.
  6. Aggiungere delicatamente il buffer di ibridazione ghiacciato (HB buffer) e la pipetta da mescolare per 990 l'l, e pipetta. Questo produrrà 20 pM librerie di controllo.
    NOTA: Le librerie di controllo Denatured 20 pM possono essere conservate a -20 gradi centigradi fino a 4 settimane. Dopo 4 settimane, i numeri dei cluster tendono a diminuire.
    1. Unire 210 l della libreria da 20 pM con 40 Litri della libreria di controllo da 20 pM (concentrazione finale - 18%) e aggiungere 350 l di buffer HB. Caricare la libreria ad una concentrazione finale di 7 pM.
      NOT: I dettagli di input devono essere regolati in base alle prestazioni di esecuzione.
  7. Incubare campioni per 2 min a 96 gradi centigradi. Mettere sul ghiaccio per 5 min.
    NOT: La sezione 6 di cui sopra può essere eseguita in una struttura del nucleo genomico/DNA.

7. Elaborazione dei dati e analisi della sequenza

  1. Utilizzare il software R (versione 3.5) per l'elaborazione e le analisi dei dati DADA2. Per i passaggi 7.1–7.4, utilizzare il software open-access come descritto nell'esercitazione online DADA2 sviluppata in precedenza disponibile all'indirizzo .
    NOT: Uno script R facilmente utilizzabile è stato allegato come file supplementare 2e gli utenti devono modificare il nome e l'origine dei file di sequenziazione (ad esempio, SAMPLENAME_R1_001.fastq e SAMPLENAME_R2_001.fastq).
  2. Visualizzare i profili di qualità delle letture in avanti e inretro utilizzando il comando plotQualityProfile.
  3. Tagliare i nucleotidi dalle letture in avanti e in retromarcia in base al grafico di qualità. Questi parametri vengono specificati dal parametro truncLen in DADA2.
    NOT: In questo caso, 280 viene utilizzato come soglia di lunghezza per la quale le letture in avanti verrebbero eliminate e 260 come soglia di lunghezza per la quale le letture inverse verrebbero eliminate.
  4. Elaborare i dati 16S non elaborati come file fastq dalla pipeline DADA2 come descritto nell'esercitazione online (disponibile all'indirizzo ) per unire le letture R1 e R2 e formare varianti di sequenza di amplificatori (ASV), che vengono quindi utilizzate per assegnare taxa con il database di riferimento Silva23.
    NOTA: una tabella di variante di sequenza di amplificatori di esempio di esempio generata dalla pipeline DADA2 è inclusa come File supplementare 3 . È possibile utilizzare un database di riferimento Greengene o Silva, in quanto non sono state riscontrate differenze nella classificazione batterica utilizzando uno di questi database.
  5. Generare un file di mapping definito dall'utente che contiene i metadati (ad esempio, genotipo, sesso, trattamento e così via) per ogni campione. Un file di metadati di esempio è stato incluso come File supplementare 4.
  6. Calcolare la diversità alfa (indice Shannon) e la diversità beta utilizzando l'analisi delle coordinate principali (PCA) in base ai conteggi OTU rarefatti utilizzando Phyloseq28 come descritto nell'esercitazione online, disponibile all'indirizzo .
  7. Eseguire la seguente analisi in METAGENassist29.
    NOTA:     Eseguire l'analisi dell'abbondanza differenziale utilizzando il test di somma di classificazione Wilcoxon a livello del genere. Mappe di calore e taxa differenzialmente abbondanti sono evidenziati utilizzando METAGENassist29, una pipeline di analisi pubblicamente disponibile e basata sul web.
    1. Caricare la tabella di abbondanza tassonomica (formato CSV) e selezionare Esempi nella colonna.
    2. Caricare il file di mapping (formato CSV) e selezionare Esempi in una riga.
    3. Selezionare Opzioni per rimuovere le variabili con oltre il 50% zeri ed escludere le letture non assegnate e non mappate.
    4. Selezionare Opzioni per normalizzare le righe per somma e registrazione delle colonne di normalizzazione.
    5. Crea un grafico Vulcano, PCA o PLSDA facendo clic sullo stesso nella colonna di sinistra e fai clic su Rimuovi nome campione per creare il grafico.
    6. Eseguire un test t(se solo due gruppi) o ANOVA (se maggiore di due gruppi) per visualizzare le caratteristiche (batteri) che differiscono tra i gruppi. Fare clic su Funzioni selezionate per visualizzare batteri specifici che differiscono da un gruppo all'altro.
    7. Fare clic su Dendrogramma o Mappa di calore per creare i rispettivi grafici. È possibile eseguire analisi aggiuntive, ad esempio la visualizzazione di esempio per gruppi o le prime 25 funzionalità basate su t-test/ANOVA.
    8. Fare clic su RandomForest per creare grafici che mostrano le feature che possono essere utilizzate per la classificazione. Fare clic sulla scheda Scostamento in alto per creare grafici per le caratteristiche principali che differiscono tra/tra i gruppi. Fare clic su Dettagli feature per visualizzare un elenco di batteri che differiscono tra i gruppi e fare clic su ogni batterio per creare un riepilogo grafico dello stesso.
    9. Fare clic sulla scheda Outlier in alto per visualizzare i campioni che sono outlier.
    10. Infine, fare clic su Scarica e selezionare 1) un file zip contenente tutte le analisi eseguite o 2) le funzioni desiderate da scaricare. Questo file deve essere salvato come nome univoco e dovrà essere decompresso prima dell'uso.

