Screening spettrofotometrico per potenziali inibitori di Glutathione Cytosolic S-Transferases

Riepilogo

Glutathione S-transferases (GSTs) sono enzimi di disintossicazione coinvolti nel metabolismo di numerosi farmaci chemioterapici. La sovraespressione delle GST è correlata alla resistenza alla chemioterapia del cancro. Un modo per contrastare questo fenotipo è quello di utilizzare inibitori. Questo protocollo descrive un metodo che utilizza un saggio spettrofotometrico per cercare potenziali inibitori della GST.

Abstract

Glutathione S-transferases (GSTs) sono enzimi metabolici responsabili dell'eliminazione di composti elettrofili endogeni o esogeni dalla coniugazione del glutathione (GSH). Inoltre, i GST sono regolatori delle chinasi proteiche (MAPK) attivate da mitogeni coinvolti in percorsi apoptotici. La sovraespressione delle GS È correlata alla diminuzione dell'efficacia terapeutica tra i pazienti sottoposti a chemioterapia con agenti elettrofili alchilanti. L'uso di inibitori GST può essere una potenziale soluzione per invertire questa tendenza e aumentare la potenza di trattamento. Il raggiungimento di questo obiettivo richiede la scoperta di tali composti, con un saggio enzimatico accurato, rapido e facile. Un protocollo spettrofotometrico che utilizza 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) come il substrato è il metodo più impiegato nella letteratura. Tuttavia, gli esperimenti di inibizione GST già descritti non forniscono un protocollo che dettaglia ogni fase di un saggio di inibizione ottimale, come la misurazione della costante Michaelis-Menten (K m )_perCDNB o l'indicazione della concentrazione di enzimi impiegati, parametri cruciali per valutare la potenza di inibizione di un composto testato. Quindi, con questo protocollo, descriviamo ogni fase di un saggio ottimizzato dell'enzima SPECtrofotometrico GST, per screening delle librerie di potenziali inibitori. Spieghiamo il calcolo sia della concentrazione inibitoria semi-massimale (IC50) che della costante_{di inibizione}(K i), due caratteristiche utilizzate per misurare la potenza di un inibitore enzimatico. Il metodo descritto può essere implementato utilizzando un pool di GST estratti da celle o GST umani ricombinanti puri, vale a dire GST alfa 1 (GSTA1), GST mu 1 (GSTM1) o GST pi 1 (GSTP1). Tuttavia, questo protocollo non può essere applicato all'IMPOSTA GST 1 (GSTT1), in quanto LA CDNB non è un substrato per questo isoforme. Questo metodo è stato utilizzato per testare la potenza di inibizione della curcumina utilizzando GST da fegato equino. Curcumina è una molecola che esibisce proprietà anti-cancro e ha mostrato affinità verso isoformi GST dopo in previsioni di attracco silico. Abbiamo dimostrato che la curcumina è un potente inibitore competitivo della GST, con un IC50 di 31,6 ± 3,6 M e un K_i di 23,2 ± 3,2 M. La curcumina ha il potenziale per essere combinata con farmaci chemioterapici elettrofili per migliorarne l'efficacia.

Introduzione

Gli enzimi di glutathione citosolico (GSTs, EC 2.5.1.18) catalizzano la coniugazione del glutathione (GSH) in vari composti elettrofili, come gli agenti chemioterapici, per disintossicarli ed eliminarli facilmente dal corpo¹. Sette isoformi di GST citosolico sono stati identificati come alfa, mu, pi, sigma, omega, theta e zeta. Le GST sono espresse principalmente nel fegato, nei testiti, nei polmoni e nel tratto gastrointestinale². L'isoforme GST alfa 1 (GSTA1) è altamente espresso in epariti. Il corpo esprime eterogeneamente altri sottotipi, tra cui GST pi 1 (GSTP1) prevalentemente nel cervello, cuore e polmoni, e GST mu 1 (GSTM1) nel fegato e teste³. Anche se c'è un'alta sequenza di omologia tra isoformi GST, ognuno presenta specificità del substrato ed è implicato nel metabolismo dei farmaci e nel cancro in modi diversi, secondo la sua espressione differenziale^4,5.

I composti elettrofili entrano nel corpo esogenamente o sono prodotti in modo endogeno. Pesticidi, prostaglandine, cancerogeni e farmaci chemioterapici sono alcuni dei potenziali substrati per le reazioni coniugazione glutathione⁶. Ad esempio, qualsiasi composto reattivo carente di elettroni formato all'interno di una cellula rischia di diventare un substrato elettrofilo. Agenti di alchilating come il cloroambucil o melphalan sono eliminati come coniugati di GSH catalizzato da GSTs, e l'aumento dei livelli di questi enzimi sono stati correlati con la resistenza a questi composti^6,7.

Un altro importante ruolo dei GST citosolici è la regolazione dell'attività delle chinasi proteiche attivate da mitogeni (MAPK) come MAPK8 (noto anche come c-Jun N-terminal kinase, o JNK1) e MAP3K5 (noto anche come chinasi 1 che regola il segnale di apoptosi o ASK1)⁸. Alcune isoformi nella loro conformazione monomeccatica si legheranno a queste proteine e quindi bloccherà la cascata di fosforilazione. In condizioni normali, l'isoforme GSTP1 sequestrerà MAPK8 (l'attivatore della proteina c-Jun). La combinazione del c-Jun con la proteina c-Fos forma il fattore di trascrizione della proteina attivatore 1 (AP-1), responsabile della trascrizione dei geni pro-apoptotici. Nelle cellule stressate, il complesso formato da GSTP1 e MAPK8 si dissocia, c-Jun viene attivato e i geni che portano all'apoptosi iniziano ad essere espressi⁹. Una maggiore espressione di questo isoforme GST potrebbe quindi bloccare il percorso, portando ad una maggiore vitalità cellulare, più proliferazione cellulare e minore sensibilità cellulare alla chemioterapia. Scenari simili possono verificarsi con i paralogi di GSTP1, ad esempio GSTM1, che interagisce con MAP3K5¹⁰.

