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요약

기재된 단백질 은 관심 있는 주어진 단백질및 무표지 질량 분석법의 면역친화성 농축을 사용하여 핵 세포 분획으로부터 단백질 상호작용 파트너를 식별하기 위한 프로테오믹스 워크플로우이다. 워크플로우에는 세포외 분획, 면역 침전, 필터 보조 시료 준비, 오프라인 정리, 질량 분석 법 및 다운스트림 생물 정보학 파이프라인이 포함됩니다.

초록

면역친화 질량 분석법(IP-MS)은 단백질-단백질 상호작용을 식별하는 강력한 정량적 방법으로 부상하였다. 이 간행물은 또한 그밖 세포외 구획에 적용될 수 있는 핵에서 낮은 풍부한 단백질 단백질 상호 작용을 확인하기 위하여 디자인된 완전한 상호 작용 proteomics 워크플로우를 제출합니다. 이 워크플로우에는 세포외 분획, 면역 침전, 샘플 준비, 오프라인 정리, 단일 샷 라벨 없는 질량 분석법, 다운스트림 계산 분석 및 데이터 시각화가 포함됩니다. 우리의 프로토콜은 전체 세포 용해물 (예를 들어, 핵에서 전사 인자 상호 작용)에서 내인성 단백질의 면역 침전에 의해 식별하기 어려운 구획화, 낮은 풍부 상호 작용을 검출하기 위해 최적화되어 있습니다. 분별 된 세포 실. 여기에 설명된 샘플 제제 파이프라인은 HeLa 세포 핵 추출물의 제조, 내인성 미끼 단백질의 면역 친화성 정제 및 정량 질량 분석 분석에 대한 자세한 지침을 제공합니다. 또한 질량 분석 기반 상호 작용 프로파일링 실험에서 대규모 면역 침전을 수행하기 위한 방법론적 고려 사항에 대해 논의하고 진정한 양성 단백질을 구별하기 위한 데이터 품질 평가 지침을 제공합니다. 비특이적 상호 작용에서 상호 작용. 이 접근법은 CMGC 키나아제, DYRK1A, 핵 내의 잘못 정의된 상호작용을 갖는 낮은 풍부 단백질 키나아제의 핵 상호작용을 조사함으로써 여기에서 입증된다.

서문

인간 프로테오메는 안정적인 다분체 복합체 형성과 일시적인 단백질-단백질 상호 작용을 통해 광대한 구조적 및 생화학적 다양성을 나타낸다. 따라서, 관심 있는 단백질에 대한 상호작용 파트너의 식별은 분자 메커니즘을 해명하기 위한 조사에서 일반적으로 요구된다. 선호도 정제 프로토콜의 최근 발전과 고해상도 고속 스캐닝 질량 분석 기의 출현은 단일 편견 없는 실험에서 단백질 상호작용 풍경을 쉽게 매핑할 수 있게 되었습니다.

단백질 상호작용 프로토콜은 일반적으로 관심 있는 단백질을 인식하는 고품질 항체를 요구하지 않고 단백질 상호작용을 식별하기 위해 친화성 태그가 달린 융합 구체를 가진 자궁경화성 발현 시스템을 사용합니다1,2. 그러나 에피토프 태그 기반 방법에는 몇 가지 단점이 있습니다. 에피토프와의 물리적 상호 작용은 비특이적 항화 단백질3의검출을유도할 수 있다. 부가적으로, 단백질의 N-또는 C 단말에 이들 에피토프 태그를 융합하면 네이티브 단백질-단백질 상호작용을 차단하거나, 단백질 폴딩을 방해하여 비생리적 적합성을 촉진할 수있다 4. 더욱이, 자궁경화 발현 시스템은 전형적으로 초생리학적 농도에서 미끼 단백질을 과발현하며, 이는 특히 투여에 민감한 유전자에 대해, 특히 단백질 상호작용의 식별을 초래할 수 있다5. 이러한 문제를 우회하기 위해, 내인성 미끼 단백질은 네이티브 단백질을 인식하는 고품질 항체의 가용성을 가정하고, 관련 상호 작용하는 먹이 단백질과 함께 면역 침전될 수 있다.

여기에 제공된 단백질성 단백질은 예를 들어 CMGC 단백질 키나아제 DYRK1A를 사용하여 내인성 단백질의 핵 상호작용을 검출하기 위한 워크플로우이다. DYRK1A 카피 수, 활성 수준 또는 발현의 중단은 인간에서 심각한 지적 장애를 일으킬 수 있으며, 마우스6,7,8,9에서 배아 치사성을 유발할 수있다. DYRK1A는 동적 시공간 조절10,및 구획화된 단백질 상호작용11,12를나타내며, 상이한 세포내 구획에 특이적인 낮은 풍부 상호작용 파트너를 검출할 수 있는 접근법을 요구한다.

이 프로토콜은 인간 HeLa 세포의 세포 분획을 시토졸 및 뉴클레오플라스 분획, 면역 침전, 질량 분석에 대한 샘플 준비 및 데이터 품질 및 시각화 결과를 평가하기 위한 생물 정보학 파이프라인의 개요를 분석 및 시각화용으로 제공하는 R 스크립트를 사용합니다(그림1) 이 워크플로우에 사용되는 Proteomics 소프트웨어 패키지는 모두 자유롭게 다운로드할 수 있으며 웹 인터페이스를 통해 액세스할 수 있습니다. 소프트웨어 및 계산 방법에 대한 자세한 내용은 제공된 링크에서 자세한 자습서 및 지침을 확인할 수 있습니다.

프로토콜

참고: 모든 버퍼 조성물 및 프로테아제 혼합물은 표 1에설명되어 있습니다.

1. 세포의 준비

참고: 이 면역 침전 질량 분석법(IP-MS) 접근법에 대해 복제당 1-10 mg 핵 용해물의 시작 물질이 요구된다. 세포 수량은 삼중 및 삼중 조절제에서 1 mg의 핵 면역 침전을 위해 주어질 것이다.

