Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מתואר כאן שיטת ליטוגרפיה ננוספירה לייצור מקביל של מגלי גל במצב אפס, שהם מערכים של ננו-פטרטורים במיקרוסקופיה זכוכית מצופה מתכת עבור הדמיית מולקולה בודדת בריכוזים ננו-למיקרומולרים של פלואורופורים. השיטה מנצלת את ההרכבה העצמית של הגביש הקולואידי כדי ליצור תבנית מגיד גל.

Abstract

באנזימולוגיה פלואורסצנטית של מולקולה אחת, פלואורסצנטיות רקע ממצעים מסומנים בתמיסה מגבילה לעתים קרובות את ריכוז הפלורופורים לטווחי פיקו לננומולרים, מספר סדרי גודל פחות מריכוזי ליגנד פיזיולוגיים רבים. ננו-מבנים אופטיים הנקראים מגלי גל במצב אפס (ZMWs), שהם 100−200 ננומטר קוטר צמצמים מפוברקים במתכת מוליכת דקה כגון אלומיניום או זהב, מאפשרים הדמיה של מולקולות בודדות בריכוזים מיקרומולקוליים של פלואורופורים על ידי ההסתה של קטע אור גלוי לנפחים יעילים של זפטוליטר. עם זאת, הצורך בציוד ננו-פיבריות יקר ומתמחה מנע את השימוש הנרחב ב- ZMWs. בדרך כלל, ננו- מבנים כגון ZMWs מתקבלים באמצעות כתיבה ישירה באמצעות ליטוגרפיה של קרן אלקטרונים, שהיא רציפה ואיטית. כאן, קולואידית, או ננוספירה, ליטוגרפיה משמשת כאסטרטגיה חלופית ליצירת מסכות בקנה מידה ננומטר לייצור מדריך גל. דו"ח זה מתאר את הגישה בפירוט, עם שיקולים מעשיים לכל שלב. השיטה מאפשרת אלפי ZMWs אלומיניום או זהב להיעשות במקביל, עם קטרי מדריך גל סופי ומעמקים של 100−200 ננומטר. רק ציוד מעבדה משותף ומאייד תרמי לתצהיר מתכת נדרשים. על ידי הפיכת ZMWs נגיש יותר לקהילה הביוכימית, שיטה זו יכולה להקל על המחקר של תהליכים מולקולריים בריכוזים ובשיעורים הסלולריים.

Introduction

טכניקות של מולקולה אחת כגון העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית של מולקולה בודדת (smFRET) או ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטית של מולקולה אחת (FCS) הן כלים רבי עוצמה לביופיזיקה מולקולרית, המאפשרת לחקור תנועות דינמיות, קונפורמציות ואינטראקציות של ביומולקולות בודדות בתהליכים כגון שעתוק1,2,3, תרגום4,5,6, ורבים אחרים7. עבור smFRET, מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות השתקפות פנימית כוללת (TIRF) היא שיטה נפוצה מכיוון שניתן לעקוב אחר מולקולות קשורות רבות לאורך זמן, והגל האוונסנטי שנוצר על ידי TIR מוגבל לאזור של 100−200 ננומטר הסמוך לכיסוי8. עם זאת, אפילו עם הגבלה זו על נפח עירור, פלואורופורים של עניין עדיין צריך להיות מדולל לטווחי pM או nM על מנת לזהות אותות מולקולה אחת מעל פלואורקנציה ברקע9. מאז קבועי מיכאליס-מאנטן של אנזימים תאיים הם בדרך כלל בטווח μM כדי mM10, תגובות ביוכימיות במחקרים מולקולה אחת הם בדרך כלל הרבה יותר איטי מאשר אלה בתא. לדוגמה, סינתזת חלבונים מתרחשת ב 15−20 חומצות אמינו לשנייה ב E. coli11,12, בעוד רוב ריבוזומים פרוקריוטים בניסויי smFRET לתרגם ב 0.1−1 חומצת אמינו לשנייה13. בסינתזת חלבונים, מבני קריסטל ו- smFRET על ריבוזומים תקועים הראו כי העברת RNAs (tRNAs) משתנה בין מצבים 'היברידיים' ו'קלאסיים ' לפני שלב טרנסלוקיציה tRNA-mRNA14,15. עם זאת, כאשר ריכוזים פיזיולוגיים של גורם GTPase טרנסלוקציה, EF-G, היה נוכח, קונפורמציה שונה, ביניים בין המצבים ההיברידיים והקלאסיים, נצפתה smFRET6. חשוב ללמוד תהליכים מולקולריים דינמיים בקצבים ובריכוזים דומים לאלה שבתא, אך נותר אתגר טכני.