I ruoli svolto dai GS Nel metabolismo dei farmaci e nel sequestro dei MAPK hanno portato all'ipotesi che una maggiore espressione dei GST potesse essere un segno di un meccanismo di resistenza tumorale al trattamento chemioterapico^6,11. Ad esempio, GSTP1 è sovraespresso in numerosi tumori e la sua presenza è stata correlata con una prognosi infausta e una maggiore incidenza di ricaduta⁸. Il polimorfismo in questi geni ha anche mostrato tassi differenziali di esposizione ai farmaci e sopravvivenza per i pazienti che presentano varie malattie, rafforzando l'idea che questi enzimi siano cruciali per i meccanismi di resistenza ai farmaci. Ad esempio, gli individui con il genotipo null GSTM1 sono associati a una minore clearance di droga e a una^{migliore sopravvivenza 12,13}. Esistono diversi potenziali mezzi per contrastare questa sovraespressione, come l'uso di analoghi GSH, prodrughe che vengono attivate mediante coniugazione con GST o inibitori gst^{diretti 14,15}.

Tutti questi metodi sono attualmente in fase di studio, e alcuni composti hanno iniziato studi clinici per il loro potenziale utilizzo tra i pazienti. Tuttavia, per quanto ne so, non ci sono composti in uso come inibitori GST in ambienti clinici¹⁵. Infatti, la mancanza di specificità per alcuni isoformi o l'esaurimento della GSH nelle cellule normali, che possono portare a tossicità causate dall'accumulo di specie reattive di ossigeno (ROS) nei sistemi di organi, sono solo alcuni degli inconvenienti che riducono il potenziale degli inibitori GST^14,15. Il rischio che questi composti potrebbero esercitare altri effetti farmacodinamici sul corpo stanno anche limitando il loro utilizzo. L'acido etacrinico, ad esempio, è l'inibitore GST più ampiamente studiato negli ambienti di laboratorio, ma poiché viene utilizzato principalmente come un forte diuretico, questa proprietà ne limita l'uso in combinazione con altri farmaci in ambienti clinici. Curcumina è un altro composto naturale proiettato con successo come un inibitore GST. Questa molecola è un etere polifenolo estratto dalla specie di curcuma longa curcuma. Ha mostrato risultati promettenti come possibile opzione di trattamento contro il cancro inducendo l'apoptosi di vari tipi di linee cellulari tumorali^16,17. Il composto può regolare diversi percorsi cellulari, come la chinasi tirosina^{18 o} il percorso GST. Studi con proteine pure hanno dimostrato la sua potenza di inibizione su GSTA1, GSTM1 e GSTP1^19,20. Tuttavia, sono stati osservati risultati contrastanti nelle cellule tumorali, dove è stata misurata una maggiore attività DI GST intracellulare quando le cellule sono state trattate con la^{curcumina 21}. Pertanto, è importante studiare la concentrazione inibitoria semi-massimale (IC50) e la costante di_inibizione(K i ) di qualsiasi inibitore di GST putativo utilizzando un protocollo chiaramente descritto con controlli adeguati prima di pianificare ulteriori esperimenti cellulari.

Lo screening e il test di potenziali nuovi inibitori della GST sono quindi di notevole interesse clinico e qualsiasi nuovo composto trovato deve essere sicuro ed efficiente per l'uso in combinazione con farmaci elettrofili. Concentrare la ricerca sugli inibitori specifici dell'isoformi potrebbe consentire l'inibizione della GST nei tessuti tumorali che presentano modelli specifici di espressione GST, consentendo così lo sviluppo di una terapia di combinazione efficace. Trovare inibitori con modalità differenziali di inibizione potrebbe anche essere di interesse. Ad esempio, un inibitore competitivo che utilizza GSH come substrato può indurre il suo esaurimento. Questa riduzione della concentrazione di GSH nelle cellule è stato indicato per indurre lo stress ossidativo nei neuroni, che porta all'apoptosi. Un'altra modalità comune di inibizione, l'inibizione non conditiva, non può essere invertita anche se il substrato è presente in alte concentrazioni.

La velocità di attività ezimatica è rappresentata dalla costante Michaelis-Menten (K_m) e dalla velocità massima (V_max), che può essere determinata tracciando un grafico Michaelis-Menten, con la concentrazione del substrato rispetto alla velocità della reazione²³. K_m è la concentrazione di substrato necessaria per occupare metà dei siti attivi ezimatici, il che significa che un alto K_{m rappresentano} meno affinità. V_max rappresenta la velocità massima della reazione, raggiunta quando tutti i siti attivi sono occupati dal substrato. K_m è uguale a metà V_max. Esistono tre modalità di inibizione più comuni: competitiva, non competitiva e non competitiva. In caso di inibizione competitiva, l'inibitore si lega al sito attivo dell'enzima e compete con il substrato. Quindi, V_{max non} cambia dopo l'aggiunta dell'inibitore, ma K_m aumenta, come più substrato è necessario per contrastare l'inibizione. L'inibizione non concompetitiva si verifica solo quando il substrato forma un complesso con l'enzima. In questo caso, poiché il livello di inibizione dipende dalla concentrazione di substrato ed_enzima, V_max e K m diminuiscono quando l'inibitore viene aggiunto alla reazione. L'ultima modalità di inibizione è non competitiva ed è un mix degli altri due modelli di inibizione. L'inibitore può legarsi al sito attivo dell'enzima se l'enzima è legato al suo substrato o meno. Qui V_max diminuisce dopo l'aggiunta dell'inibitore, ma K_m non cambia²⁴.

