ラット中枢神経系におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの子宮内送達

要約

ここでは、脊椎の腰部内腔にカテーテルを移植してラット中枢神経系に薬物を送出する方法について説明する。私たちはアンチセンスオリゴヌクレオチドの送達に焦点を当てていますが、この方法は他の治療モダリティの送達にも適しています。

要約

血液脳関門(BBB)は、血液から中枢神経系(CNS)への潜在的に有毒または病原性物質の入り口に対する重要な防御である。しかしながら、その存在はまた、CNSに全身的に投与された治療薬のアクセシビリティを劇的に低下する。これを克服する1つの方法は、これらの薬剤を脳脊髄液(CSF)に直接注入し、したがってBBBをバイパスすることです。これは浸透ポンプを使用して連続的な注入のためのカテーテルの注入によって、または単一のボーラスの配達のために行うことができる。本稿では、成人ラット脊椎のカウダ平ーナ空間に直接移植されたカテーテルを介してCNS標的アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)を送達するための外科的プロトコルについて説明する。代表的な結果として、ラットCNSの異なる領域で標的RNAをノックダウンするこのカテーテル法を介した単一のボーラスASO内皮(IT)注射の有効性を示す。プロシージャは安全で、有効であり、高価な装置または外科用具を要求しない。ここで説明する技術は、他のモダリティでも薬物を送出するように適合させることができる。

概要

中枢神経系(CNS)の血管系は、恒常性の重要な調節体として進化し、分子のトラフィックを制御し、栄養素を供給し、廃棄物を取り除いた。このシステムはまた、内皮細胞の壁に沿って密な接合部の密集した分布のおかげで、外部病原体の攻撃からの防御の最初のラインです。これらのタイトな接合部は、血液脳関門(BBB)の1つの側面を構成する。BBBは、栄養素とエネルギー要求(例えば、イオン、グルコース)を満たすために必要な分子の輸送を可能にする一方で、それはまた、有害^{化学物質1、2、3}と同様に病原体の通過を選択的に制限する。

皮肉なことに、病原体や有毒化学物質の通過を制限するBBBの同じ保護機能も、^生物2への全身投与後に治療治療を受けてCNSに容易にアクセスする能力の大きな障害^{である。 4、5}.BBBのこの役割は、新しい薬剤流通技術の多くの開発を促し、^{アプローチ6.}

この障害を克服する1つの方法は、脳と^{脊髄7、8、9、10}の両方を連続的に浸透させる脳脊髄液(CSF)に薬物を直接注入することです。本稿では、カテーテルの内端をラット脊椎のカウダ平名空間に完全に配置することにより、腰部内腔に薬剤を正常に送り込む方法について説明する。この手順の説明は、以前に Mazur et al.¹¹. .

このプロトコルは非常に有効であり、標的遺伝子ノック^ダウン8の定量ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)分析によって評価された場合、CNSへのアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)送達の90%以上の成功率を生成する。この処置は、ラットの100%が手術を生き延び、外科的創傷の周りに最小限の腫脹を示し、苦痛の兆候を示さない(例えば、多動、脱水、循環、バランスの喪失、食物摂取量の減少、および脱水)、オペ後の観察中。ここで説明する方法のもう一つの利点は、高価な機器や特別なツールを必要としないということです。

プロトコル

すべての生体内の手順は、実験動物のケアと使用のための米国国立衛生研究所ガイドが定めるガイドラインに従うバイオジェン制度動物使用ケア委員会(IACUC)承認プロトコルの下で行われました。