  1. 부착 된 세포주를 사용하는 경우, 수확 하기 전에 복제 당 3 x 15 cm 접시에 90% 합류 세포를 성장.
    참고 : 미끼 및 제어 조건에 대한 최소 3 개의 복제 면역 침전을 수행하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜은 섹션 4에서 시작하여 구슬과의 풍부하고 비특이적 인 상호 작용을 제어하는 '비드 만'컨트롤을 사용합니다. 다른 유형의 컨트롤이 유용할 수 있습니다. 이 것들은 토론 섹션에서 자세히 설명합니다.
    1. 인산완식염수(PBS)로 2x 세척하고 15 cm 플레이트당 0.25% 트립신의 3 mL를 사용하여 세포를 트립시니화한다. 1,200 x g에서 5 분 동안 세포를 스핀 다운하고 트립신을 decant.
  2. 현탁액 세포의 경우, 총 단백질 70-80 mg을 달성하기 위해 유사한 규모/밀도로 성장합니다.
    1. 펠렛 세포를 1,200 x g 및 4°C에서 5분 동안 조심스럽게 데펀트시켰다.
      참고: 이 단계에서 펠릿을 결합하여 섹션 2에 설명된 대규모 세포내 분획을 사용하여 효율적인 처리를 가능하게 할 수 있습니다.
  3. 단백질제 억제제(PIs) 및 인산염 억제제(PhIs)로 보충된 PBS+ 5 mM MgCl2로 세포 펠릿 2x를 세척합니다(표 1참조).
    참고: 세포 펠릿은 액체 질소에서 플래시 냉동되고 분획준비가 될 때까지 -80°C에서 보관될 수 있습니다.

2. 핵 추출의 준비

참고: 프로테아제 및 인산염 억제제는 사용 후 30분 이내에 분획 버퍼에 첨가해야 합니다.

  1. 동결하는 경우, 차가운 버퍼 A + PIs / PhIs의 1 x 펠릿 부피에서 15 분 동안 세포 펠릿을 해동하십시오. 해동하는 동안 재서스펜션을 돕기 위해 4 °C에서 영양사에 세포 펠릿을 놓습니다. 그렇지 않으면 1.3 단계에서 1x 펠릿 볼륨 버퍼 A + PIs /PhIs로 셀 펠릿을 다시 일시 중단합니다.
    1. 펠렛을 2,000 x g 및 4°C에서 10분 동안 완충한다.
  2. 완충 A로 포장 된 세포 볼륨의 5 배로 세포를 일시 중단하고 20 분 동안 얼음에 배양하십시오.
  3. 2,000 x g 및 4 °C에서 10 분 동안 펠릿 버퍼를 데산트하고 2 배 원래 포장 된 세포 볼륨 버퍼 A + PIs / PhIs로 다시 중단하고 "A"/ 느슨한 배봉으로 ~ 7x를 돌수 있습니다.
  4. 2,000 x g 및 4°C에서 10분 동안 용해해한다.
  5. 조심스럽게 상급에서 피펫을 벗겨 액체 질소로 깜박입니다. 용해액을 -80°C에 보관하십시오. 이 단계로부터의 상판은 세포질 아세포 분획이다.
    참고 : 핵 펠릿은 액체 질소로 플래시 동결및 -80 °C에 저장하여이 단계에서 저장할 수 있습니다
  6. 완충액 B + PIs / PhIs의 0.9 x 펠릿 부피로 펠릿을 다시 일시 중단하고 4 °C에서 5 분 동안 영양가에 섞습니다.
  7. 핵을 포액화하기 위해, 더 단단한 유봉 "B"로 20 배를 돌수 있습니다.
  8. 핵 용해를 4°C에서 30분 동안 영양분에 혼합하여 균일하게 합니다.
  9. 4°C에서 21,000 x g에서 30분 동안 핵 용해액을 원심분리합니다. 피펫을 상류에서 빼내고 수용성 핵 단백질 추출물로 저장한다.
    참고: 생성된 핵 펠릿의 뉴클레아제 치료는 염색질 관련 단백질 분획의 회복을 허용한다.
  10. 4°C에서 3시간 동안 완충액 +PI에 대해 수용성 핵 추출물을 투석한다.
    1. 8 kDa 분자량이 잘려 24mm 폭 투석 튜브의 적절한 길이를 잘라. 튜브의 한쪽을 고정하고 뉴클레오플라즘을 튜브에 로드합니다. 라세이트 를 적재 한 후, 다른 쪽 끝을 고정 하 고 버퍼 C + DI를 포함 하는 깨끗 한 유리 용기에 담급.
  11. 투석핵 추출물/핵소엽을 4°C에서 21,000 x g에서 30분 동안 30분 동안 원심분리기. IP-MS 분석에 사용되는 핵 추출물은 액체 질소에서 aliquoted 및 플래시 냉동 및 필요한 경우 -80°C에서 보관할 수 있습니다.

3. 세포 분열의 검증

  1. 단백질 분석기를 완료하여 핵 해수액의 단백질 농도를 결정합니다. bicinchoninic 산 단백질 분석 은 다운 스트림 응용 프로그램에 대 한 충분 한 감도 를 제공 합니다.
  2. 앞서 설명한 바와 같이 서쪽 얼룩 분석을 위한 SDS-PAGE 겔상에 시토솔릭 및 핵 분획 둘 다의 20 μg를로드한다. 로딩 시 차선을 건너뛰면 샘플의 특성화가 잘못되지 않습니다.
  3. p84(THOC1)에 대한 서쪽 블롯을 핵 마커로서, GAPDH를 세포질 마커로서 프로브한다. 핵 분획에서 세포분열 마커의 비율에 의한 분획의 정도를 결정하고 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.
    참고: 다른 핵 및 세포질 마커에 대한 항체가 사용될 수 있다.

4. 내인성 핵 미끼 단백질의 면역 침전

참고: 이 시점부터는 낮은 고정 튜브를 사용하는 것이 좋습니다. 이렇게 하면 시료 처리 중에 튜브에 대한 비특이적 결합이 줄어들고 불필요한 시료 손실을 방지할 수 있습니다. 또한 LCMS 등급H2O가 나머지 단계에 대한 버퍼를 준비하는 데 사용되었는지 확인합니다.