Un'analisi spettrofotometrica che misurava l'attività GST è stata sviluppata per la prima volta da Habig et al. nel 1974 utilizzando 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) come substrato per la reazione²². La coniugazione tra GSH e CDNB forma GS-DNB, che presenta un'assorbimento di luce massima alla lunghezza d'onda di 340 nm, registrabile con uno spettrofotometro. La maggior parte della tecnica spiegata di seguito è derivata da Habig et al., incluse informazioni sulle migliori impostazioni e importanti punti di ottimizzazione per un saggio inibitorio. La tecnica può essere applicata allo screening dei potenziali inibitori della GST, sia che si tratti di una selezione razionale di farmaci mediante previsioni computazionali o di revisione della letteratura. Viene inoltre discusso come adattare il protocollo alle proteine GST appena sintetizzate o alle isoformi specifiche. Ad esempio, testare la potenza inibitoria delle isoformi GST che presentano un polimorfismo clinicamente rilevante o di polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) potrebbe essere un potenziale uso per questo protocollo, mirando a T PST specifici per i pazienti.

Questo protocollo fornisce un metodo rapido, fattibile ed efficace per lo screening di potenziali inibitori GST in vitro prima di qualsiasi altro studio funzionale. Sono descritti i passaggi necessari per valutare le caratteristiche più comunemente misurate di un inibitore enzimatico: la concentrazione inibitoria 50 (IC50) che è la concentrazione di inibitore necessaria per dimelare l'attività enzimatica; e la costante di inibizione (K_i) che rappresenta la costante di equilibrio della dissociazione tra l'inibitore e l'enzima, caratteristica dell'affinità tra queste due molecole. Questi due valori sono misurati dalla regressione non lineare e utilizzando equazioni specifiche per ogni modalità di inibizione, rispettivamente. Dimostriamo anche la valutazione di questo modello di inibizione, utilizzando trame Michaelis-Menten per determinare il cambiamento di V_{max e} K_{m dopo} l'aggiunta^{dell'inibitore 23,25,26}.

Protocollo

1. Preparazione della soluzione enzimatica GST

NOTA: La procedura per preparare la soluzione enzimatica dipende dal fatto che le unità di attività enzimatica siano note prima del saggio. Un'unità enzimatica è la quantità di enzima necessaria per sintetizzare 1 zmol di prodotto al minuto. L'attività ezimatica è rappresentata in unità/mL o mol/min/mL e dipende dalla diluizione della soluzione ezimatica. L'attività ezimatica specifica è rappresentata in unità/mg o in un'unità/mg e dipende esclusivamente dalla purezza della soluzione. Entrambe queste caratteristiche sono determinate di seguito. Se l'unità ezimatica di un isoforme GST isolato è sconosciuta, si deve stimare di regolare le concentrazioni ezimatiche per ogni reazione e fornire risultati riproducibili.

1. Se l'unità ezimatica dell'IVA utilizzata nel saggio è nota:
   1. Preparare una soluzione di stock fresco dell'enzima GST a 0,1 U/mL in acqua e procedere con il passaggio 2.
      NOTA: Questa soluzione può essere conservata a -20 gradi centigradi in aliquots per diversi mesi o a -80 gradi centigradi per periodi più lunghi, ma il ciclo di congelamento/disgelo deve essere evitato.
2. Se l'unità ezimatica dell'IVA utilizzata nel saggio è sconosciuta:
   1. Quantificare la concentrazione proteica della soluzione enzimatica utilizzando un'analisi proteica dell'acido bicinchoninico (BCA) o qualsiasi altro kit.
   2. Diluire la soluzione proteica fino a una concentrazione proteica finale di 0,02 mg/mL.
   3. Aggiungere 20 L della soluzione enzimatica, 20 L di GSH 25 mM (peso molecolare: 307,32 g/mol) e 150 l di salina tamponata di fosfato di Dulbecco (DPBS) a una piastra di 96 possid. Per il vuoto, aggiungere 20 lL di acqua invece della soluzione enzimatica.
   4. Aggiungere 10 L di CDNB 50 mM (peso molecolare: 202,55 g/mol) a ciascun pozzo.
   5. In un lettore di microplabiofotometrici spettrofotometrico, impostare i parametri per la lettura dei pozzi a 340 nm. Si raccomanda di misurare l'assorbimento ogni minuto per 10 minuti.
   6. Inserire la piastra nel lettore di microplacche e avviare la lettura in base alle impostazioni del punto 1.2.5.
   7. Calcolare la variazione di assorbimento al minuto per i campioni ezimatici e il vuoto.
      NOTA: Verificare che la reazione sia lineare tracciando l'assorbimento sull'asse y e i minuti sull'asse x. Se la reazione non è lineare e raggiunge un altopiano, significa che viene utilizzato tutto il substrato e la reazione è troppo veloce. Così, ridurre la quantità di enzima aggiunto al pozzo diluindo la soluzione di stock di due.
   8. Correggere in bianco le letture di assorbimento dei campioni di prova.
   9. Con l'equazione 1, che rappresenta la legge Birra-Lambert, calcolare la concentrazione di GS-DNB formata (in M) dalla reazione ogni minuto.
      Equazione 1:
      