אסטרטגיה להגברת ריכוז המצע הפלואורסצנטי היא שימוש בצמצמי אורך גל תת-גלויים מבוססי מתכת, הנקראים מגלי גל במצב אפס (ZMWs), כדי ליצור שדות עירור מוגבלים שמרגשים באופן סלקטיבי ביומולקולים המותאמים לצמחיםבצמצמים 16 (איור 1). הצמצמים הם בדרך כלל 100−200 ננומטר קוטר ו 100−150 ננומטר בעומק17. מעל אורך גל מנותק הקשור לגודל ולצורה של הבארות (λc ≈ פי 2.3 מהקוטר של מגלי גל עגולים עם מים כמדיוםדיאלקטרי 18), אין מצבי הפצה במנזר הגל, ומכאן המונח מגלי גל במצב אפס. עם זאת, שדה אלקטרומגנטי מתנדנד, המכונה גל אוונסנטי, מתפורר באופן אקספוננציאלי בעוצמה עדיין מנהרות מרחק קצר אל מנגוו הגל18,19. למרות שדומה לגלים האוונסטנטים של TIR, לגלים האוונסטנטים של ZMW יש קבוע ריקבון קצר יותר, וכתוצאה מכך אזור עירור יעיל של 10−30 ננומטר בתוך מרוץ הגל. בריכוזים מיקרומולרים של ליגנדים בעלי תווית פלואורסצנטית, רק מולקולה אחת או כמה נמצאות בו זמנית בתוך אזור העירור. הגבלה זו של נפח העירור וכתוצאה מכך הפחתה של פלואורסצנטיות רקע מאפשרת הדמיית פלואורסצנטיות של מולקולות בודדות בריכוזים רלוונטיים ביולוגית. זה יושם על מערכות רבות20, כולל מדידות FCS של דיפוזיה חלבון יחיד21, מדידות FRET מולקולה אחת של חלבון ליגנדזיקה נמוכה 22 וחלבון-חלבון אינטראקציות23, ומדידות ספקטרו-אלקטרוכימיות של אירועי מחזור מולקולרי יחיד24.

ZMWs יוצרו על ידי דפוס ישיר של שכבת מתכת באמצעות כרסום קרן יון25,26 או ליטוגרפיה קרן אלקטרונים (EBL) ואחריו תחריט פלזמה16,27. שיטות ליטוגרפיה נטולות מסכות אלה יוצרות מגלי גל בסדרה ובדרך כלל דורשות גישה למתקני ננו-פיבריות מיוחדים, ומונעות אימוץ נרחב של טכנולוגיית ZMW. שיטה נוספת, הרמת ליטוגרפיה ננו-הדפסה אולטרה סגולה28, משתמשת בתבנית שקופית קוורץ כדי ללחוץ על תבנית ZMW הפוכה על סרט התנגדות כמו בול. בעוד שיטה זו היא יעילה יותר, זה עדיין דורש EBL לייצור של עובש קוורץ. מאמר זה מציג את הפרוטוקול עבור שיטת ייצור תבנית פשוטה וזולה שאינה דורשת כרסום EBL או קרן יונים ומבוססת על אריזה קרובה של ננוספירות ליצירת מסכה ליטוגרפית.

ננוספירה או ליטוגרפיה "טבעית", שהוצעה לראשונה בשנת 1982 על ידי דקמן ודנסמויר29,30, משתמשת בהרכבה עצמית של חלקיקים קולואידיים חד-דיספרזה, החל מעשרות ננומטרים ועד עשרות מיקרומטרים31, כדי ליצור תבניות לדפוס פני השטח באמצעות תחריט ו / או תצהיר של חומרים. מערכים תקופתיים דו-ממדיים (2D) או תלת-ממדיים (3D) של חלקיקים קולואידיים, המכונים גבישים קולואידיים, מאופיינים בססגוניות בהירה מפיזור ועקיפה32. למרות שנעשה שימוש נרחב פחות מקרן אלקטרונים או פוטוליתוגרפיה, מתודולוגיית מיסוך זו היא פשוטה, בעלות נמוכה, ומצטמצמת בקלות כדי ליצור גדלי תכונות מתחת ל- 100 ננומטר.

מכוון ההרכבה העצמית של חלקיקים קולואידיים קובע את ההצלחה של שימוש בגבישים קולואידיים כמסכות לדפוס פני השטח. אם הגודל והצורה של חלקיקים הם הומוגניים, חלקיקים קולואידיים יכולים להיות מורכבים בקלות עם אריזה משושה, מונע על ידי דלדול אנטרופי33. אידוי מים לאחר ציפוי טיפה הוא מסלול יעיל למשקע חלקיקי הקולואידים, אם כי שיטות אחרות כוללות ציפוימטבל 34, ציפוי ספין35, תצהיר אלקטרופורטי36, ואיחוד בממשק מי אוויר37. הפרוטוקול המוצג להלן מבוסס על שיטת משקעים אידוי, אשר היה הפשוט ביותר ליישם. האינטרסטיקים המשולשים בין חרוזי פוליסטירן ארוזים היטב יוצרים פתחים שבהם ניתן לטלטל מתכת הקרבה, ויוצרים עמדות(איור 2 ואיור משלים 1). חישול קצר של החרוזים לפני שלב זה מתאים את הצורה ואת הקוטר של פוסטים אלה. החרוזים מוסרים, שכבת מתכת סופית מופקדה סביב העמודים, ואז הפוסטים מוסרים. לאחר שני צעדי התצהיר המתכתיים אל ננו-מסכת הננו-מולקולה הקולואידית, הסרת עמדות הביניים ושינוי הכימיה על פני השטח עבור פסיבציה וקשירה, מערכי ZMW מוכנים לשימוש להדמיית מולקולה אחת. אפיון נרחב יותר של המאפיינים האופטיים ZMW לאחר ייצור ניתן למצוא במאמר נלווה38. מלבד מאייד תרמי לתצהיר אדים של המתכות, אין צורך בכלים מיוחדים.