  1. 미세 원심 분리튜브에서 단백질 A와 단백질-G 모두에 12.5 μL의 비드 부피를 결합하여 각 복제에 대한 단백질 A/G 비드 혼합물을 준비합니다. 비드 스톡을 20% 에탄올을 함유한 슬러리로 보관합니다. 비드가 팁에 들어갈 수 있도록 팁에 절단된 파이펫 팁을 사용하여 슬러리 %(v/v) 및 피펫 내의 비드 농도를 결정합니다.
  2. 단백질 A/G 비드 혼합물을 300 μL의 IP 버퍼 1로 2x 세척합니다. 구슬을 4 °C에서 1,500 x g에서 1 분 및 데산트 버퍼로 돌이십시다.
  3. 항체 단백질 A/G 구슬을 준비: 비드에 항체를 결합하기 위해, 원하는 항체의 IP 완충액 1 및 10 μg의 300 μL을 추가한다. 비드/항체 혼합물을 밤새 4°C에서 영양분으로 흔들어 주세요. 비드 전용 컨트롤의 경우 항체를 추가하지 마십시오.
    참고: 복제당 총 10 μg의 항체를 출발점으로 사용할 수 있지만, 실험에 사용된 용해물의 각 개별 항체 및 스케일에 대해 정확한 양을 최적화해야 합니다.
  4. 핵을 해동해 수조에서 2.10단계에서 용해시키고 적절한 부피를 낮은 유지성 미세원심지 튜브로 하여 복제당 1 mg의 단백질 입력을 한다.
    1. 용해액을 16,000 x g에서 30 분 동안 돌리고 상급체를 새 튜브로 옮긴다.
    2. 핵 용해물 1 mg당 벤조나아제 1μl(250 단위/μL)을 넣고 4°C에서 10-15분 동안 영양분에 바위를 넣습니다.
  5. 용해를 미리 지우기 위한 구슬을 준비합니다. 4.1단계에서와 같이 각 단백질 A 및 단백질 G 비드의 12.5 μL을 1.5 mL 저유지관에 첨가합니다. IP 워시 버퍼 1 + PI로 2x를 세척하고 버퍼를 데낸다.
  6. 4.5단계에서 1 mg의 핵 을 구슬에 추가합니다. 4 °C에서 1 시간 동안 영양분에 흔들면서 배양하십시오.
    1. 원심분리기는 1분 동안 1,500 x g 및 4°C에서 용해됩니다.
    2. 핵 용해제가 4.5.1 단계에서 구슬로 인큐베이팅되는 동안, 항체 단백질 A/G 비드를 IP 버퍼 1 + PI로 2x 로 세척합니다. 1,500 x g 및 4°C에서 1분 동안 원심분리기를 하고 완충제를 데천한다.
  7. 미리 제거된 핵 용해액을 단계 4.6.1에서 항체 단백질 A/G 구슬로 옮긴다. 4°C에서 4°C에서 너티터상에서 흔들면서 인큐베이션을 4시간 동안 원심분리기를 1,500 x g 및 4°C에서 1분 동안 배양하였다.
  8. 각 복제에 대한 흐름으로 표시된 튜브로 상급체를 전달합니다.
  9. 1 mL의 IP 버퍼 2 + PI로 항체 단백질 A / G 구슬을 씻으십시오. 1,500 x g 및 4 °C에서 1 분 동안 원심 분리기를, 데산트 버퍼, 총 3 회 동안 반복하십시오.
  10. 이전 단계에서와 같이 1 mL의 IP 버퍼 1+ PIs 원심분리로 구슬을 2x 세척하십시오. 마지막 세척 후 모든 버퍼를 제거해야 합니다.
  11. 각각 30분 동안 0.1 M 글리신(pH 2.75)의 20 μL로 2x를 루트합니다. 용출 버퍼로 인큐베이션 중에 튜브가 흔들리고 있는지 확인합니다. 750 x g 및 4°C에서 1분 동안 스핀하고 각 30분 배양 후 상피제에서 피펫을 떼어낸다.
    참고: 여기에 기술된 낮은 pH 글리신 방법은 대부분의 미끼 단백질을 용성하는 반면, 일부 항체-항원 상호 작용은 더 엄격한 완충 조건을 필요로 합니다.
  12. 플래시 동결은 액체 질소에서 용활활화하고 -80 °C에서 저장합니다.

5. 견본 준비

참고: 인슐린은 면역 침전 용출 샘플로 급증하여 트리클로로아세트산(TCA) 침전 및 시료 처리 중에 단백질 회수에 도움을 주며, 이는 낮은 풍부도 내인성 미끼 단백질에 중요합니다.