      dove C è la concentrazione del substrato in M, A_340/min è la variazione di assorbimento al minuto, misurata al punto 1.2.7, ε è il coefficiente di estinzione molare per il coniugato CDNB a 340 nm (0,0096^{0,0096 -1 -1cm )}e l è la lunghezza del percorso di luce nel pozzo (in cm). Per una piastra da 96 gradi riempita con 200 L di soluzione ezimatica, la lunghezza del percorso è di circa 0,55 cm. Questo valore può variare a seconda del modello di piastra e deve essere verificato con il produttore.
   10. Per determinare la quantità di prodotto presente in un pozzo in zmol/min, moltiplicare i risultati trovati utilizzando l'equazione 1 per il volume della soluzione, 2 x 10^-4 L.
   11. Normalizzare l'attività per quantità di proteina utilizzata dividendo i risultati del punto 1.2.9 per 4 x 10^-4 mg. Il risultato è l'attività ezimatica specifica in unità/mg o in unità/mg o in un'unità/min/mg.
       NOTA: Se la diluizione è stata modificata al punto 1.2.6, a causa di una reazione non lineare, regolare la quantità di proteina di conseguenza.
   12. Per trovare l'attività ezimatica, regolare i risultati in base alla concentrazione di proteine in mg/mL moltiplicando la specifica attività ezimatica trovata al punto 1.2.10 per 0,002 mg/mL. Questo darà l'attività ezimatica in unità/ mL o mol/min/mL.
       NOTA: In contrasto con l'attività ezimatica, questa misura non cambierà a seconda della diluizione della soluzione proteica. Stessa nota del punto 1.2.10, ma per la concentrazione di proteine.
   13. Preparare una soluzione di stock dell'enzima GST a 0,1 unità/mL in acqua, quindi procedere con il passaggio 2.
       NOTA: Questa soluzione può essere conservata a -20 gradi centigradi in aliquots per diversi mesi o a -80 gradi centigradi per periodi più lunghi, ma il ciclo di congelamento/disgelo deve essere evitato. Il controllo dell'attività ezimatica è raccomandato se gli esperimenti vengono condotti durante un lungo periodo di tempo in quanto potrebbe verificarsi la degradazione della soluzione proteica.

2. Misurazione della costante Michaelis-Menten dell'isoforme GST per CDNB

NOTA: La procedura è spiegata per un substrato CDNB ma può essere applicata a qualsiasi altro substrato, come GSH. Ogni concentrazione di CDNB ha bisogno di un proprio vuoto, in quanto l'assorbimento a 340 nm aumenterà in base alla concentrazione di CDNB.

1. Preparare sei diverse concentrazioni di CDNB, che vanno da 10 mM a 100 mM, in etanolo 95% (v/v).
2. Preparare la soluzione di analisi, con 10 L di CDNB, 20 L di enzima GST, 20 L di GSH 25 mM e 150 L DPBS. Per il vuoto, invece della soluzione CDNB, aggiungere solo 10 L di etanolo 95%.
3. Preparare uno spazio vuoto per ogni concentrazione di CDNB, con 10 L di CDNB, 20 L di acqua, 20 L di GSH 25 mM e 150 L DPBS.
4. Registrare l'assorbimento a 340 nm ogni minuto per 10 minuti con un lettore di microplasi.
5. Correggere l'assorbimento sottraendo i risultati dal vuoto da quello degli altri pozzi di prova corretti. In base ai valori misurati, calcolare la velocità della reazione utilizzando l'equazione 2.
   Equazione 2:
   
   dove A340/min è il cambiamento di assorbimento per minuto determinato sperimentalmente, V_totale (volume totale) è pari a 0,2 mL,_V enzima (volume di enzima) è 0,02 mL e ε_GS-DNB è il coefficiente di estinzione molare del coniugato GS-DNB a 340 nm (9,6 mM^{-1 -cm).} In un pozzo di 200 l di una piastra di 96 possid .^-1 La velocità può essere rappresentata da zmol/mL/min o mM/min.
6. Tracciare il grafico Michaelis-Menten con la velocità (sull'asse y) rispetto alla concentrazione del substrato (sull'asse x).
7. Definire la velocità massima (V_max) della reazione e la costante Michaelis-Menten (K_m) (cioè la concentrazione del substrato a metà di V_max).
   NOTA: Utilizzando software come GraphPad Prism, la curva cinetica enzimatica può essere montata utilizzando una regressione non lineare per il calcolo dei parametri cinetici enzimatici Michaelis-Menten, come V_max e K_m.
8. Preparare una soluzione di stock CDNB a 20 volte il K_{m calcolato} in etanolo 95% (v/v).

3. Assorbimento del potenziale inibitore GST

NOTA: Questo passaggio viene eseguito per verificare se il potenziale inibitore GST utilizzato nella reazione produce un metabolita che aumenta l'assorbimento alla lunghezza d'onda misurata. In caso contrario, la quantità di inibitore utilizzato avrà un impatto sui risultati e un vuoto specifico deve essere preparato per ogni concentrazione.

1. Diluire l'inibitore alle concentrazioni richieste.
   NOTA: Preparare tre diverse diluizioni, preferibilmente le concentrazioni più basse, medie e più alte testate durante il saggio di inibizione. La concentrazione massima di DMSO nel pozzo deve essere uguale o inferiore all'1% (v/v). Abbiamo testato l'effetto della concentrazione DI DMSO sul saggio nel nostro laboratorio e l'1% non ha modificato in modo significativo l'attività GST.
2. In una piastra da 96 possid . Utilizzare un controllo appropriato, senza inibitore, aggiungendo volumi uguali del solvente utilizzato per i campioni di inibitori.
3. Incubare la reazione per 10 minuti, per iniziare la reazione ezimatica.
   NOTA: Questo passo può essere ottimizzato, testando diversi tempi di incubazione, con il duplice scopo di iniziare la reazione evitando l'esaurimento totale del substrato.
4. Aggiungere 10 L di CDNB a ciascun pozzo per ottenere una concentrazione finale al K_{m trovato} nel punto 2.
5. Agitare la piastra per alcuni secondi.
6. Registrare l'assorbimento a 340 nm ogni minuto per 10 minuti con un lettore di microplasi.
7. Calcolare la variazione di assorbimento al minuto.
8. Verificare il cambiamento di assorbimento rispetto sia alla reazione vuota che alla reazione di controllo negativa senza inibitore.
   1. Se c'è un cambiamento significativo, utilizzare vuoto per ogni concentrazione di inibitore al fine di regolare i risultati.
      NOTA: Questo risultato indica che i costituenti della reazione, senza enzima GST, reagiscono spontaneamente e producono un metabolita che aumenta l'assorbimento a 340 nm. Per correggere questa ulteriore assorbimento, è necessario misurare uno specifico spazio vuoto per ogni concentrazione.
   2. Se non vi è alcun cambiamento significativo nell'assorbimento, utilizzare un vuoto generale, contenente solo il solvente utilizzato per la diluizione dell'inibitore GST, per tutte le concentrazioni.