Protocol

הערה: ניתן להשלים את כל השלבים בשטח המעבדה הכללי.

1. ניקוי כיסוי זכוכית

  1. כדי לספק משטח נקי לתצהיר אידוי של חלקיקים קולואידיים, מניחים כיסויי זכוכית בורוסיליקט אופטיים 24 x 30 מ"מ (0.16−0.19 מ"מ) בתוך התוספות המחורצות של צנצנת ויטראז'ים של זכוכית קופלין לניקוי.
    הערה: ודאו שהכיסויים עומדים זקופים ומופרדים היטב כך שכל המשטחים נחשפים בבירור במהלך תהליך הניקוי.
  2. יוצקים מספיק אצטון בצנצנת הכתמים כדי לכסות את כיסויים, מניחים את הכיסוי על, sonicate במשך 10 דקות ב 40 °C (70 °F).
  3. יוצקים את האצטון ושוטפים את הכיסויים על ידי מילוי צנצנת הכתמים ב- H2O מזוקק ושפכים את המים. חזור על הפעולה פעמיים נוספות.
  4. חזור על sonication אצטון (שלבים 1.2 ו 1.3) שוב.
  5. יוצקים מספיק 200 mM KOH בצנצנת כדי לכסות את כיסויים sonicate, מכוסה, במשך 20 דקות ב 40 °C (70 °F).
    הערה: KOH מעט etches הזכוכית.
  6. יש לשטוף את כיסויי המכסים עם Hמזוקק 2O 6 פעמים.
  7. מוסיפים אתנול כדי לכסות את כיסויים, להוסיף את המכסה, sonicate במשך 10 דקות ב 40 °C (50 °F).
  8. יש לשטוף את כיסויי המכסים עם Hמזוקק 2O 3 פעמים.
  9. מרימים כל כיסוי בקצה בעזרת מלקחיים עדינים ומייבשים את הכיסויים בגז N2. גע רק בשולי כיסוי. מניחים כל אחד מהכיסויים המיובשים והמנקים בצלחת פטרי נקייה אישית.