NOT: Per test statistici dettagliati eseguiti durante l'analisi del microbioma, fare riferimento alleopere di Chen et al.

Risultati

Poiché le molecole MHC di classe II (HLA negli esseri umani) sono attori centrali nella risposta immunitaria adattiva e mostrano forti associazioni con una predisposizione alla MS24,25,26, si è ipotizzato che la molecola HLA di classe II influenzerebbe la composizione microbica intestinale. Pertanto, i topi privi del gene MHC di classe II (AE.KO) o che esprimono il gene umano HLA-DQ8 (HLA-DQ8) sono stati utilizzati per compren...

Discussione

Il protocollo descritto è semplice, con misure facili da seguire per eseguire la profilazione del microbioma utilizzando il sequenziamento metagenomico di rRNA 16S da un gran numero di biocampioni di interesse. Il sequenziamento di nuova generazione ha trasformato gli studi sull'ecologia microbica, in particolare nei modelli di malattia umana e pre-clinica31,32. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua capacità di analizzare con successo complesse co...

Divulgazioni

A. M. ha ricevuto royalty dalla Mayo Clinic (pagata da Evelo Biosciences) come uno degli inventori di una tecnologia che sostiene l'uso di Prevotella histicola per il trattamento delle malattie autoimmuni.

Riconoscimenti

Gli autori riconoscono il finanziamento del NIAID/NIH (1R01AI137075-01), del Carver Trust Medical Research Initiative Grant e del Centro di ricerca sulle scienze ambientali dell'Università dell'Iowa, NIEHS/NIH (P30 ES005605).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 ml Natural Microcentriguge TubeUSA, Scientific1615-5500Fecal collection
3M hand applicator squeegee PA1-G3M, MN, US7100038651Squeeger for proper sealing of PCR Plate
Agencourt AMPure XPBeckman Coulter, IN, USAA63880PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up
Agilent DNA 1000 REAGENTAgilent Technologies, CA, USA5067-1504DNA quantification and quality control
Bioanalyzer DNA 1000 chipAgilent Technologies, CA, USA5067-1504DNA quantification and quality control
Index Adopter Replacement CapsIllumina, Inc., CA, USA15026762New cap for Index 1 and 2 adopter primer
DNeasy PowerLyzer PowerSoil KitMoBio now part of QIAGEN, Valencia, CA, USA12855-100DNA isolation
KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2X)Kapa Biosystem, MA, USAKK2602PCR ready mix for Amplicon PCR1 and Indexed PCR2
Lewis Divider BoxesLewis Bins, WI, USND03080Fecal collection
Magnetic standNew England BioLabs, MA, USAS1509SFor PCR clean-up
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction PlateApplied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA4346906PCR Plate
MicroAmp Optical Adhesive FilmApplied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA4311971PCR Plate Sealer
Microfuge 20 CentrifugeBeckman Coulter, IN, USAB30154Centrifuge used for DNA isolation
MiSeq Reagent Kit (600 cycles)v.3Illumina, Inc., CA, USAMS-102-3003For MiSeq Sequencing
Nextera XT DNA Library Preparation KitIllumina, Inc., CA, USAFC-131-100116S rRNA DNA Library Preparation
Reagent Reservoirs Multichannel TraysASI, FL,USARS71-1For Pooling of PCR2 Product
Plate CetrifugeThermo Fisher Scientific, CA, USA75004393For PCR reagent mixing and removing air bubble from Plate
PhiX ControlIllumina, Inc., CA, USAFC-110-3001For MiSeq Sequencing control
Microbiome DNA Purification KitThermo Fisher Scientific, CA, USAA29789For purification of PCR1 product
PowerLyzer 24 HomogenizerOmni International, GA, USA19-001Bead beater for DNA Isolation
Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) assay kitThermo Fisher Scientific, CA, USAQ32854DNA quantification
TruSeq Index Plate FixtureIllumina, Inc., CA, USAFC-130-1005For Arranging of the index primers
Vertical Dividers (large)Lewis Bins, WI, USDV-2280Fecal collection
Vertical Dividers (small)Lewis Bins, WI, USDV-1780Fecal collection

Riferimenti

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