4. Analisi dell'inibizione della valutazione GST e IC50

1. Preparare nove concentrazioni del potenziale inibitore GST.
   NOTA: Le concentrazioni possono essere adattate in base ai risultati. L'obiettivo è quello di definire gli altipiani inferiore e superiore della curva di regressione non lineare. Vedere la sezione di discussione per ulteriori dettagli su questo passaggio.
2. Preparare la soluzione di analisi diluindo 20 L della soluzione GSH a 25 mM con 148 L di DPBS. Adattare il volume in base al numero di pozzi utilizzati nel saggio.
3. In un piatto chiaro a 96 pote, preparare la reazione ezimatica in un volume finale di 190 L. Si consiglia di utilizzare una pipetta multicanale per questi passaggi.
   1. Per i pozzi di prova, aggiungere 20 L della soluzione enzimatica, 2 L della potenziale soluzione di inibitore GST e 168 L della soluzione di saggio.
   2. Per il controllo, aggiungere 20 L della soluzione enzimatica, 2 L del diluente utilizzato per l'inibitore GST e 168 L della soluzione di saggio.
   3. Per i pozzetti vuoti, aggiungere 20 L di acqua, 2 L del potenziale inibitore GST e 168 L della soluzione di saggio.
      NOTA: se l'inibitore GST assorbe la lunghezza d'onda di 340 nm, deve essere preparato uno spazio vuoto specifico per ogni concentrazione testata.
4. Aggiungere 10 L della soluzione CDNB a 20x K_{m a} ciascun pozzo, incluso lo spazio vuoto. Si consiglia di utilizzare una pipetta multicanale per questo passaggio.
5. Agitare la piastra per alcuni secondi.
6. Misurare l'assorbimento a 340 nm ogni minuto per 10 minuti utilizzando un lettore di microplasi.
7. Correggere l'assorbimento sottraendo i risultati dagli spazi vuoti del test.
8. Normalizzare i risultati dividendo i valori ottenuti utilizzando la soluzione dell'inibitore GST per l'assorbimento al minuto del controllo senza inibitore.
9. Tracciare i grafici di regressione non lineare della concentrazione logaritmica (asse x) dell'inibitore rispetto all'attività GST (asse y) e quindi determinare l'IC50.
   NOTA: GraphPad Prism calcola l'IC50 dai grafici di regressione non lineari prevedendo la concentrazione che mostrerà il 50% dell'attività ezimatica nel controllo. La previsione si basa sugli altipiani inferiore e superiore, così come la curva della pendenza formata dal grafico sigmoide.

5. Valutazione della K_{i e del}tipo di inibizione

1. Preparare quattro diverse concentrazioni di CDNB: tre più alte e una uguale alla K_{m precedentemente} trovata.
2. Preparare tre diverse concentrazioni di inibitori GST, uguali o inferiori all'IC50 precedentemente trovato.
3. Eseguire il saggio di inibizione come descritto nei punti da 4.2 a 4.7.
4. Calcolare la velocità delle reazioni utilizzando l'equazione 2.
5. Tracciare i grafici Michaelis-Menten per ogni concentrazione di inibitori e calcolare il V_max e K_m di ogni reazione.
6. In base ai cambiamenti in V_{max e} K_{m quando} si utilizzano concentrazioni diverse, valutare il modo di inibizione dell'inibitore GST.
   NOTA: questo passaggio viene illustrato in modo più dettagliato nei risultati e nelle sezioni di discussione.
7. In base alla modalità di inibizione, calcolare il K_i.
   NOTA: Nel prisma GraphPad, diverse equazioni verranno utilizzate per calcolare il K_i in base alla natura dell'inibizione. Le equazioni utilizzate si basano sul K m osservato_e V_{max dopo} l'aggiunta dell'inibitore e rispetto alle K m_e V max del_controllo.

Risultati

Costante Michaelis-Menten (K_m)di CDNB con GST da fegato equino
La curcumina è un composto naturale sicuro anche dopo l'ingestione a dosi più elevate²⁷ che ha mostrato le proprietà anticancer¹⁶. La potenza inibitoria di questa molecola è stata dimostrata sui GST ricombinanti^{umani 19,20}. Utilizzando il protocollo descritto, abbiamo valutato l'effetto della curcumina sull'attività GST utilizzando un pool di isoformi GST dal fegato equino. Secondo il fornitore, l'attività specifica di questo mix di proteine è 25 U/mg. Una soluzione di stock di 0,1 U/mL è stata preparata sciogliendo la polvere di linolofilizzato nella quantità appropriata di acqua. Acido ethacrynic è stato utilizzato in parallelo come un controllo positivo come questo composto è l'inibitore GST più ampiamente utilizzato negli studi. I passaggi per l'impostazione di un'analisi dell'attività GST e il test degli inibitori sono descritti nella Figura 1.

Il K_{m deve} essere definito per ogni reazione del substrato enzimatico perché l'utilizzo della concentrazione di substrato equivalente a K_m non garantirebbe alcuna distorsione per quanto riguarda la determinazione della modalità di inibizione²⁸. Per misurare questo parametro, sono state testate sei diverse concentrazioni di CDNB, che vanno da 0,5 mM a 5 mM, utilizzando una concentrazione fissa di 2,5 mM GSH.