1. 材料および器具の準備

1. 特別ガイドカニューレを準備します。
   1. カットオフホイール(または鋭い鋸)を備えたロータリーツールを使用して19G針の両端を切り取り、長さ1.5-2cmの長いガイドカニューレ(図1Aiii)を作成します。回転工具の研削ホイールを使用して、両端を滑らかにします。
      注:または、プレメイドおよび滅菌ガイドカニューレは、商業ベンダー(材料の表)から購入することができます。
2. カテーテル/ワイヤーアセンブリを準備します。
   1. 8cmの長さのPE-10チューブ(ポリエチレンチューブ、直径0.011インチ)を切り、内皮カテーテルとして機能させます。エタノール耐性マーカーペンで片端から2cmのマークを作ります。ポリテトラフルオロエチレンコーティングされたステンレス鋼線から11cmの長いスタイルワイヤーをカットします。STYLEt ワイヤ (図 1Aii)を PE-10 カテーテルのルーメンに挿入します (図 1Ai)。
      メモ:動物ごとに1つのカテーテル/ワイヤアセンブリセット(図1Av)が必要です。あるいは、カテーテルとスタイルワイヤーは、商業ベンダー(材料の表)から購入することができます。
3. 配達カテーテルアセンブリを準備します。
   1. PE-50カテーテル(5−10cm、ポリエチレンチューブ、直径0.023インチ)をカットします(図1Bi)。PE50カテーテルの一方の端に23 Gチューブアダプターを挿入します(図1Biv)。この端は外科の間に100°Lの注射器(材料のテーブル)に接続される。ハブを切断した修正された30 G針(図1Biii)をPE-10チューブの約0.5cmのチューブ(図1Bii)に挿入し、PE-10チューブをカテーテルのもう一方の端に接続します。
   2. 送達カテーテルアセンブリの30 G針端(図1Bv)は、手術中にラットに埋め込まれたPE-10カテーテルの遠位端に接続されます。
      注: または、デリバリーカテーテルアセンブリ(図1Bv)は、市販のベンダー(材料表)から購入することができます。
4. ガイドカニューレアセンブリ(図1Avi)を23G針の端にガイドカニューレ(図1Aiii)を置いて準備します。
5. 12時間のエチレンオキシド殺菌装置を使用して、ガイドカニューレおよびワイヤー/カテーテルセットを含むすべての手術器具を殺菌します。
   メモ:カテーテルを除くすべての外科器具はオートクレーブすることができる;カテーテルは高温で溶ける。

2. 手術準備

注:この手順は、200gと400グラムの間の体重を持つ男性と女性のスプレイグ・ドーリーラットに対して日常的に行われます。2匹のラットは、食べ物と水への無料アクセスで12時間の光/暗いサイクルの下でケージごとに収容されています。

1. ラットを重量を量り、麻酔を誘発するためにイソフルランチャンチャンチャンチャン内に置く(O2では1−5%のイソフルラン、効果を発揮する)。
   注:ラットは、その後、手順全体を通して鼻コーンを介して深い麻酔を維持するために、イソフルランで連続的に麻酔されます。代替麻酔法(例えば、ケタミン100mg/kgおよびキシラジン10mg/kgの投与)は、IACUCによって承認され、使用することができる。
2. ラットがつま先のピンチに反応しない場合は、尾から尾部胸部脊椎に背中を剃り、加熱パッドの上に置かれた滅菌シートの上に剃ったネズミを置きます。
3. 50 ml 円錐円錐遠心管をラットの腹部の下に置き、腰部の脊椎を屈曲させ(図2A)、眼に眼軟膏を塗布する。
4. 持続放出ブプレノルフィンを注入する (1.0 mg/kg;材料表)ラットで皮下に。ポビドネとアルコールスクラブを交互に露出した皮膚をきれいにし、これを3回繰り返します。
   注: 代替疼痛緩和は、IACUC プロトコルの承認に応じて使用できます。
5. 手術部位の上にフェンストされた無菌透明のドレープで動物をドレープ。

