Purkinje Sobrevivência celular em culturas organotípicas cerebelares fatia

Resumo

As culturas organotípicas da fatia são uma ferramenta poderosa para estudar processos neurodevelopmental ou degenerative/regenerative. Aqui, descrevemos um protocolo que modela a morte do neurodesenvolvimento das células purkinje em culturas de fatias cerebelares do rato. Este método pode beneficiar a pesquisa na descoberta de medicamentos neuroprotetores.

Resumo

A cultura organotípica da fatia é um modelo in vitro poderoso que imite em condições do vivo mais pròxima do que culturas dissociadas da pilha preliminar. No desenvolvimento pós-natal inicial, as células cerebelares de Purkinje são conhecidas por passar por um período vulnerável, durante o qual passam por morte celular programada. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para realizar a cultura de fatiacerebelar organotípica do mouse durante este momento crítico. As fatias são ainda mais rotuladas para avaliar a sobrevivência celular de Purkinje e a eficácia de tratamentos neuroprotetores. Este método pode ser extremamente valioso para a tela para novas moléculas neuroativas.

Introdução

A modelagem in vitro é uma ferramenta essencial na pesquisa biomédica. Ele permite que os investigadores para estudar e controlar rigorosamente mecanismos específicos em tipos de células restritas, ou em sistemas isolados / órgãos. A cultura organotípica da fatia é uma técnica in vitro amplamente utilizada, especial no campo da neurociência^1. O método foi estabelecido pela primeira vez por Gähwiler, que cultou fatias cerebrais usando a técnica de tubo de rolo^2,e mais tarde modificado por Yamamoto et al., que introduziu o uso de uma membrana microporosa para realizar culturas de fatias corticais³. Em comparação com as culturas celulares primárias, as culturas organotípicas apresentam a vantagem de preservar a citoarquitetura do tecido, bem como as conexões células-células nativas no plano da seção de tecido.

As fatias organotípicas foram cultivadas a partir de muitas partes do sistema nervoso central, como o hipocampo^4,córtex^5,estriado^6,cerebelo^4,7,e medula espinhal^8,9,entre outros. Eles foram provados para ser uma ferramenta poderosa na descoberta de drogas estudos¹⁰. Os efeitos das moléculas neuroativas podem ser avaliados de muitas maneiras: sobrevivência e neurodegeneração usando imunomanchas e bioquímica, formação de circuito neuronal ou interrupção usando eletrofisiologia e imagem viva.

O objetivo deste trabalho é descrever um método simples para realizar a cultura cerebellar organotypic da fatia, que é sabida para ser um modelo relevante para imitar o desenvolvimento cerebellar in vitro. Particularmente, nós focalizamos no estudo da morte desenvolvente da pilha de Purkinje. In vivo, as células de Purkinje passam por apoptose durante a primeira semana pós-natal, atingindo o pico no dia pós-natal 3 (P3)¹¹. O mesmo padrão é observado na cultura cerebellar fatia, com neurônios Purkinje morrendo por apoptose quando cerebella são retirados de animais entre P1 e P8, com um pico de P3^4,12. O uso das culturas organotípicas de fatiacerebelares permitiu identificar várias moléculas neuroprotetoras^7,13,bem como compreender parte dos mecanismos envolvidos nesta morte celular programada^14,15,16. Aqui, descrevemos um protocolo baseado no estudo de Stoppini et al.¹⁷ no hipocampo, e adaptado ao cerebelo por Dusart et al.⁴ Inclui dissecação rápida e corte de cerebella pós-natal; cortar a cultura em uma inserção da cultura celular contendo uma membrana microporosa, com ou sem tratamento neuroprotetor; e imunofluorescência manchando para avaliar a sobrevivência neuronal.

Protocolo

Todos os experimentos envolvendo animais foram realizados de acordo com o comitê de Estudos em Animais da Northwestern University.