Il volume finale della reazione era di 200 L, in una piastra da 96 gradi. Per ogni esperimento è stato utilizzato un vuoto specifico, utilizzando la stessa concentrazione di CDNB del test, perché la coniugazione spontanea di CDNB e GSH potrebbe verificarsi e potrebbe aumentare l'assorbimento. Per tutte le reazioni è stata utilizzata una concentrazione enzimatica finale di 0,01 unità/mL, aggiungendo 20 lL della soluzione di stock alla miscela di test. L'assorbimento a 340 nm è stato registrato ogni minuto per 10 minuti. La velocità (in mM/min) della reazione è stata calcolata utilizzando l'equazione 2. Un grafico Michaelis-Menten è stato tracciato della concentrazione del substrato (mM) rispetto alla velocità (M/min) (Figura 2) e il K_m della reazione è stato calcolato. L'esperimento è stato ripetuto fino a quando almeno tre serie di dati hanno mostrato risultati simili. Il K_{m di} CDNB con GST da fegato equino è stato misurato come 0,26 ± 0,08 mM. Per ogni saggio inibitorio che utilizza questo lotto di TTT è stata utilizzata una concentrazione di 0,2 mM di CDNB.

Nessuna formazione spontanea di un metabolita che assorbito a 340 nm è stata misurata durante gli esperimenti utilizzando la curcumina incubata da sola con GSH e CDNB. Lo stesso vuoto è stato utilizzato per ogni concentrazione di inibitori in ogni esperimento.

Potenza inibitoria della curcumina sulle GST
La potenza inibitoria della curcumina è stata prevista utilizzando una simulazione di attracco in silico con software (ad esempio, AutoDock Vina versione 1.1.2). ^{29 È} stata prevista l'energia vincolante gratuita tra i diversi isoformi GST (vale a dire GSTA1, GSTM1 e GSTP1) e la curcumina (dati non mostrati). Quindi, la costante di inibizione K_i è stata calcolata utilizzando l'equazione 3.

Equazione 3:

dove ∆G è l'energia di legame libera trovata utilizzando l'analisi in silico, R è la costante gassore di 1.987^{cal-K -1}- mol^-1, e T è la temperatura durante l'esperimento, in questo caso in Kelvin (298 K).

Sulla base dei risultati energetici vincolanti gratuiti restituiti dall'AutoDock Vina, la curcumina è un potente inibitore GST di GSTA1, GSTM1 e GSTP1,_{con valori} K i di 78,1 M, 78,1 M e 27,4 M rispettivamente. I primi saggi inibitori sono stati condotti utilizzando queste stime computazionali K_i, e le concentrazioni sono state regolate in base ai risultati, se necessario.

In primo luogo, è stato stimato l'IC50. Questa caratteristica è la concentrazione di inibitore che riduce il tasso di reazione di un enzima del 50%. Dipende quindi dalla concentrazione di enzimi³⁰. Sono state preparate nove concentrazioni finali dell'inibitore, che vanno da 0,39 M a 100 M con ogni concentrazione doppia rispetto a quella precedente. La soluzione di analisi era composta da 20 L di GSH 2,5 mM, 20 L di GST da fegato equino a 0,01 U/mL finale, 2 L della soluzione di curcumina e 148 L di PBS. Il controllo era composto dalla stessa soluzione con il diluente utilizzato per la curcumina. Questa miscela è stata incubata per 15 minuti per iniziare il saggio enzimatico ed evitare la degradazione della curcumina nella soluzione di saggio, poiché questo composto è instabile nelle soluzioni^{tampone 31}. Successivamente, 10 L di soluzione CDNB a 4 mM è stato aggiunto ad ogni pozzo, per una concentrazione finale di 0,2 mM CDNB. L'assorbimento a 340 nm è stato registrato ogni minuto per 10 minuti, per calcolare le variazioni di assorbimento al minuto. Per calcolare l'IC50, ogni campione incubato con curcumina è stato normalizzato al controllo, per dare la percentuale di attività. Questi risultati sono stati analizzati utilizzando il software di plottaggio calcolando la regressione non lineare della concentrazione logaritmica dell'inibitore rispetto all'inibizione. L'IC50 trovato per la curcumina su GST da fegato equino era 31,6 ± 3,6 M (Figura 3A).

Lo stesso esperimento è stato condotto in parallelo utilizzando l'acido ethacrynico come controllo positivo, con concentrazioni che vanno da 0,39 a 100 M, come con la curcumina. L'IC50 è stato rilevato essere 6,6 ± 1,1 M (Figura 3B).

Il passo successivo è stato quello di valutare la modalità di inibizione della curcumina su questi transferases. Sono state testate quattro diverse concentrazioni di curcumina: 0, 7,5, 15 e 30 M, insieme a quattro diverse concentrazioni di CDNB: 0,2, 0,4, 1 e 1,5 mM. Il protocollo era lo stesso dell'esperimento precedente. La velocità di ogni condizione è stata calcolata utilizzando l'equazione 2. È stata tracciata una curva per ogni concentrazione di inibitori, con la velocità (in M/min) rispetto alla concentrazione del substrato (mM) (Figura 3C). I V_max e K_{m sono} stati determinati in base a ogni trama con GraphPad Prism. La modalità di inibizione del potenziale inibitore è stata valutata in base ai cambiamenti in questi due parametri e alle diverse condizioni dei saggi. ^{24 Poiché} V_{max non ha} cambiato in modo significativo tra le condizioni, ma K m_è aumentato con le diverse concentrazioni di inibitori, l'inibizione della curcumina delle GST è competitiva. Questo modello di inibizione si verifica quando l'inibitore compete con il substrato per il sito attivo dell'enzima. Per misurare il K_{i di un} inibitore competitivo, GraphPad utilizza l'equazione 4 e l'equazione 5 come descritto da Copeland et al.³².
Equazione 4:

Equazione 5:

dove K_{m obs è} la costante osservata Michaelis-Menten, K_m è la costante Michaelis-Menten del controllo, [I] è la concentrazione dell'inibitore, K i è la_{costante dell'inibizione,} Y è la velocità e X è la concentrazione del substrato.

I calcoli si basano sugli stessi esperimenti della valutazione della modalità di inibizione. Il K_{i stimato per} l'inibizione della curcumina di GST da fegato equino era 23.2 ± 3.2 M.