2. תצהיר אידוי של חרוזי פוליסטירן

  1. כדי ליצור את מסכת הגביש הקולואידי עבור מערך ZMW, צנטריפוגה 50 μL של 1 מיקרומטר קוטר, חרוזי פוליסטירן לא פונקציונלי (2.5% w / v במים) ב 15,000 x גרם, 25 °C (5 דקות).
    הערה: לפני צנרת החרוזים, פתרון המלאי צריך להיות מערבולת לזמן קצר במקרה החרוזים התיישבו לתחתית הבקבוק.
  2. להשליך את supernatant, משאיר מעט מים שנותרו ככל האפשר.
    הערה: מים שיורית יכול לשנות את תכונות האידוי של resuspension אתנול39, כך הסרת כמות קטנה של חרוזים על מנת להסיר את כל המים מקובל.
  3. Resuspend החרוזים מן השלב 2.2 ב 50 μL של 1:400 TritonX-100:ממס אתנול. פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים לערבב ביסודיות את החרוזים עם הממס.
    הערה: TritonX-100:ממס אתנול צריך להיות חתום עם סרט פרפין לאחר השימוש ומוכן טרי פעם בחודש. החרוזים נוטים לדבוק בצדדים של כלי פלסטיק, כגון צינור microcentrifuge, כך pipette לאורך הצדדים כדי להבטיח כי כל החרוזים הם resuspended.
  4. כדי להקים תא לחות לתצהיר, מניחים 6 מנות פטרי, כל אחת עם כיסוי אחד, על ספסל בשורה עם מכסים שנותרו מעט פתוחים. בכל מנה, מעבירים את הכיסויים לאזור הפתוח כך שהכיסויים חשופים לסביבה כאשר הלחות מוגברת בשלב הבא.
  5. מניחים הייגרומטר ומאוורר חשמלי קטן שבמרכזו מנות הפטרי.
  6. הקלט את הלחות היחסית ההתחלתית (RH) במעבדה. מלא 200 מל עם 150 −200 מל של ~ 75 מעלות צלזיוס מים ומניחים אותו מאחורי המאוורר.
  7. הפעל את המאוורר וכסה את מנות הפטרי, המאוורר, הכיס והיגרומטר במיכל אחסון פלסטיק הפוך ושקוף (66 ס"מ על 46 ס"מ על 38 ס"מ).
  8. תן RH בחדר לעלות ל 70−75%, אשר בדרך כלל לוקח 5−10 דקות.
    הערה: אם RH מעבדת הסביבה נמוכה (מתחת ~ 50%), תן לתא להגיע RH גבוה יותר, אבל לא גבוה מ 80%, כדי לפצות על אובדן לחות במהלך התצהיר (ראה להלן).
  9. כאשר RH מגיע 70−75%, להקליט את RH ולהרים את מיכל אחסון פלסטיק מעט כדי למקם במהירות כיסויים על מנות פטרי, אשר מונע הרטבה יתר של כיסויים.
    הערה: הטמפרטורה בחדר יהיה מעט חם יותר מטמפרטורת החדר, בדרך כלל 25−26 °C (70 °F), כתוצאה של לחות. אם הלחות נראית על כיסויים, אז משטחי הזכוכית רטובים מדי. תא כפפות מסחרי עשוי לפשט חלק זה של הפרוטוקול.
  10. תן RH בחדר להמשיך לעלות ל 85%. בשלב זה, להקליט את RH בתא הלחות ואת pipette 5 μL של השעיית חרוזים למרכז כל כיסוי.
  11. סגור את התא ואת מנות פטרי לאחר כל תצהיר כדי למזער את אובדן הלחות. שואפים לסיים את כל 6 התצהירים תוך 2 דקות.
  12. להקליט את RH בחדר לאחר התצהיר.
    הערה: RH לאחר התצהיר יעזור לאמוד כמה מהר הלחות אבדה במהלך התצהיר, אשר תלוי בתנאי מעבדת הסביבה. עבור ריצה מוצלחת טיפוסית, התא יתחיל ב 85% RH לפני התצהיר ויסתיים ב 70−75% RH לאחר התצהיר.
  13. נותנים לטיפות החרוזים להתפשט ולייבש במשך 5 דקות.
    הערה: אם גבישים קולואידיים יש חורים רבים או אזורים רב שכבתיים, אז התא היה ככל הנראה לח מדי או יבש, בהתאמה. התאם את הלחות היחסית שבה יש לסגור את מנות הפטרי ולהתחיל בתצהירים (עיין בסעיף התוצאות לדיון נוסף באופטימיזציה).

3. חישול חרוזים להפחתת גודל הנקבבובית בתבנית הגביש הקולואידי

  1. כדי לספק משטח טמפרטורה אחיד לחידה של חרוזי פוליסטירן, אשר מצמצם את interstices בין חרוזים ועיגול פינות interstices, מניח צלחת אלומיניום שטוחה, טחון על גבי צלחת חמה קרמית סטנדרטית.
  2. הגדר את הטמפרטורה של הצלחת החמה ל 107 °C (50 °F), טמפרטורת המעבר זכוכית של פוליסטירן40.
    הערה: כדי להשיג טמפרטורה יציבה ומדויקת, בדיקה thermocouple הוחזקה 2−3 מ"מ רוחב ו 4−5 מ"מ עמוק חור בצלחת האלומיניום.
  3. מניחים כיסוי המכיל את תבנית החרוזים על צלחת האלומיניום החמה ואת ה- 20 s (ראו סעיף הדיון להסבר על זמן ההיתוך).
  4. לאחר החימום, להסיר את כיסוי מצלחת האלומיניום ומיד למקם אותו על משטח אלומיניום טמפרטורת חדר אחר כדי לקרר אותו.
    הערה: זה מועיל גם יש כיסויים לתלות מעט מעל קצה הצלחת או ערוצים רדודים טחנה (ראה את הווידאו הנלווה) לתוך הצלחת כדי להקל על איסוף כיסויים.