3. 手術

1. 50 mL円錐管で支持されたラットを使用して、骨盤の上の筋肉間の2つの自然なピットを特定します(図2Aの矢印)。片手でピットを握り、もう一方の手を使って背骨を大胆に押して、歯の方向に向かう方向に向かい、椎骨間の最初の大きなインデントを見つけ、これはS1とL6椎骨の間の椎間空間である(図2B)).
2. 次のインデント、L5とL6椎骨と注射部位との間の椎間空間(*図2A)を識別するために少し唇を動かす。メスを使用して、ロストラルからコードへの中間線に沿って皮膚に長さ2cm以下の切開を行い、注射部位が切開の中心になるようにする(図2Aの点線)。
3. 筋肉層を視覚化するために、解剖はさみを使用して結合組織を解剖します。その後、L6腰椎の後ろ脊椎プロセスに直ちに横に筋肉カプセルで1cmの切開を行う。
   注:この時点で、L6腰椎の骨を可視化することができます。
4. ガイドカニューレ針アセンブリを第6腰椎の前面の近くに置き、針の端が脊柱管を貫通するように第6椎骨の前方面に沿って椎間空間に押し込みます。針に沿ってガイドカニューレを所定の場所に押し、ガイドカニューレのみを残して23 G針を取り外します。
   注:針を挿入する前に、L6腰椎の後ろ下のプロセスを見つけるために鈍い鉗子を使用すると便利です。一般に、CSF流体は針ハブに入るのを見ることができます(この流体は血液のヒントで刺さるかもしれませんが、これは害が行われたこと、または針が正しく置かれないことを示すものではありません)。著者らは、この処置中に大量の血液や重度の出血を見ていない。どちらかが発生した場合は、獣医に連絡して適切な治療を決定し、動物を安楽死させる必要があるかどうかを判断する必要があります。
5. カテーテルワイヤーアセンブリをガイドカニューレに挿入します。カテーテルワイヤーアセンブリを脊柱管に対して約45°の角度で角度を下ろし、両端を約0.3cmの脊柱管に押し込みます。
6. ガイドカニューレを取り外し、カテーテルにスタイルワイヤーを付け置いたままにします。図 1Bviに示すように、カテーテルの皮内先端から約 2.5 cm のスイレット ワイヤーを取り外し、2 cm のマークが運河の入り口 (筋肉のすぐ下に表示される) になるまでカテーテルを脊柱管に進めます。
   注:挿入されたカテーテルはくも膜下腔にロスタリングを伸ばす必要があります。配置が成功すると、その空間でカテーテルを自由に動かせることができるようにする必要があります。
7. スティットワイヤーを完全に撤回し、CSFが埋め込まれたカテーテルに入るのを見る。
8. 30 G針端を介して、移植されたカテーテルの遠位端に送達カテーテルアセンブリを接続します(図1Bv,vi)。
9. 滅菌生理食塩水を100μLシリンジ(フラッシングシリンジ)にロードします。試験化合物(例えば、ASO溶液)の30μLのボーラスを第2シリンジ(注射注射器)にロードする。
10. フラッシュシリン(生理線をロード)をデリバリーカテーテルアセンブリのチューブアダプタ端に接続します(図1Bv)。20 μLの滅菌生理食塩水を内腔に注入する(注射前のフラッシング)。
11. 注入注射器(試験化合物を搭載)をデリバリーカテーテルアセンブリのチューブアダプター端に接続します(図1Bv)。30°Lの試験化合物を30s以上の内腔に注入する。
    注:ASOの定期的な注入容積は脊髄および皮質のよいノックダウンを達成するために30°Lである。異なる注入量は試験されていないが、注入量が化合物^分布12に影響を及ぼす可能性が報告されている。他の化合物または体積を使用する場合は、安全性と有効性を経験的に決定する必要があります。
12. ステップ3.10を繰り返し、カテーテルを滅菌生理食塩水の別の40°L(注射後のフラッシング)で洗い流します。次に、移植されたカテーテルから送達カテーテルアセンブリを取り外します。
    注:プレおよびポストインジェクションフラッシュは、化合物の局所的な隔離を減少させ、ロストラル^構造12への分布を改善すると考えられている。
13. 無菌的に切断し、移植されたカテーテルを加熱シールする:彼らは非常に熱くなるまでビーズ滅菌器に滅菌鉗子のペアを置き、鉗子の熱い端でチューブを締め付けます。
    注:このアクションは、カテーテルを溶融します。したがって、チューブ内の穴が崩壊し、すべての側面が互いに固執し、無菌の方法でチューブを密封し、その後、皮下空間に配置されます。
14. 吸収性モノフィラメント縫合糸を使用して、残りの熱密閉カテーテルを結合組織に固定します。次に、非吸収性モノフィラメント縫合糸を使用して、固定されたヒートシールカテーテルの上に皮膚を閉じます。
    メモ:巻きクリップは、IACUCプロトコルの承認を得て使用することもできます。この技術は、私たちの手の中で1回の注射にのみ使用されていますが、繰り返し注射と互換性があります。繰り返し注射の実現可能性は、IACUCの承認を得て経験的に評価されるべきである。
15. ガーゼと生理線を使用して皮膚から血液を洗浄し、動物が加熱されたインキュベーターで麻酔から回復できるようにして移動し、その時点でホームケージ(ケージあたり2匹のラット)に戻します。
    注:同じ日に複数のラットに対して手術を行う場合、動物間の加熱ドライビーズ滅菌装置(少なくとも20s、冷却する時間)を使用して、水を使用して血液を除去し、再殺菌する洗浄ツール。5匹ごとに新しい楽器のセットが使用されます。
16. 手術後少なくとも3日間は毎日動物を監視し、IACUCプロトコルに従って手術から回復した後、毎週動物を監視し続けます。
    注:合併症(尿貯留、切開感染、発作や麻痺などの神経疾患)が発生した場合は、獣医に連絡して適切な治療を決定し、動物を安楽死させる必要があります。持続放出ブプレノルフィンを使用しない場合は、IACUCプロトコルに従って手術後毎日痛みの軽減を与えるべきである。