1. Preparação antes das culturas organotípicas de fatiacerebelares

1. Em uma capa de cultura celular pulverizada com 70% de etanol de antemão, prepare 200 mL de meio de cultura em um filtro de vácuo de 250 mL mL ligado a um receptor de garrafa estéril. Adicione 100 mL de Basal Medium Eagle (BME), 50 mL de Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), 50 mL de soro de cavalo inativado de calor, 1 mL de 200 mM L-Glutamina (concentração final 1 mM) e 5 mL de 200 g/l glicose (concentração final 5 mg/mL). Filtro a vácuo do meio de cultura e mantê-lo em +4 °C por até um mês.
2. No armário esterilizado da biossegurança, retire uma placa da cultura de 6 poços de seu pacote. Preencha cada poço com 1 mL de meio de cultura. Se um tratamento for testado, adicione o agente farmacológico ao bem tratado e ao mesmo volume de solução do veículo para o poço de controle. No presente estudo, adicionamos 1 μL de solução estéril de 3 M KCl ao poço tratado (30 mM final) e 1 μL de água estéril aos poços de controle.
3. Traga para dentro da capa da cultura celular o número necessário de inserções de cultura celular embrulhadas individualmente com membrana hidrofílico de politetrafluoroetileno (PTFE) (tamanho dos poros = 0,4 μm). Cuidadosamente desembrulhá-los e tirar as inserções de cultura celular com fórceps estéreis. Solte-os um por um em um poço de uma placa de 6 poços, evitando bolhas na interface entre a membrana de inserção e o meio de cultura celular. Deixe as inserções de equilíbrio no meio em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO₂ por pelo menos 2 h antes da cultura.
   NOTA:O helicóptero do tecido reside permanentemente na capa da cultura da pilha.
4. Prepare dois copos de 200 mL, um preenchido com 150 mL de água estéril, e o outro preenchido com 150 mL 70% de etanol. Mergulhe as ferramentas cirúrgicas no banho de etanol de 70% e, em seguida, na água antes de usá-los.
   NOTA:Não use ferramentas cirúrgicas imediatamente após o contato com o etanol.
5. Desinfete a lâmina de dois gumes no copo de etanol de 70%. Coloque-o no suporte da lâmina usando fórceps estéreis e mantenha-o no lugar usando a chave de braçadeira de lâmina. Deixe secar até usar.
6. Desinfete o disco de plástico fornecido com o helicóptero de tecido no copo de etanol de 70%. Pulverizar a tabela de corte com 70% de etanol antes de colocar o disco sobre ele. Deixe secar até que use.

2. Dissection e Cerebellar Organotypic Slice Cultures 2. Dissection e Cerebellar Organotypic Slice Cultures

1. Traga o filhote de cachorro do rato dentro da capa da cultura da pilha para executar a dissecação.
2. Decapitar o filhote rapidamente usando tesoura sem cor de funcionamento (Figura 1A).
3. Ao segurar a cabeça do filhote pelo nariz com fórceps de vestir em linha reta, corte o couro cabeludo usando uma tesoura de olho reto, a partir da extremidade posterior, e indo lateral para midline.
4. Prossiga de forma idêntica para o crânio.
   NOTA:Certifique-se de apontar dicas de tesoura para fora para evitar danificar o cerebelo durante a dissecação.
5. Tire o cérebro e transferi-lo para um prato de 60 mm cheio de HBSS frio + 5 mg / mL glicose.
6. Dissecar cuidadosamente o cerebelo usando fórceps finos retos estéreis (Figura 1B). Transfira-o para o disco de plástico colocado na mesa de corte do helicóptero de tecido usando fórceps finos curvos estéreis.
7. Oriente o tecido girando a tabela de corte para executar seções da parasagital.
8. Mova a tabela de corte puxando o botão da liberação da tabela à direita, assim que a lâmina é posicionada na borda do tecido.
9. Ajuste a espessura da fatia a 350 μm e a velocidade da lâmina ao meio.
10. Comece o helicóptero. Uma vez que todo o cerebelo foi cortado(Figura 1C),desligue o helicóptero.
11. Retire o disco de plástico com fórceps estéreis.
12. Cuidadosamente trazer o disco de plástico perto de um prato de 60 mm contendo HBSS + 5 mg / mL glicose. Pipette HBSS frio + 5 mg / mL glicose no tecido usando uma pipeta de transferência estéril para permitir a colheita de fatias cerebelares no prato cheio de tampão.
13. Separe as fatias cerebelares umas das outras usando uma microssonda. Tire seções de boa qualidade com a pipeta de transferência (recomenda-se usar seções de tecido que estão perto dos vermes) e deixá-las em uma inserção de cultura celular pré-equilibrada (Figura 1D).
14. Posicione as fatias cerebelares na inserção da cultura celular usando a microssonda e, em seguida, retire cuidadosamente o excesso de Solução de glicose HBSS + 5 mg/mL com a pipeta de transferência.
    NOTA:Nesta fase, o tecido é extremamente concurso e propenso a danos físicos. O número máximo de fatias cerebelares por inserção da cultura celular depende da idade do animal doador. 6-8 fatias podem ser cultivadas para um animal P0-P4-old, e 4-6 fatias para animais com mais de P5.
15. Coloque o prato de cultura na incubadora, mudando o meio completamente a cada 2-3 dias.
16. Para avaliar a sobrevivência celular de Purkinje, as fatias podem ser coletadas tão cedo quanto 5 dias in vitro. Para outros fins, eles podem ser mantidos na cultura por várias semanas(Figura 1F).
    NOTA:No caso dos experimentos de sobrevivência celular de Purkinje, não há necessidade de renovar o tratamento farmacológico ao mudar a cultura celular (Figura 1F).