4. ננו-פייברציה של מגלי גל במצב אפס מאלומיניום באמצעות תבנית הגביש הקולואידי

  1. באמצעות תצהיר אידוי תרמי או קרן אלקטרונים, הפקד 300 ננומטר של נחושת ב 2 Å / s מעל תבנית הגביש הקולואידי כדי ליצור עמדות בין החרוזים.
  2. הסר מתכת עודפת על גבי החרוזים על ידי לחיצה עדינה על פני השטח עם סרט הדבקה. לאט לאט לקלף את הקלטת כדי למשוך את המתכת.
    הערה: כמה כתמים קטנים של מתכת עודפת רפלקטיבית עשויים להישאר לאחר משיכת הסרט, ואלה לעתים קרובות ניתן להסיר על ידי זרם של גז N2. אם כתמים משמעותיים של מתכת עודפת רפלקטיבית נשארים לאחר משיכת הסרט, נסה להשרות את התבניות ב toluene במשך 2 שעות כדי להמיס חלקית את חרוזי פוליסטירן. לשטוף את כיסויים עם מים מזוקקים, יבש עם N2, ולחזור על משיכת הסרט. השריה הנוספת לא אמורה להמיס לחלוטין את החרוזים, שכן החרוזים עוזרים להגן על העמודים מפני נזק במהלך משיכת הקלטת.
  3. כדי להמיס את חרוזי הפוליסטירן, מניחים את תבניות החרוזים בטבלאן ומשרים למשך הלילה.
    זהירות: אדי טולואן עלולים להיות רעילים. עבוד עם טולואן מתחת למכסה המנוע מאוורר היטב ולבש ציוד מגן אישי, כולל כפפות, משקפי בטיחות וחלוק מעבדה. טולואן צריך להיות מאוחסן בארונות מאווררים המיועדים לנוזלים דליקים.
  4. לאחר הדגירה טולואן, לשטוף את התבניות פעם אחת עם כלורופורם ופעמיים עם אתנול. הידית מכסה את ההתמודדויות בזהירות בשלב זה מכיוון שפוסטי המתכת העדינים בגובה 200−300 ננומטר נחשפים כעת. לייבש את התבניות עם N2 ולהסיר פולימר שיורית ומזהמים במנקה פלזמה חמצן במשך 30 דקות.
    זהירות: אדי כלורופורם עלולים להיות רעילים. עבוד עם כלורופורם מתחת למכסה המנוע מאוורר היטב ולבש ציוד מגן אישי, כולל כפפות, משקפי בטיחות וחלוק מעבדה. כלורופורם צריך להיות מאוחסן בארונות מאווררים הרחק ממיסים דליקים אחרים.
  5. באמצעות תצהיר אידוי תרמי או קרן אלקטרונים, הפקדה 3 ננומטר של שכבת הידבקות טיטניום ב 1 Å / s ואחריו 100−150 ננומטר של אלומיניום ב 4 Å / s סביב ועל גבי עמודי הנחושת.
    הערה: ניתן להשתמש בחיפוי עבה יותר כדי להשיג מדריכים עמוקים יותר והנחתה טובה יותר של פלואורסצנטיות רקע, אך זה גם מקטין את התשואה לאחר חשיפת וממיס את הפוסטים בשלב הבא (עיין בסעיף הדיון).
  6. כדי להמיס את עמודי המתכת, להשרות את כיסויי הנחושת תחריט (על בסיס חומצת לימון; רשימת חומרים) במשך 2 שעות.
    זהירות: תחריט מתכת יכול לגרום לכוויות בעור. לעבוד עם תחריטים תחת מכסה המנוע מאוורר היטב ללבוש ציוד מגן. יש לשטוף ידיים ביסודיות לאחר הטיפול. יש לאחסן את תחריט המתכת בארונות מאווררים המיועדים לנוזלים מאכלים.
  7. לשטוף את כיסויים עם מים מזוקקים, יבש עם N2, בעדינות להבריק את פני השטח של חיפוי המתכת עם נייר עדשה לחשוף את כל העמודים שעדיין מכוסים בחיפוי. מניחים את כיסויי הגב לחריט נחושת עוד 2 שעות, ואז לשטוף שוב עם מים מזוקקים ויבש עם N2.
    הערה: שקופיות ZMW צריך להיות מאוחסן במנות פטרי מכוסות ונקיות כדי לשמור אותם ללא מזהמים.

5. ננו-פיבריות של זהב מצב אפס מגלי גל באמצעות תבנית הגביש הקולואידי

הערה: השיטה לייצור ZMWs זהב(איור משלים 1),המשקף את הפרוטוקול לייצור ZMWs אלומיניום, מסופקת בסעיף זה.

  1. באמצעות תצהיר אידוי קרן תרמית או אלקטרונים, הפקדה 3 ננומטר של שכבת הידבקות טיטניום ב 1 Å / s ואחריו 300 ננומטר של אלומיניום ב 4 Å / s.
  2. הסר מתכת עודפת על גבי החרוזים על ידי לחיצה עדינה על פני השטח עם סרט הדבקה. לאט לאט לקלף את הקלטת כדי למשוך את המתכת.
  3. כדי להמיס את חרוזי הפוליסטירן, מניחים את תבניות החרוזים בטבלאן ומשרים למשך הלילה.
  4. לאחר הדגירה טולואן, לשטוף את התבניות פעם אחת עם כלורופורם ופעמיים עם אתנול. לייבש את התבניות עם N2 ולהסיר מזהמי פולימר שיורית במנקה פלזמה חמצן במשך 30 דקות.
  5. באמצעות תצהיר אידוי קרן תרמית או אלקטרונים, הפקד 100−150 ננומטר של זהב ב 5 Å / s סביב ועל גבי עמודי האלומיניום.
  6. כדי להמיס את עמודי המתכת, להשרות את כיסויים תחריט אלומיניום (מבוסס חומצה זרחתית; רשימת חומרים) במשך שעה.
  7. לשטוף את כיסויים עם מים מזוקקים, יבש עם N2, בעדינות להבריק את פני השטח של חיפוי המתכת עם נייר עדשה לחשוף את כל העמודים שעדיין מכוסים בחיפוי. מניחים את כיסויי הגב בתחריט אלומיניום למשך שעה אחת, ואז שוטפים שוב במים מזוקקים ויבשים עם N2.
    הערה: שקופיות ZMW יש לאחסן במנות פטרי מכוסות ונקיות.