  1. 냉동된 경우 실온에서 용루를 해동합니다.
    1. 샘플을 얼음 위에 놓고 용출수제 100 μL마다 1.0 mg/mL 의 인슐린 10 μL을 추가합니다. 소용돌이 를 즉시 10 μL의 1% 나트륨 데옥시콜레이트에 추가한다. 샘플을 다시 소용돌이시키고 20% TCA의 30 μL을 추가한 다음 1개의 최종 소용돌이가 뒤따랐다.
    2. 샘플을 얼음에 20분 동안 배양한 다음 4°C에서 21,000 x g에서 30분 동안 원심분리기를 합니다.
    3. 상급을 흡인하고 -20 °C로 미리 냉각 된 아세톤의 0.5 mL을 추가합니다. 소용돌이를 21,000 x g 및 4 °C에서 30 분 동안 회전시다.
    4. 상급자를 흡인하고 튜브의 바닥에 남아있는 펠릿을 건조시다.
  2. 14아래에설명된 바와 같이 샘플 처리를 줄이는 데 최적화된 수정된 필터 보조 샘플 준비(FASP) 방법을 사용하여 질량 분석용 샘플을 준비합니다.
    1. SDS 알킬화 완충제의 30 μL로 5.1.4 단계에서 단백질 펠릿을 다시 중단합니다(표 1참조). 샘플을 95°C 열 블록에서 5분 동안 배양합니다. 다음 단계로 가기 전에 실온에서 15 분 동안 식힙니다.
    2. 각 샘플에 300 μL의 UA 용액과 100 mM TCEP의 30 μL을 추가합니다. 이 솔루션을 30k 원심 필터에 로드합니다. 원심 필터를 실온에서 21,000 x g에서 10 분 동안 돌이꿉지.
      참고 : 미끼 단백질과 그 putative 인터액터는이 시점에서 필터에 바인딩해야합니다. 그러나, 필터에 문제가 있는 경우를 따라 흐르는 흐름이 유지될 수 있다.
    3. 필터를 UA 250 μL과 원심분리기로 10분 동안 21,000 x g으로 세척하고 총 3배 반복합니다.
    4. 100 mM Tris pH 8.5의 100 μL로 필터를 세척하고 원심 분리기를 21,000 x g에서 10 분 동안 씻어 내고 흐름을 3 배 반복합니다.
    5. 0.1 M Tris pH 8.5에서 다시 매달린 1 μg/μL 의 3 μL을 추가합니다. 100 μL 마크까지 필터를 채우고 영양가에 흔들면서 37 °C에서 1 시간 동안 소화 할 수 있습니다.
    6. 1 μL 의 1 μL / μL MS 등급 트립신을 추가합니다. 부드럽게 혼합하고 영양가에 흔들면서 37 °C에서 밤새 샘플로 배양 트립신을 허용.
    7. 21,000 x g에서 20 분 동안 원심 분리기를 사용하여 필터에서 펩티드를 용해시다.
      참고: 모든 용리수를 회수하려면 여러 차례 원심분리가 필요할 수 있습니다. 이 작업을 수행하지 않으면 심각한 샘플 손실이 발생할 수 있습니다.
  3. C18 스핀 컬럼을 사용하여 펩티드를 탈염시. 제조업체에서 제공하는 프로토콜을 따릅니다.
  4. 7 μL에서 0.1% TFA의 5% 아세토니트릴에서 동포화된 펩티드를 재중단시켰다. 펩티드가 다시 중단되었는지 확인하기 위해 3 분 동안 샘플을 초음파 처리하십시오. 14,000 x g에서 10분 동안 스핀다운합니다.
  5. 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC/MS) 시스템에 로딩하기 위해 재중단된 펩티드를 적절한 샘플 바이알로 옮김을 전달합니다.

6. LC/MS 시스템 적합성

참고: 선호도 정제 시료의 단백질이 적고 일반적으로 풍부하기 때문에 LC/MS 플랫폼이 최대 감도 및 견고성으로 작동하는 것이 중요합니다.

  1. 이월 상 A의 경우 LC/MS 등급 포름산 1L에 LC/MS 등급 포름산 1mL를 추가하고, 이월 상 B의 경우 LC/MS 등급 아세토니트릴 1L에 LC/MS 등급 포름산 1mL을 추가합니다.
  2. 75 μm 융합 실리카 모세관 컬럼을 준비하거나 설치하여 <2 μm 역상 C18 수지(길이 ≥250 mm)로 포장합니다. 최상의 결과는 컬럼에 샘플을 직접 주입하여 결과를 낳을 것입니다.
  3. 신선한 이면단계로 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC) 시스템을 제거합니다. C18 컬럼을 설치하여 적합한 방사체(즉, 20 μm id x 360 μm od가 10 μm 팁으로 당겨진 경우)로 안정적인 유속 및 전기 스프레이를 설정합니다. 컬럼을 40-60°C로 유지합니다.
  4. HeLa 전체 세포 의 100-200ng와 같은 복잡한 품질 관리 표준을 주입하여 전체 LC/MS 시스템 성능을 테스트합니다. 복잡한 샘플에 적합한 구배를 가진 용루(즉, 2−3 h 그라데이션 용출 시간). 펩티드 및 단백질 식별의 기준선 시스템 성능을 확립한다.
    참고: 최상의 결과를 얻으려면 20,000-35,000개의 고유한 펩타이드에서 3,000-5,000개 이상의 단백질 식별을 통해 실험 샘플에 대한 최적의 성능을 제공합니다.
  5. 일상적인 LC/MS 시스템 적합성을 위해 소 혈청 알부민(BSA)과 같은 단일 단백질 다이제스트 표준의 100-200 fmol 이하를 주입하십시오. 짧은 그라데이션(즉, 20-30분)으로 용신하십시오.
    참고: 단백질 다이제스트를 여러 번 주사하면 기준 LC/MS 시스템 성능을 확립하는 데 도움이 되며, 각 IP-MS 샘플이 실험 전반에 걸쳐 시스템 성능을 측정하고 라벨없는 실험을 편향시킬 수 있는 기기 드리프트를 검출할 수 있습니다. 선택한 개별 피크 강도 및 피크 셰이프의 기준선은 MS, LC 및 열 성능에 대해 알려줍니다.
  6. 분석 컬럼에 과부하가 걸리지 않도록 실험 샘플의 작은 부분(전체의 15−30%)을 컬럼에 로드하고 복잡한 샘플에 적합한 그라데이션(즉, 2−3시간)을 사용하여 분리합니다. 단백질 식별 수가 만족스럽지 않은 경우 모든 샘플을 컬럼에 로드합니다.
  7. 샘플 사이에 단일 단백질 다이제스트 표준을 실행하여 LC/MS 시스템 성능 및 샘플 이월을 모니터링합니다. 시료에 따라 시료 이월을 줄이기 위해 여러 표준이 필요할 수 있습니다.