3. Imunofluorescência

1. Retire a placa de 6 poços da incubadora. Remover o meio de cultura celular, lave a inserção da cultura celular com 1x PBS e corrigir as fatias com solução de paraformaldeído fria de 4% para 1 h, com 1 mL a inserção da cultura celular e 500 μL em cima da inserção da cultura celular.
2. Lave as inserções 4x 10 min com 1x PBS, com 1 mL abaixo e 500 μL em cima da inserção, em um shaker orbital.
3. Com um pincel, transfira as fatias cerebelares da inserção da cultura de 1 célula para 1 poço de 24 poços pré-preenchidos com 1x PBS, 0,25% Triton X-100 e 3% BSA (PBS-TB), 500 μL/well.
4. Permeabilize e bloqueie as fatias por incubação na PBS-TB por 1 h à temperatura ambiente.
5. Incubar com anticorpos primários diluídos na solução PBS-TB, durante a noite em + 4 °C, em um agitador orbital, 200 μL/well.
6. No dia seguinte, realize quatro laviras de 10 min com 1x PBS, em um agitador orbital, 500 μL/well.
7. Incubar com anticorpos secundários diluídos na solução PBS-TB, duas horas à temperatura ambiente, em um agitador orbital, e protegido da luz, 200 μL/well.
8. Executar quatro lavações de 10 min com 1x PBS, em um agitador orbital, 500 μL/well.
9. Contramanchar as fatias usando Hoechst 33342, diluído em 1x PBS (2 μg/mL), por 10 min à temperatura ambiente, protegido da luz, 500 μL/bem.
10. Monte as fatias cerebelares em um slide de microscopia com uma pipeta de transferência. Deixe-os secar completamente, protegidos da luz. Reumificar-los com 1x PBS e aplicar um coverslip coberto com poucas gotas de montagem média (~ 80 μL). Evite fazer bolhas.
11. Uma vez que o meio de montagem tenha curado, as seções cerebelares estão prontas para serem imagemdas.

