Flux de spectrométrie de masse d'immunoprécipitation sans étiquette pour le profilage de l'interaction nucléaire à grande échelle

La spectrométrie de masse de purification d'immunoaffinité (IP-MS) est apparue comme méthode quantitative robuste d'identification des interactions protéine-protéine. Cette publication présente un flux de travail protéomique d'interaction complète conçu pour identifier les interactions protéines-protéines à faible abondance du noyau qui pourraient également être appliquées à d'autres compartiments subcellulaires. Ce flux de travail comprend la fractionnement subcellulaire, l'immunoprécipitation, la préparation de l'échantillon, le nettoyage hors ligne, la spectrométrie de masse sans étiquette unique, ainsi que l'analyse de calcul et la visualisation des données en aval. Notre protocole est optimisé pour détecter les interactions compartimentées et à faible abondance qui sont difficiles à identifier à partir de lysates cellulaires entiers (p. ex., interactions des facteurs de transcription dans le noyau) par immunoprécipitation des protéines endogènes compartiments sous-cellulaires fractionnés. Le pipeline de préparation d'échantillons décrit ici fournit des instructions détaillées pour la préparation de l'extrait nucléaire de cellules HeLa, la purification d'immunoaffinité de la protéine endogène d'appât, et l'analyse quantitative de spectrométrie de masse. Nous discutons également des considérations méthodologiques pour effectuer l'immunoprécipitation à grande échelle dans les expériences de profilage d'interaction basées sur la spectrométrie de masse et fournissons des lignes directrices pour évaluer la qualité des données afin de distinguer la véritable protéine positive interactions provenant d'interactions non spécifiques. Cette approche est démontrée ici en étudiant l'interaction nucléaire de la kinase CMGC, DYRK1A, une kinase protéine à faible abondance avec des interactions mal définies dans le noyau.