7. 데이터 처리

  1. https://www.maxquant.org/ 있는 프로테오믹스 소프트웨어 패키지를 다운로드하십시오.
    참고: 이는 6.6단계에서 RAW MS 데이터 파일을 다운스트림 분석을 위해 이들의 식별과 관련된 단백질 ID, 유전자 이름 및 정량적 값의 데이터 테이블로 처리하는 데 사용됩니다.
    1. Raw Data 탭의 입력 데이터 하위 헤더 내에서 로드를 선택합니다. MS 원시 파일이 저장되는 파일 위치를 열고 각 MS/MS 실행에 대해 원시 파일을 선택합니다.
    2. 그룹별 탭을 클릭하고 소화를 선택합니다. 효소 목록 내에서 LysC를 선택하고 오른쪽 화살표를 클릭하여 검색에 사용될 목록에이 효소를 추가합니다. 그런 다음 악기를 선택하고 화면 상단의 드롭다운 목록에 올바른 계측기 유형이 나타나는지 확인합니다. 표준 설정에 다른 그룹별 검색 매개 변수를 둡니다.
    3. 전역 매개 변수 탭을 클릭하고 시퀀스를 선택합니다. 이 검색에 사용할 분류에 적합한 FASTA 파일을 추가합니다. 펩티드가 제대로 할당되지 않으면 이 작업이 수행되지 않습니다. 인간의 프로테오메의 경우, https://www.uniprot.org/help/human_proteome UniProt에서 FASTA 파일을 다운로드하십시오.
    4. 글로벌 매개 변수 탭에서 단백질 정량화를클릭합니다. 정량화 드롭다운 메뉴에 대한 펩타이드 내에서 고유 + 면도기선택.
      참고: MaxQuant는 강도 기반 절대 정량화(iBAQ) 및 라벨 없는 정량화(LFQ)를 통해 대체 단백질 정량화를 제공합니다. 그러나, 펩티드 카운트 정보는 이프로토콜(15)에서다운스트림 분석을 위해 충분하다.
    5. MaxQuant 인터페이스의 왼쪽 하단에서 검색에 사용할 프로세서 수를 선택합니다. 이는 실행에 필요한 시간 의 길이에 직접적인 영향을 미치므로 가능한 한 많이 선택하십시오.) 화면 왼쪽 하단에서 시작을 클릭하여 실행을 시작합니다. 검색 진행 률을 보려면 화면 상단의 성능 탭을 선택합니다.
  2. 실행이 완료되면, 페르세우스에서 proteingroups.txt 파일을 엽니 다, 단백질 학 계산 플랫폼, 또는 데이터를 볼 수있는 다른 스프레드 시트 프로그램16.
    1. Perseus를 사용하여 일반적인 오염 물질을 제거하고 단백질 서열을 반전시락시피합니다. http://www.coxdocs.org/doku.php?id=perseus:user:use_cases:interactions 자세한 페르세우스 문서를 따르십시오.
      참고: 분석 소프트웨어(예: Excel)에서 proteingroups.txt 파일을 열면 특정 유전자 및 단백질 이름이 자동으로 손상됩니다.
  3. 선호도 정화를 위한 오염 물질 저장소(CRAPome)를 사용하여 실험 데이터를 분석합니다. 이 저장소 http://crapome.org/ 계정을 등록하고 필요에 따라 자습서를따르십시오17,18.
    1. CRAPome 홈페이지에 있는 데이터 분석 워크플로를 사용합니다. 본 상호 작용 실험에 사용된 친화성 정제 시스템에 해당하는 외부 컨트롤을 선택합니다.
      참고: 이러한 컨트롤은 일반적인 오염 물질을 검출하는 데 유용한 두 번째 배 변화 보강을 계산하는 데 사용할 수 있습니다.
    2. Perseus 또는 적합한 스프레드시트 응용 프로그램을 사용하여 MaxQuant의 proteingroups.txt 출력에서 입력 파일을 생성합니다. 수동 서식에 대한 자세한 내용은 http://crapome.org/?q=fileformatting 확인할 수 있습니다. 또는 제공된 R 스크립트 "export_CRAPomeSAINT_Input_File.R"을 사용하여 SAINT/CRAPome 입력 파일을 생성합니다. 추가 코딩 파일에서README.txt를 참조하십시오.
    3. 면역 침전에서 각 미끼 단백질에 대한 접지 변화 농축 및 SAINT (INTeractome의 유의성 분석) 확률을 결정하기 위해 분석을 실행합니다. FC-A, 'CRAPome 컨트롤' 또는 '모든 컨트롤'에서 드롭다운 메뉴에서 '사용자 컨트롤'을선택하여 FC-B 드롭다운에서 선택하고 확률 점수를 선택하여 SAINT 확률을 생성합니다. 실행이 끝나면 작업 ID와 함께 '분석 결과'에서 사용할 수 있는 출력을 봅니다. 향후 플로팅 및 데이터 시각화를 위해 '분석 결과'에서 데이터 매트릭스를 다운로드합니다.
  4. 보조 코딩 파일에제공된 R-스크립트를 따라 FC-A(IP 대 사용자 컨트롤) 및 SAINT 확률의 함수로 단백질을 플롯합니다.
    참고: R 스크립트 세트는 FC-A 대 SAINT 확률 및 iBAQ 대 로그2(단백질 풍부)의 플롯을 생성하기 위해 제공되며, 레이블이 없는 강도의 경험적 Bayes 분석에서 조정된 p 값 범위에 의해 착색됩니다. 차등 통계 분석 및 플로팅의 세부 사항은 README.txt 및 R 스크립트 "main_differential_analysis 에서 찾을 수 있습니다. R"에서 보충 코딩 파일.
  5. 미끼 단백질의 알려진 상호 작용 단백질이 FC-A 및 SAINT에 의해 순위가 매겨진 위치를 평가합니다. FC-A > 3.00 및 SAINT > 0.7의 컷오프를 시작점으로 삼중 미끼 실험에 대해 확인합니다.
    참고: "신뢰도가 높은" 상호 작용자와 "신뢰도가 낮은" 상호 작용자를 위한 컷오프를 선택하려면 생물학적 정보에 의해 통보되어야 합니다.

8. 데이터 시각화

참고 : 프로테오믹스 데이터를 효과적으로 시각화 할 수있는 많은 프로그램이 있습니다 (예 : R, 페르세우스, Cytoscape, STRING-DB). 신뢰도가 높은 조회 와 이러한 상호 작용자의 기능 보강 간의 연결을 분석하는 것은 추가 유효성 검사 및 기능 특성화를 위해 조회의 우선 순위를 지정하는 데 유용한 전략이 될 수 있습니다.