תוצאות

ההרכבה העצמית של חלקיקי הקולואידים הפוליסטירן באמצעות משקעים אידויים (שלבים 2.1−2.13) יכולה לייצר מגוון תוצאות שכן היא דורשת שליטה על קצב אידוי הממס. עם זאת, מכיוון שהתצהירים מהירים (10−15 דקות לסיבוב), ניתן אופטימיזציה מהירה של ההליך לתנאי מעבדת סביבה שונים. איור 3A מציג תבנית ?...

Discussion

עבור ההרכבה העצמית הקולואידית (פרוטוקול סעיף 2), השימוש באתנול ולא במים כמו ממס ההשעיה מאיץ את תהליך האידוי כך שהתבניות מוכנות תוך 2−3 דקות לאחר התצהיר ולא 1−2 שעות כמו בשיטות קודמות48,49. פרוטוקול משקעים אידוי המוצג כאן הוא גם פשוט יותר מאשר פרוטוקולי משקעים ק?...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH R01GM080376, R35GM118139, ומרכז NSF להנדסה MechanoBiology CMMI: 15-48571 ל- Y.E.G., ועל ידי מלגת NIAID טרום דוקטורט NRSA F30AI114187 ל R.M.J.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1. Glass Coverslip Cleaning
AcetoneSigma322011 L
Coplin glass staining jarFisher Scientific08-817Staining jar with 8 grooves and molded glass cover
CoverslipsVWR48404-46724 mm x 30 mm (No.1½, Rectangular)
EthanolSigmaE70231 L
KOHSigma30603Potassium hydroxide
Petri dishesFisher ScientificR80115TS100 mm diameter, 15 mm deep
SonicatorBransonZ245143Tabletop ultrasonic cleaner, 5510
2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads
Clear storage containerFisher Scientific50-110-822226 x 18 x 15 in.
Desk fanO2CoolFD05001AAny small desk (~5 in.) fan will work
Glass beakerFisher Scientific02-555-25B250 mL
Humidity meterFisher Scientific11-661-19
Microcentrifuge tubesFisher Scientific21-402-9031.5 mL
Polystyrene microspheresPolysciences18602-151.00 µm diameter, non-functionalized
Triton X-100 deturgentSigmaX100100 mL
3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template
Aluminum plateFisher ScientificAA11062RYCustomized in-house to 14 cm x 14 cm
Ceramic hotplateFisher ScientificHP8885710013 x 8.2 x 3.8 in.
Temperature controllerMcMaster-Carr38615K71Read temperature with thermocouple probe
Thermocouple probeMcMaster-Carr9251T93Type K, surface probe
4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template
Aluminum etchantTranseneType A
Aluminum pelletsKurt J. LeskerEVMAL40QXHBFor electron beam evaporation
ChloroformSigma2883061 L
Copper etchantTransene49-1
Copper pelletsKurt J. LeskerEVMCU40QXQAFor electron beam evaporation
Gold pelletsKurt J. LeskerEVMAUXX40GFor electron beam evaporation
Lens paperThorlabsMC-5
Plasma cleanerHarrick PlasmaPDC-32G
Scotch tapeStaplesMMM119
Thin film deposition systemKurt J. LeskerPVD-75Tabletop thermal evaporation system will also work
Titanium pelletsKurt J. LeskerEVMTI45QXQAFor electron beam evaporation
TolueneSigma2445111 L
Representative Results
COMSOL Multiphysics Modeling SoftwareCOMSOL, Inc.
Dual View spectral splitterPhotometrics, Inc.