4. IT注入後の組織特異的ノックダウンの評価

1. ASAのITボーラス注射の2週間後に、脳の異なる領域(すなわち、大脳皮質、線条体および小脳)ならびに脊髄の異なるセグメント(すなわち、頸部、胸部、腰部)を収集する。市販のRNA抽出キットを用いて全組織RNAを抽出し、前に説明^した13のようにcDNA合成反応を行う。
   注:標準試薬は、ラットMalat1およびラットGAPDHのアッセイでqPCRに使用した。相対転写レベル^{は、2-ΔΔCT}法(CT=閾値サイクル)を用いて算出した。

結果

ここで説明する方法を用いて、リン酸緩衝生理食塩水PBSの単一ボーラスまたは長い非コーディング(linc)RNA Malat1を標的とするASOの300μgを用いて成体メスラットの2つのグループ(250−300g;n=10/グループ)を注入した。私たちの研究室では、Malat1が脳と脊髄を含むすべての^組織14でユビキタスかつ高レベルで表現されているため、Malat1 ASOをツールコンパウン?...

ディスカッション

本論文は、ラットCNSに直接治療薬を送り込む強力な方法を示す。理論的には、マウスでも同様の技術を行うことができますが、サイズが小さいため、この方法はより困難になる可能性があります。したがって、我々のグループは、CNS薬物送達のためのマウスにおける血管膜内血管内注射(ICV)を行い、異なる投与経路を通じて同じ目標に達する。その方法は、別の^研究16に記載...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3M Steri-Drape Small Drape with Adhesive Aperture	3M		1020
70% ethanol	Decon Laboratories, Inc		8416-160Z
Alcohol swab sticks	Dynarex		NO 1204
BD General Use Syringes 1 mL Luer-Lok tip	BD	1ml TB Luer-Lok tip	BD 302830
BD Intramedic PE Tubing	BD	Polyethylene tubing PE50 Diameter 0.023 in	BD 427400 (10ft, Fischer Scientific 22-204008) or 427401 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12P)
BD Intramedic PE Tubing	BD	Polyethylene tubing PE10 Diameter 0.011 in	BD 427410 (10ft, Fischer Scientific 14-170-11B) or 4274011 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12B)
BD Intramedic PE Tubing Adapters	BD	23 gauge intramedic luer stub adaper	BD 427565 or Fisher Scientific 14-826-19E
BD PrecisionGlide Single-use Needles 30G	BD		BD 305128
Buprenorphine Sustained Release-lab	ZooPharm	Prescription required
Ethylene oxide sterilizer	Andersen Sterilizer INC.	AN 74i, gas sterilizer	AN 74i
Guide cannula	BD	19G x 1 WT (1.1 mm x 25mm) needle	BD 305186
Hamilton syringe 100ul	Hamilton company	Hamilton syringe 100ul
Hot bead Sterilizer	Fine Science Tools		STERILIZER MODELNO FST 250
Ophthalmic ointment	Dechra veterranery product		17033-211-38
Pocket Pro Pet Trimmer	Braintree Scientific		CLP-9931 B
Povidone scrub	PDI		S48050
Saline	Baxter	Sodium Chloride 0.9% Intravenous Infusion BP 50ml	FE1306G
Scalpel	Feather	disposable scalpel	No. 10
Small animal heating pad	K&H Manufacturing		Model # 1060
Stylet Wire	McMaster-Carr	1749T14	LH-36233780
Surgery Towel drape	Dynarex		4410
Surgical scissors and forceps	FST and Fisher Scientific
Sutures	Ethicon		4-0 or 5-0
Tool to make the Guide cannular	Grainger	Rotary tool (Dremel)	14H446 (Mfr: EZ456)
		EZ lock cut off Wheel	1PKX5 (Mfr: 3000-1/24)
		Grinding Wheel, Aluminum Oxide	38EY44 (Mfr: EZ541GR)
		EZ lock Mandrel	1PKX8 (Mfr: EZ402-01)
		Diamond wheel floor Tile	3DRN4 (Mfr: EZ545)
Alternative source for pre-made and sterilized materials for this procedure
Dosing catheter system	SAI Infusion Systems		RIDC-01
Guide cannula	SAI Infusion Systems		RIDC-GCA
Internal Catheters	SAI Infusion Systems		RIDC-INC
Stylet Wire	SAI Infusion Systems		RIDC-STY