4. Imagem e Quantificação da Sobrevivência Celular

1. Ligue o microscópio e lasers de acordo com o fabricante e / ou as instruções da instalação de núcleo de imagem.
2. Iniciar o software de aquisição.
3. Usando um objetivo 10X, localizar fatias cerebelares não alteradas que apresentam 9-10 lóbulos (geralmente seções cerebelares perto dos vermes).
4. Ativar a aquisição da pilha z. Defina a gama da z-pilha para incluir todas as células Purkinje presentes na fatia cerebelar. Defina um tamanho de etapa de 2 μm e inicie a aquisição. Salve a imagem adquirida no formato do fabricante de software de aquisição para preservar os metadados associados.
5. Abra o arquivo adquirido no ImageJ usando o plugin bioformato^18.
6. Vá para image > Stacks > Z-projeto... (Figura 2A).
7. Escolha a intensidade máxima no menu de entrega do tipo projeção e clique em OK (Figura 2B).
8. Uma imagem 2-D achatada será gerada. Clique duas vezes na ferramenta Multi-point para permitir que a janela point tool apareça. Desverifique a opção de pontos do rótulo para facilitar a visualização de células contadas. Em seguida, clique diretamente em uma soma de uma célula purkinje para começar a contar (Figura 1E). O número total de células contadas será indicado na parte inferior da janela point tool (Figura 3).
   NOTA:Normalmente, pelo menos 3 seções não danificadas contendo 9-10 lóbulos por inserção da cultura celular podem ser quantificadas. Para avaliar o efeito neuroprotetor de um agente farmacológico, pelo menos 3 experimentos independentes devem ser realizados.

Resultados

Como mostrado na Figura 4,este protocolo produz culturas organotípicas de fatiacerebelares nas quais a sobrevivência celular de Purkinje pode ser avaliada após as etapas de imunofluorescência e aquisição de imagem. As células purkinje foram rotuladas com uma combinação de anticorpos anticalbindin d-28K (diluição 1/200) e anti-rato Alexa594 (diluição 1/300). A costura da imagem foi feita automaticamente pelo software da aquisição do microscópio (NIS-Elementos) para obter um re...

Discussão

A cultura cerebellar da fatia é uma ferramenta poderosa para estudar a morte programada da pilha de Purkinje durante o desenvolvimento postnatal. Esta técnica pode ser usada para selecionar rapidamente moléculas candidatas para seu potencial neuroprotetor. A principal vantagem é que a configuração é simples e muito rentável, e requer apenas um investimento modesto em equipamentos (um vibratome pode custar até 3 vezes mais do que um helicóptero de tecido). Além disso, 10 a 15 fatias saudáveis podem ser geradas...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secondary antibody	ThermoFisher scientific	A21203
Basal Medium Eagle (BME)	ThermoFisher scientific	21010046
Biosafety cabinet Class II, Type A2	NuAire	NU-540-400
Bovine serum albumin	Millipore Sigma	A2153
Brush
anti-Calbindin D-28K antibody (CB-955)	Abcam	ab82812
CO2 Incubator	NuAire	NU-5700
Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates	Fisher Scientific	07-200-83
Coverslips, 22 x 50 mm	Fisher Scientific	12-545-E
Dressing forceps, straight	Harvard Apparatus	72-8949
Double edge blades	Fisher Scientific	50949411
Ethanol 200 proof	Decon Labs, Inc	2701
Eye Scissors, straight	Harvard Apparatus	72-8428
Fine forceps	Fisher Scientific	16-100-127
L-Glutamine 100X	ThermoFisher scientific	25030149
Glucose solution	ThermoFisher scientific	A2494001
Hanks’ Balanced Salt Solution	ThermoFisher scientific	14025092
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	Fisher Scientific	H21492
Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin	ThermoFisher scientific	26050088
ImageJ
McIlwain Tissue Chopper	Fisher Scientific	NC9914528
Microprobes	Fisher Scientific	08-850
Millicell Cell Culture Inserts	Millipore Sigma	PICM0RG50
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane, 250 mL	ThermoFisher scientific	168-0045
Nikon A1R confocal laser microscope system	Nikon
NIS-Elements Imaging Software	Nikon
Paraformaldehyde	Acros Organics	41678-0010
Pasteur pipets	Fisher Scientific	13-678-20D
Potassium Chloride	Fisher Scientific	BP366-500
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher scientific	P10144
Operating Scissors, straight	Harvard Apparatus	72-8403
Orbital shaker Belly Dancer	IBI Scientific	BDRLS0003
Prism 8	GraphPad
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Tissue Culture Dish, 60 mm w/ grip ring	Fisher Scientific	FB012921
Tissue culture plate, 24 well	Falcon/Corning	353047
Transfer pipettes, sterile	ThermoFisher scientific	13-711-21
Triton X-100	ThermoFisher scientific	BP151-500