References

  1. Kapanidis, A. N., et al. Initial transcription by RNA polymerase proceeds through a DNA-scrunching mechanism. Science. 314 (5802), 1144-1147 (2006).
  2. Santoso, Y., et al. Conformational transitions in DNA polymerase I revealed by single-molecule FRET. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (2), 715-720 (2010).
  3. Herbert, K. M., Greenleaf, W. J., Block, S. M. Single-molecule studies of RNA polymerase: motoring along. Annual Review of Biochemistry. 77, 149-176 (2008).
  4. Chen, C., et al. Dynamics of translation by single ribosomes through mRNA secondary structures. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (5), 582-588 (2013).
  5. Chen, C., et al. Single-molecule fluorescence measurements of ribosomal translocation dynamics. Molecular Cell. 42 (3), 367-377 (2011).
  6. Jamiolkowski, R. M., Chen, C., Cooperman, B. S., Goldman, Y. E. tRNA Fluctuations Observed on Stalled Ribosomes Are Suppressed during Ongoing Protein Synthesis. Biophysical Journal. 113 (11), 2326-2335 (2017).
  7. Myong, S., Stevens, B. C., Ha, T. Bridging Conformational Dynamics and Function Using Single-Molecule Spectroscopy. Structure. 14 (4), 633-643 (2006).
  8. Martin-Fernandez, M. L., Tynan, C. J., Webb, S. E. A 'pocket guide' to total internal reflection fluorescence. Journal of Microscopy. 252 (1), 16-22 (2013).
  9. Holzmeister, P., Acuna, G. P., Grohmann, D., Tinnefeld, P. Breaking the concentration limit of optical single-molecule detection. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1014-1028 (2014).
  10. Scheer, M., et al. BRENDA, the enzyme information system in 2011. Nucleic Acids Research. 39, 670-676 (2011).
  11. Kudva, R., et al. Protein translocation across the inner membrane of Gram-negative bacteria: the Sec and Tat dependent protein transport pathways. Research in Microbiology. 164 (6), 505-534 (2013).
  12. Talkad, V., Schneider, E., Kennell, D. Evidence for variable rates of ribosome movement in Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 104 (1), 299-303 (1976).
  13. Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
  14. Dunkle, J. A., et al. Structures of the bacterial ribosome in classical and hybrid states of tRNA binding. Science. 332 (6032), 981-984 (2011).
  15. Kim, H. D., Puglisi, J. D., Chu, S. Fluctuations of transfer RNAs between classical and hybrid states. Biophysical Journal. 93 (10), 3575-3582 (2007).
  16. Levene, M. J., et al. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations. Science. 299 (5607), 682-686 (2003).
  17. Zhu, P., Craighead, H. G. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis. Annual Review of Biophysics. 41, 269-293 (2012).
  18. Pollack, G. L., Stump, D. R. . Electromagnetism. , (2002).
  19. Jackson, J. D. . Classical electrodynamics. Third edition. , (1999).
  20. Crouch, G. M., Han, D., Bohn, P. W. Zero-mode waveguide nanophotonic structures for single molecule characterization. Journal of Physics D: Applied Physics. 51 (19), 193001 (2018).
  21. Wenger, J., et al. Dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy in a single nanoaperture: towards rapid multicomponent screening at high concentrations. Optics Express. 14 (25), 12206-12216 (2006).
  22. Goldschen-Ohm, M. P., et al. Structure and dynamics underlying elementary ligand binding events in human pacemaking channels. eLife. 5, 20797 (2016).
  23. Miyake, T., et al. Real-Time Imaging of Single-Molecule Fluorescence with a Zero-Mode Waveguide for the Analysis of Protein-Protein Interaction. Analytical Chemistry. 80 (15), 6018-6022 (2008).
  24. Zhao, J., Branagan, S. P., Bohn, P. W. Single-Molecule Enzyme Dynamics of Monomeric Sarcosine Oxidase in a Gold-Based Zero-Mode Waveguide. Applied Spectroscopy. 66 (2), 163-169 (2012).
  25. Fore, S., Yuen, Y., Hesselink, L., Huser, T. Pulsed-interleaved excitation FRET measurements on single duplex DNA molecules inside C-shaped nanoapertures. Nano Letters. 7 (6), 1749-1756 (2007).
  26. Rigneault, H., et al. Enhancement of single-molecule fluorescence detection in subwavelength apertures. Physical Review Letters. 95 (11), 117401 (2005).
  27. Foquet, M., et al. Improved fabrication of zero-mode waveguides for single-molecule detection. Journal of Applied Physics. 103 (3), 034301 (2008).
  28. Wada, J., et al. Fabrication of Zero-Mode Waveguide by Ultraviolet Nanoimprint Lithography Lift-Off Process. Japanese Journal of Applied Physics. 50 (6), 06 (2011).
  29. Fischer, U. C., Zingsheim, H. P. Submicroscopic pattern replication with visible light. Journal of Vacuum Science and Technology. 19 (4), 881-885 (1981).
  30. Deckman, H. W., Dunsmuir, J. H. Natural lithography. Applied Physics Letters. 41 (4), 377-379 (1982).
  31. Li, B., Zhou, D., Han, Y. Assembly and phase transitions of colloidal crystals. Nature Reviews Materials. 1 (2), 15011 (2016).