Figura 1: diagramma di flusso che descrive i passaggi dei saggi di enzimazione e inibizione GST. I dettagli sulla procedura sono presentati nella sezione del protocollo. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: grafico Michaelis-Menten dell'attività enzimatica GST. Una maggiore concentrazione del substrato CDNB è stata utilizzata con una concentrazione fissa di GSH (2,5 mM) per determinare l'attività GST da un pool di GST dal fegato equino. K_m valore per CDNB è stato determinato come 0,26 ± 0,08 mM secondo la curva del grafico. Ogni punto dati sul grafico rappresenta la media di quattro diverse esecuzioni sperimentali con SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Effetto della curcumina e dell'acido etacrinico sull'attività enzimatica GST. (A-B) L'aggiunta di concentrazioni crescenti di curcumina (A) o di acido ethacrinico di controllo positivo (B), pur mantenendo lo stesso GST (0,01 U/mL), GSH (2,5 mM) e CDNB (0,2 mM) concentrazioni finali sono state utilizzate per calcolare l'IC50 di entrambi i composti per GST da fegato equino con una regressione non lineare. L'IC50 è stato determinato come 31,6 ± 3,6 M per la curcumina e 6,6 ± 1,1 M per l'acido etacrinico. (C) Michaelis-Menten trama di diverse concentrazioni di curcumina, testato contro diverse concentrazioni di substrato CDNB che indica una modalità competitiva di inibizione. Senza inibitore, V_max e K_m sono stati misurati rispettivamente come 132,7 ± 4,6 M e 0,5 ± 0,08 M. Con 30 M di curcumina, V_max e K_m erano 130,4 ± 13,1 M e 1,08 ± 0,39 M. I punti dati in tutti i grafici (A-C) rappresentano i mezzi di tre diverse esecuzioni sperimentali con SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Discussione

Forniamo un protocollo che descrive ogni fase di un saggio spectrofotometrico dell'enzima GST, per lo screening degli inibitori putativi (Figura 1, Tabella 1) e quantificarne la potenza inibitoria. Abbiamo anche sottolineato i criteri più cruciali da considerare per analisi enzimi accurate che forniscono risultati riproducibili. I principali vantaggi del protocollo descritto rispetto ad altri metodi colorimetrici o spettrometria di massa è che questo protocollo è rapido e facile da eseguire e fornire misurazioni quantitative dell'attività GST, nonché la potenza di inibizione delle molecole proiettate.

Vi presentiamo il modo di calcolare i due parametri Più importanti Michaelis-Menten di un inibitore enzimatico: l'IC50 e il K_i. Un potente inibitore eserciterà il più basso K_{i e} IC50, indicando che l'affinità tra l'inibitore e l'enzima^{è alta 30}. Poiché l'IC50 dipende dalla concentrazione degli enzimi e dalle condizioni di analisi³³, può essere difficile utilizzare questo valore per confrontare gli inibitori di esperimenti diversi o ottenuti utilizzando altre condizioni di analisi³⁴. Utilizzando la costante di inibizione_{K i} è un indicatore migliore della potenza inibitoria di composti potenziali. K_{i può} essere utilizzato per confrontare due inibitori con diversi modi di inibizione, in quanto si basa esclusivamente sull'affinità tra l'inibitore e l'enzima. Tuttavia, per avere un'idea chiara della natura dell'inibizione è necessario determinare entrambi i parametri dell'inibitore³⁰. Abbiamo misurato curcumins' IC50 e K_{i come} 31,6 ± 3,6 M e 23,2 ± 3,2 M, rispettivamente, indicando che questo composto è un potente inibitore GST. Questi risultati hanno confermato le previsioni in silico, che stimano_{i valori} di K i tra 27,4 e 78,1 M per diversi isoformi e curcumina gst umana.

Attività enzimatica o tasso di reazione e quantità di enzima
Come detto in precedenza, IC50 dipende dalla concentrazione di enzimi, e condurre un esperimento con un livello sconosciuto di attività enzimatica potrebbe portare a false conclusioni³³. Per controllare altri fattori, che potrebbero ridurre l'attività inibitoria, si dovrebbe considerare e misurare l'attività enzimatica per ogni nuovo lotto di T PST. Ad esempio, la degradazione di un lotto ezimatico, causata da troppi cicli di congelamento/disgelo, potrebbe diminuire l'attività e quindi portare a un IC50 inferiore anche se l'esperimento è stato eseguito nelle stesse condizioni. In altre parole, l'utilizzo di 0,01 unità di enzima non darà gli stessi risultati dell'utilizzo di 1 unità. L'utilizzo di troppi enzimi potrebbe portare ad un rapido esaurimento del substrato e la reazione non avrà una forma lineare. Questo parametro potrebbe quindi portare a un risultato inesatto, in quanto nessun cambiamento di assorbimento si sarebbe visto dopo un lungo tempo di incubazione.

K_m Valore
Per garantire le migliori condizioni per valutare il tipo di inibizione esibita da un inibitore, la concentrazione del substrato deve essere uguale o inferiore alla costante Michaelis-Menten (K_m). K_m è rappresentato dalla concentrazione di substrato necessaria per occupare metà dei siti attivi sull'enzima²⁸. Ad esempio, una maggiore concentrazione di substrato può contrastare un inibitore competitivo e valutare questo tipo di inibizione sarà difficile in tale ambiente. Così, uno dei passaggi cruciali in questa metodologia è la determinazione del K_{m dell'enzima per} il substrato selezionato (qui CDNB). In alcuni studi, questo valore non è stato determinato e questo potrebbe portare a false conclusioni sul modello di inibizione causato dall'inibitore e, se la modalità di inibizione non è corretta, il K i verrà calcolato in modo errato_{poiché l'equazione} si basa sul modello di inibizione^26,28. Se viene testata un isoforme GST diverso, è obbligatoria una nuova valutazione del valore K_m, in quanto questo valore è univoco per una coppia di enzimi e ligando. Poiché abbiamo usato una concentrazione di CDNB leggermente inferiore al K_m (0,2 mM), che abbiamo definito come 0,26 ± 0,08 mM, la modalità competitiva prevista di inibizione della curcumina sulla GST è stata accuratamente determinata.