  1. cytoscape를 다운로드, https://cytoscape.org/download.html19에서오픈 소스 네트워크 시각화 도구.
  2. 미끼(소스 노드), 먹이(대상 노드), 상호 작용 유형(에지 유형)의 세 개의 열로 서식이 지정된 탭으로 상호 작용 데이터에 대한 입력 파일을 준비합니다. 이 작업은 페르세우스 또는 선택한 스프레드시트 프로그램에서 수행할 수 있습니다.
  3. 파일에서 테이블 가져오기 아이콘을 프로그램의 왼쪽 위쪽으로 선택합니다(아래쪽 화살표와 아이콘의 행렬로 지정). Cytoscape는 사용자 지정 서식 지정 및 디자인준비가 된 네트워크에 상호 작용 데이터를 자동으로 채웁니다.
  4. Cytoscape의 제어판에서 스타일 탭을 선택하고 Def 열의 사각형을 클릭하여 전체 네트워크에 대한 속성을 조정합니다. 네트워크에서 특정 노드 또는 가장자리를 선택한 다음 스타일 메뉴의 Byp. 열 내의 사각형을 선택하여 기본 설정을 우회하고 선택한 객체만 조정합니다. 또는 스타일 메뉴 상단의 드롭다운 메뉴를 클릭하여 미리 설정된 네트워크 형식을 봅니다.
    참고: STRING-db 단백질 상호작용 데이터는 입력 파일을 통해 또는 Cytoscape, http://apps.cytoscape.org/20에서플러그인으로 이용 가능한 다양한 농축 도구를 통해 수동으로 이 네트워크에 통합될 수 있다. 농축 분석을 위한 권장 시토스케이프 플러그인은 http://apps.cytoscape.org/apps/cluego21일에서 발견된다.
  5. 이 워크플로에서 생성된 데이터 집합에 대한 신뢰도를 높이려면 관심 있는 먹이 단백질을 미끼로 대상으로 하는 상호 IP-MS 또는 IP 서부 실험을 수행합니다.

결과

IP-MS 실험에서 확인된 단백질 질량의 대다수는 비특이성 단백질로 이루어져 있습니다. 따라서, IP-MS 실험의 주요 과제 중 하나는 단백질이 높은 신뢰형 인터랙터 대 비특이적 인터랙터인 해석입니다. 데이터 품질 평가에 사용되는 중요한 파라미터를 입증하기 위해 비드 전용 제어를 이용한 HeLa 핵 추출물 5 mg의 삼중면역침전을 분석하였다. IP-MS 실험이 신뢰할 수 있는지 확인하기 위한 첫 번째 내부 검사는 미끼 단백질이 대조군과 SAINT 확률 모두에 의해 확인된 가장 높은 농축 단백질 중 하나로 평가되는지 여부입니다. 이 경우, 미끼 DYRK1A는 대조군을 통해 상위 3개의 농축 단백질 중 하나로 선정되었다(도2A,B). 4개의 독립적인 항체를 이용한 DYRK1A의 핵 상호 작용 연구에서, >3.00 및 SAINT 확률 컷오프 >0.7의 FC-A 컷오프는 신규 및 이전에 검증된인터랙터(22)의식별을 위한 엄격한 컷오프를 제공했다. 본 실험에 적용하면, 비특이적으로 확인된 고신뢰성 간체와 >95%의 비특이성 단백질 사이에 명확한 분리가 이루어질 수있었다(도 2A,B). 배 변화 농축 및 확률 임계값을 모두 적용하면 생물학적 복제에 걸쳐 일관되게 높은 단백질 ID를 풍부하게 하여 응력성을 증가시킵니다.

통계적 점수 매기기 이외에, CRAPome 분석 워크플로우도 이전에 보고된 상호작용을 미끼-먹이데이터(23)에매핑한다. 이 매핑은 높고 낮은 신뢰도 상호 작용을 임계값화하는 데 유용할 수 있지만, 이전에 보고된 상호 작용은 FC-A 및 SAINT 확률에 의해 저조한 점수를 매길 수 있으며, 잠재적으로 주어진 미끼의 많은 알려진 상호 작용이 특정 세포 유형, 컨텍스트 또는 세포기관에서만 존재할 수 있음을 나타냅니다. DYRK1A 데이터 세트의 경우, iREF 상호작용자 FC-A 값은 0.45로 낮았으며, 제어에 대한 매우 낮은 보강을 나타내고있다(그림 2C). 거짓 긍정의 인플레이션을 방지하려면 통계 적 임계값을 거짓 부정 의 감소보다 엄격성을 우선시하는 방식으로 수행해야 합니다. 이러한 상호작용의 검출은 단백질 풍부도(도2C)와무관하다는 점에 유의해야한다. HeLa 세포 내의 각 iREF 상호작용의 계산된 절대 카피 수는 IP-MS24에의한 상호작용 파트너의 검출 수준과 상관관계가 없음을 나타내고 있다.

Cytoscape상호 작용 데이터19의여러 계층을 시각화하기위한 효과적인 도구 역할을합니다. 여기서 설명된 DYRK1A 면역 침전 실험에서 FC-A > 3.0 및 SAINT > 0.9의 결합 사용은 6개의 단백질로 고신뢰 성간자 목록을 감소시켰습니다(도2D). 그러나 FC-A 컷오프를 적용했을 때 > 3.0을 격리하여, 8개의 단백질을 네트워크에 추가하였습니다. 이 추가 단백질 상호 작용자는 네트워크에 이미 있는 인터랙터와 높은 연결성이 있으며, 이는 유사한 복합체 또는 기능적 역할과 관련이 있음을 시사합니다. 이를 위해, 단백질-단백질 상호작용의 STRING-DB로부터의 증거는 청색파선(20)으로서이 네트워크에 통합되었다. 이 단일 미끼 실험은 전체 DYRK1A 상호 작용 네트워크의 제한된 샘플을 제공하지만, 대규모 공용 데이터 세트의 추가 미끼, 복제 및 통합을 사용하여 신뢰도가 높은 상호 작용의 네트워크를 확장할 수 있습니다. 따라서 통계 적 차단은 각 개별 실험에 특정되며 철저하게 평가되어야합니다.

figure-results-2189
그림 1: 세포외 IP-MS에 대한 대표적인 프로테오믹스 워크플로우. 세포는 4L 둥근 바닥 플라스크 또는 15 cm 조직 배양 접시에서 성장하고 세포 분열을 위해 동시에 수확됩니다. 세포는 세포토졸, 핵 및 핵 펠릿으로 분획되고, 면역 침전은 동일한 미끼를 인식하는 하나 또는 다중 항체를 사용하여 핵 용해의 1-10 mg에서 행해낸다. 필터 보조 시료 준비(FASP) 및 오프라인 샘플 정리는 단일 샷 질량 분석 전에 수행됩니다. 다운스트림 계산 파이프라인은 데이터를 해석 가능한 상호 작용 데이터로 처리하는 데 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2772
도 2: 단일 미끼 단일 항체 IP-MS 실험을 위한 대표적인 데이터. (a)키나아제 DYRK1A(n=3)에 대한 단일 항체를 이용한 최적의 실험을 위한 CRAPome 분석 워크플로우로부터의 FC-A 및 SAINT 확률 출력. 비드 전용 컨트롤은 비교를 위해 사용되었습니다. 빨간색 실선은 FC-A > 3.00 및 SAINT > 0.7에서 설정된 컷오프를 나타냅니다. (B)최대정산 단백질 풍부도 추정치(iBAQ) 출력 대 log2 비율의 단백질 풍부도는 DYRK1A IP에서 조절할 수 있으며, 라벨없는 강도의 경험적 베이즈 분석으로부터 조절된 p 값 범위에 의해 착색된다. (C)FC-A 및 iRef 데이터베이스23,24에서상호 작용 단백질로 열거된 단백질의 추정 카피 수. (D) DYRK1A 인터랙터의 사이토스케이프 네트워크 시각화. 파란색 노드 = FC-A > 3.00, SAINT > 0.7. 주황색 노드 = FC-A > 3.00. IPMS 실험에서 인터액터로 확인된 검정 가장자리 = 단백질. 파란색 파선 가장자리 = 먹이 단백질 사이의 SAINT 상호 작용 (신뢰도 > .150). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

프로테아제 억제제 (PI) 혼합물
시약최종 농도
나트륨 메타비술핏1 mM
벤자미딘1 mM
디티오트레이톨 (DTT)1 mM
페닐메탄설포닐 불소 (PMSF)0.25 mM
인산염 억제제 (PhI) 혼합물
시약최종 농도
마이크로시스틴 LR1 μM
오르토바나데이트 나트륨0.1 mM
불소 나트륨5 mM
세포분획 버퍼:
버퍼 A pH 7.9
시약최종 농도
헤페스 (주)는10 mM
MgCl21.5 mM
KCl10 mM
버퍼 B pH 7.9
시약최종 농도
헤페스 (주)는20 mM
MgCl21.5 mM
Nacl420 mM
에틸렌디아미네테트라아세트산 (EDTA)0.4 mM
글리세롤25% (v/v)
버퍼 C pH 7.9
시약최종 농도
헤페스 (주)는20 mM
MgCl22 mM
KCl100 mM
에틸렌디아미네테트라아세트산 (EDTA)0.4 mM
글리세롤20% (v/v)
면역 침전 버퍼:
IP 버퍼 1
시약최종 농도
헤페스 (주)는20 mM
KCl150 mM
Edta0.1 mM
NP-400.1% (v/v)
글리세롤10% (v/v)
IP 버퍼 2
시약최종 농도
헤페스 (주)는20 mM
KCl500 mM
Edta0.1 mM
NP-400.1% (v/v)
글리세롤10% (v/v)
SDS 알킬레이션 버퍼 pH 8.5
시약최종 농도
Sds4% (v/v)
클로로아세타미드40 mM
TCEP10 mM
Tris100 mM
UA pH 8.5
시약최종 농도
우 레 아8 M
Tris0.1 M
* HPLC 등급 H2O를 사용

표 1: 버퍼 컴포지션

추가 코딩 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

여기에 설명된 프로테오믹스 워크플로우는 관심 있는 단백질에 대한 고신뢰 단백질 인터랙터를 식별하는 효과적인 방법을 제공합니다. 이 접근 방식은 세포외 분획을 통해 시료의 복잡성을 감소시키고 강력한 시료 준비, 오프라인 시료 정리 및 LC-MS 시스템의 엄격한 품질 관리를 통해 식별 상호 작용 파트너를 늘리는 데 중점을 둡니다. 여기에 설명된 다운스트림 데이터 분석은 미끼와 공정화하는 것으로 확인된 단백질의 간단한 통계적 평가를 가능하게 한다. 그러나, 실험 변수 (규모, 세포주, 항체 선택)의 높은 수로 인해, 각 실험은 데이터 시각화 및 농축에 관한 다른 컷오프 및 고려 사항을 필요로한다.

IP-MS 실험에서 첫 번째 디자인 고려 사항은 상호 작용하는 파트너와 함께 관심 있는 단백질의 공정화에 사용될 항체의 선택입니다. 상업적인 항체의 가용성은 지난 수십 년 동안 인간 단백질의 더 큰 부분을 커버하기 위하여 확장되는 동안, 시약이 제한되는 많은 단백질이 아직도 있습니다. 더욱이, 웨스턴 블롯 검출과 같은 응용을 위해 검증된 항체는 면역 침전 실험에서 표적 단백질의 선택적 농축이 불가능할 수 있다. 대규모 상호작용 프로테오믹스 실험을 수행하기 전에, 90% 동률 10 cm 접시, 또는 동등한 세포 수로부터 IP를 완료하고, 서양 블로팅에 의한 관심 있는 표적 단백질에 대한 프로브를 제안하는 것이 좋습니다. 단일 항체이상이 면역침전에 이용가능한 경우, 단백질의 상이한 부분 내에서 에피토프를 인식하는 다중 항체를 선택하는 것이 추가로 제안된다. 미끼 단백질에 대한 항체의 결합은 가설 상호 작용 파트너를 위해 필요한 결합 인터페이스를 폐색할 수 있다. 미끼 단백질에 대한 이차 에피토프의 선택은 질량 분석 기반 실험에 의해 확인된 상호작용 프로파일의 커버리지를 증가시킬 것이다.