  32. Bohn, J. J., Tikhonov, A., Asher, S. A. Colloidal crystal growth monitored by Bragg diffraction interference fringes. Journal of Colloid and Interface Science. 350 (2), 381-386 (2010).
  33. Dimitrov, A. S., Nagayama, K. Continuous Convective Assembling of Fine Particles into Two-Dimensional Arrays on Solid Surfaces. Langmuir. 12 (5), 1303-1311 (1996).
  34. Pisco, M., et al. Nanosphere lithography for optical fiber tip nanoprobes. Light: Science & Applications. 6 (5), 16229 (2017).
  35. Chandramohan, A., et al. Model for large-area monolayer coverage of polystyrene nanospheres by spin coating. Scientific Reports. 7, 40888 (2017).
  36. Besra, L., Liu, M. A review on fundamentals and applications of electrophoretic deposition (EPD). Progress in Materials Science. 52 (1), 1-61 (2007).
  37. Yu, J., et al. Preparation of High-Quality Colloidal Mask for Nanosphere Lithography by a Combination of Air/Water Interface Self-Assembly and Solvent Vapor Annealing. Langmuir. 28 (34), 12681-12689 (2012).
  38. Jamiolkowski, R. M., et al. Nanoaperture fabrication via colloidal lithography for single molecule fluorescence analysis. PLoS ONE. 14 (10), 0222964 (2019).
  39. Innocenzi, P., et al. Evaporation of Ethanol and Ethanol-Water Mixtures Studied by Time-Resolved Infrared Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry A. 112 (29), 6512-6516 (2008).
  40. Rieger, J. The glass transition temperature of polystyrene. Journal of Thermal Analysis. 46 (3), 965-972 (1996).
  41. Donev, A., Torquato, S., Stillinger, F. H., Connelly, R. Jamming in hard sphere and disk packings. Journal of Applied Physics. 95 (3), 989-999 (2004).
  42. Kinz-Thompson, C. D., et al. Robustly Passivated, Gold Nanoaperture Arrays for Single-Molecule Fluorescence Microscopy. ACS Nano. 7 (9), 8158-8166 (2013).
  43. Korlach, J., et al. Selective aluminum passivation for targeted immobilization of single DNA polymerase molecules in zero-mode waveguide nanostructures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (4), 1176-1181 (2008).
  44. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
  45. Plénat, T., Yoshizawa, S., Fourmy, D. DNA-Guided Delivery of Single Molecules into Zero-Mode Waveguides. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (36), 30561-30566 (2017).
  46. Kudalkar, E. M., Davis, T. N., Asbury, C. L. Single-Molecule Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Cold Spring Harbor protocols. 2016 (5), 077800 (2016).
  47. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  48. Hoogenboom, J. P., Derks, D., Vergeer, P., Blaaderen, A. v. Stacking faults in colloidal crystals grown by sedimentation. The Journal of Chemical Physics. 117 (24), 11320-11328 (2002).
  49. Micheletto, R., Fukuda, H., Ohtsu, M. A Simple Method for the Production of a Two-Dimensional, Ordered Array of Small Latex Particles. Langmuir. 11 (9), 3333-3336 (1995).
  50. Denkov, N., et al. Mechanism of formation of two-dimensional crystals from latex particles on substrates. Langmuir. 8 (12), 3183-3190 (1992).
  51. Okubo, T. Convectional, sedimentation and drying dissipative patterns of colloidal crystals of poly(methyl methacrylate) spheres on a watch glass. Colloid and Polymer Science. 286 (11), 1307-1315 (2008).
  52. Ye, S., Routzahn, A. L., Carroll, R. L. Fabrication of 3D Metal Dot Arrays by Geometrically Structured Dynamic Shadowing Lithography. Langmuir. 27 (22), 13806-13812 (2011).
  53. Zhao, Y., et al. Dark-Field Illumination on Zero-Mode Waveguide/Microfluidic Hybrid Chip Reveals T4 Replisomal Protein Interactions. Nano Letters. 14 (4), 1952-1960 (2014).
  54. Goldschen-Ohm, M. P., White, D. S., Klenchin, V. A., Chanda, B., Goldsmith, R. H. Observing Single-Molecule Dynamics at Millimolar Concentrations. Angewandte Chemie International Edition. 56 (9), 2399-2402 (2017).
  55. Noriega, T. R., Chen, J., Walter, P., Puglisi, J. D. Real-time observation of signal recognition particle binding to actively translating ribosomes. eLife. 3, 04418 (2014).
  56. Uemura, S., et al. Real-time tRNA transit on single translating ribosomes at codon resolution. Nature. 464 (7291), 1012-1017 (2010).
  57. Choi, J., Puglisi, J. D. Three tRNAs on the ribosome slow translation elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 13691-13696 (2017).
  58. Eid, J., et al. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules. Science. 323 (5910), 133-138 (2009).
  59. Martin, W. E., Srijanto, B. R., Collier, C. P., Vosch, T., Richards, C. I. A Comparison of Single-Molecule Emission in Aluminum and Gold Zero-Mode Waveguides. The Journal of Physical Chemistry A. 120 (34), 6719-6727 (2016).
  60. Wenger, J., et al. Single molecule fluorescence in rectangular nano-apertures. Optics Express. 13 (18), 7035-7044 (2005).
  61. Pineda, A. C., Ronis, D. Fluorescence quenching in molecules near rough metal surfaces. The Journal of Chemical Physics. 83 (10), 5330-5337 (1985).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

159

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved