הקרנה ספקטרופוטומטרית עבור מעכבים פוטנציאליים של גלוטתיון ציטוסולי S-Transferases

גלוטתיון S-transferases (GSTs) הם אנזימים מטבוליים האחראים לחיסול של תרכובות אלקטרופיליות אנדוגניים או אקסוגניים על ידי התייחדות גלוטתיון (GSH). בנוסף, GSTs הם רגולטורים של קינאז חלבון המופעל על ידי מיטוגן (MAPKs) המעורבים במסלולים אפופטוטיים. דיכוי יתר של GSTs הוא בקורלציה עם יעילות טיפולית מופחתת בקרב חולים שעברו כימותרפיה עם חומרים אלקטרופיליים alkylating. שימוש מעכבי GST עשוי להיות פתרון פוטנציאלי כדי להפוך את הנטייה הזאת ועוצמת טיפול מוגבר. השגת מטרה זו דורשת גילוי של תרכובות כאלה, עם גישה מדויקת, מהירה וקלה לאנזים. פרוטוקול ספקטרופוטומטרי באמצעות 1-כלורו-2,4-dinitrobenzene (CDNB) כמו הצוללת היא השיטה המועסקת ביותר בספרות. עם זאת, כבר מתוארים ניסויי עיכוב GST אינם מספקים פרוטוקול המפרט כל שלב של אחסון עיכוב אופטימלי, כגון המדידה של קבוע Michaelis-Menten (K_m) עבור CDNB או אינדיקציה של ריכוז האנזימים המועסקים, פרמטרים קריטיים כדי להעריך את העוצמה העיכוב של תרכובת נבדק. לפיכך, עם פרוטוקול זה, אנו מתארים כל שלב של אסייג אנזים GST ספקטרופוטומטרי אופטימיזציה, כדי לסנן ספריות של מעכבים פוטנציאליים. אנו מסבירים את החישוב של ריכוז מעכב חצי מקסימלי (IC50) ואת הקבוע של עיכוב (K_i) – שני מאפיינים המשמשים כדי למדוד את העוצמה של מעכב אנזים. השיטה המתוארת ניתן ליישם באמצעות מאגר של GSTs שחולצו מתאי או GSTs אנושי רקומביננטי טהור, כל שם GST אלפא 1 (GSTA1), GST mu 1 (GSTM1) או GST pi 1 (GSTP1). עם זאת, אין אפשרות להחיל פרוטוקול זה על תטא GST 1 (GSTT1), מכיוון ש- CDNB אינו מקום עבור isoform זה. שיטה זו שימשה כדי לבדוק את העוצמה העיכוב של כורכומין באמצעות GSTs מכבד סוסים. כורכומין היא מולקולה המציגה תכונות אנטי סרטניות והראתה זיקה כלפי isoforms GST לאחר בתחזיות עגינה silico. הוכחנו כי כורכומין הוא מעכב GST תחרותי חזק, עם IC50 של 31.6 ± 3.6 μM ו K_{i של} 23.2 ± 3.2 μM. כורכומין יש פוטנציאל להיות משולב עם תרופות כימותרפיות אלקטרופיליות כדי לשפר את יעילותה.