두 번째 주요 고려 사항은 미끼와 공정화로 확인 된 것과 낮은 신뢰 또는 비특이적 인 상호 작용에서 높은 신뢰도 상호 작용을 구별하기위한 적절한 제어의 선택에있다. IP-MS 실험에 대한 가장 엄격한 대조군은 미끼의 CRISPR KO 세포주로부터 면역침전을 완료하는 것이다. 이러한 제어는 미끼 단백질보다는 항체에 직접 결합하는 비특이적 단백질을 식별하고 필터링할 수 있게 합니다. 각 미끼 단백질의 CRISPR KO 세포주 생성이 가능하지 않은 경우, 미끼 항체의 동일한 이소타입의 IgG-비드 조절제가 사용될 수 있다. 여러 종을 나타내는 항체 패널을 사용하는 실험에서, 비드 만 제어의 사용은 적절할 수 있지만 높은 신뢰형 인터랙터로 확인된 거짓 긍정의 비율을 증가시킬 것이다.

IP-MS 실험에 사용된 세포주의 선택은 몇 가지 주요 요인에 의존한다. 단백질 발현 및 국소화는 세포 유형에 크게 의존한다. RNA 발현 추정치는 많은 일반적으로 사용되는 세포주에서 대부분의 유전자에 대해 발견될 수 있지만, 단백질 발현은 RNA 발현과 잘 연관되어 있으며 실험적으로25를결정해야 한다. 미끼 단백질이 매우 낮은 카피 수로 발현되는 세포주는 필요할 수 있는 세포 배양 규모의 급격한 증가와 관련된 문제를 회피하는 것을 피해야 한다. 그러나, 샘플 준비는 매우 낮은 풍부 단백질의 검출을 위해 최적화 될 수 있다는 점에 유의해야한다. 필터 보조 시료 준비(FASP) 방법은 견고하면서도 시료에서 펩티드의 50% 이상 손실을 초래할 수 있다. 단일 냄비 고체 상 강화 샘플 준비 (SP3)는 시료 손실26을최소화하는 질량 분석 분석을위한 샘플을 생성하는 효율적인 방법입니다. 샘플 제제의 SP3 방법에 의해 활성화된 증가된 회복은 검출 한계에 가까운 단백질의 정량화를 위한 이 워크플로우에서 유용한 대안이 될 수 있다.

이 프로테오믹스 워크플로우는 키나아제, E3 유비퀴틴 리가제 및 다분체 복합체의 비계 구성원을 포함한 많은 핵 미끼에 적용되었습니다. 항체 시약의 적절한 검증을 가정할 때, 이 워크플로우를 성공적으로 실행하면 관심 있는 단백질에 대한 고신뢰 단백질 핵 상호작용 파트너가 검출될 것입니다.

공개

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 말

이 작품은 다운 증후군린다 크닉 연구소에서 W.M.O.에 그랜드 챌린지 보조금과 DARPA 협력 계약에 의해 지원되었다 13-34-RTA-FP-007. 제시 컬랜드와 키라 코졸리노가 원고를 읽고 댓글을 남기는 데 기여한 것에 대해 감사드립니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin, 0.1% EDTAThermo Fisher Scientific25200056
1.5 ml low-rention microcentrifuge tubesFisher Scientific02-681-320
4-20% Mini PROTEAN TGX Precast Protein GelsBio-Rad4561096
acetone (HPLC)Thermo Fisher ScientificA949SK-4
Amicon Ultra 0.5 ml 30k filter columnMillipore SigmaUFC503096
BenzamidineSigma-Aldrich12072
benzonaseSigma-AldrichE1014
ChloroacetamideSigma-AldrichC0267
Dialysis tubing closureCaroline Biological Supply Company684239
DTTSigma-Aldrich10197777001
EDTASigma-AldrichEDS
GAPDH antibodySanta Cruz BiotechnologySc-47724
GlycerolFisher Scientific887845
GlycineSigma-AldrichG8898
HeLa QC tryptic digestPierce88329
HEPESFisher ScientificAAJ1692630
insulinThermo Fisher Scientific12585014
iodoacetamideSigma-AldrichI1149
KONTES Dounce homogenizer 7 mlVWRKT885300-0007
Large Clearance pestle 7mlVWRKT885301-0007
Lysyl endopeptidase CVWR125-05061
Magnesium ChlorideSigma-Aldrich208337
Microcystinenzo life sciencesALX-350-012-C100
Nonidet P 40 Substitute solutionSigma-Aldrich98379
p84 antibodyGeneTexGTX70220
Phosphate Buffered Saline
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Fisher Scientific23227
Pierce BSA Protein Digest, MS gradeThermo Fisher Scientific88341LCMS QC
Pierce C18 spin columnsThermo Fisher ScientificPI-89873
Pierce Trypsin Protease, MS GradeThermo Fisher Scientific90057For mass spectrometry sample prep
PMSFSigma-AldrichP7626
Potassium ChlorideSigma-AldrichP9541
Protein A Sepharose CL-4BGE Healthcare Bio-Sciences17-0780-01
Protein G Sepharose 4 Fast FlowGE Healthcare Bio-Sciences17-0618-01
SDSSigma-AldrichL3771
Silica emitter tipPico TIPFS360-20-10
Small Clearance pestle 7mlVWRKT885302-0007
Sodium ChlorideSigma-AldrichS3014
Sodium FluorideSigma-Aldrich201154
Sodium metabisulfiteSigma-Aldrich31448
Sodium orthovanadateSigma-AldrichS6508
Spectra/ Por 8 kDa 24 mm dialysis tubingThomas Scientific3787K17
TC Dish 150, StandardSarstedt83.3903Tissue culture dish for adherent cells
TCASigma-AldrichT9159
TCEPThermo ScientificPG82080
TFAThermo Fisher Scientific28904
Thermo Scientific Orbitrap Fusion MSThermo Fisher Scientific
Trizma BaseSigma-AldrichT6066
UreaThermo Fisher Scientific29700
Waters ACQUITY M-Class UPLCWaters
Waters ACQUITY UPLC M-Class Column Reversed-Phase 1.7µm Spherical Hybrid (1.7 µm, 75 µm x 250 mm)Waters186007484nanoflow C18 column

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