IC50
Ottenere una buona curva sigmoiale con cui stimare l'IC50 richiede di trovare sia gli altipiani inferiori che altipiani. L'altopiano inferiore rappresenta le concentrazioni di un inibitore che forniscono la massima attività inibitoria. In alcuni casi, un composto potrebbe non inibire completamente l'enzima, anche ad alte concentrazioni, a causa di problemi tecnici come la solubilità. Tuttavia, strumenti come GraphPad Prism possono adattarsi all'altopiano inferiore in modo abbastanza accurato. L'altopiano superiore è costituito da concentrazioni dell'inibitore, che sono insufficienti per inibire l'enzima, e quindi l'attività è massima. Entrambi questi altipiani sono cruciali per determinare l'IC50 così come le concentrazioni in mezzo, al fine di trovare la pendenza della curva- quindi l'IC50 può essere derivato dalla forma della curva sigmoide³⁵. La curcumina è scarsamente solubile in acqua, quindi la concentrazione massima utilizzata in questo saggio è limitata, per evitare precipitazioni nella soluzione di saggio. Pertanto, sono state utilizzate soluzioni meno concentrate, che non inibiscono completamente l'attività GST. Ciò ha sollevato questioni per la determinazione dell'altopiano inferiore. Per contrastare questo problema, abbiamo previsto i valori inferiori in base al grafico di regressione non lineare, che ha fornito un IC50 di 31,6 ± 3,6 M per la curcumina (Figura 3A). Per l'acido etacrinico, non c'era bisogno di prevedere i valori per l'altopiano inferiore in quanto questo composto è solubile nella soluzione di analisi e l'IC50 è stato misurato a 6,6 ± 1,1 M.

Questo metodo può essere applicato alle isoforme GST più espresse in , vale a dire GSTA1, GSTM1 o GSTP1. Tuttavia, questo protocollo non è adatto a quantificare l'attività dell'isoforme GSTT1, in quanto LA CDNB non è un substrato per questo sottotipo. ^{36, 37 anni} Nel frattempo, il protocollo può essere leggermente modificato per contrastare questo problema. Ad esempio , utilizzando 1,2-epoxy-3-(4'-nitrophenoxy)propane (ENPP) come substrato per GSTT1 e misurare la quantità di coniugato a 360nm invece di 340nm. ^{Il numero 37 del 37}

Le fasi del protocollo possono essere adattate e applicate per testare l'attività GST e il test degli inibitori negli esperimenti di coltura cellulare. La misurazione dell'attività GST sulle cellule trattate con e senza un inibitore GST indicherà se questo composto può essere utilizzato in tale ambiente sperimentale. È particolarmente interessante quando l'inibitore è lipofilo. Per esempio, abbiamo presentato che la curcumina è un potente inibitore GST utilizzando questo protocollo. Tuttavia, la sua applicazione agli studi cellulari può essere limitata, in quanto la molecola è scarsamente solubile in acqua e si degrada rapidamente in media. ³¹ Un altro miglioramento di questo protocollo è possibile per quanto riguarda la specificità non isoforma del substrato CDNB. L'utilizzo di questo protocollo negli studi sulle cellule fornirà solo informazioni sull'attività complessiva dell'IMPOSTA, ma non sull'attività di un sottotipo preciso dell'IVA. L'aggiunta di un substrato specifico dell'isoforme e/o l'utilizzo di isoformi specifici dell'IVA ricombinante consentirà di testare inibitori dell'IVA specifici isoformi.

Per concludere, descriviamo una procedura completa per testare gli inibitori GST che hanno il potenziale per essere utilizzati in combinazione con la chemioterapia elettrofila. Abbiamo sottolineato i passi cruciali di un enzima GST e analisi di inibizione, per testare potenziale molecola interessante e determinare la loro efficienza come inibitore con valori quantitativi, l'IC50_{e il}K i . Questo metodo può essere applicato a qualsiasi composto putativo ed eseguito sulle isoforme GST umane più espresse (GSTA1, GSTM1 e GSTP1), o leggermente adattato per eseguire studi di coltura cellulare con inibitori GST o misurare l'attività di altri interessanti isoformi GST di scelta.

Reagenti	Nome	Concentrazione nella soluzione di saggio	Altro
Substrato	CDNB	Misurato Km (mM)	Diluito nel 95% di etanolo. La concentrazione finale di etanolo deve ≤ 5% (v/v)
Coniugare substrato	Gsh	2,5 mM	Diluito in acqua.
			La concentrazione deve saturare la soluzione.
Buffer	Pbs	-	pH - 7,1
Enzima	Pool di isoformi GST o isoformi puri	0,01 unità/mL, determinato sperimentalmente.	Diluito in acqua.
Inibitore GST	Potenziale composto di scelta	IC50: 3 concentrazioni che inibiscono al massimo, 3 che minimamente inibiscono e 3 in mezzo.	Diluito in DMSO e poi in acqua, per avere una concentrazione finale di DMSO ≤ 1% (v/v)
		Ki: 3 concentrazioni intorno all'IC50.
Parametri
Temperatura ambiente (25 gradi centigradi)
pH - 7,1
DMSO ≤ 1% (v/v)
Etanolo ≤ 5% (v/v)

Tabella 1: Riepilogo dei reagenti e dei parametri da considerare durante un saggio di inibizione dell'IMPOSTA.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB)	Sigma-Aldrich	237329	Substrate used for the GST enzymatic assay
Corning UV-Transparent Microplates	Sigma-Aldrich	CLS3635	Transparent plate to perform the enzymatic assay. When using 200 ul, the pathlength is 0.552 cm for this plate.
Curcumin	Sigma-Aldrich	8511	Used for the results section, to test the inhibition potency of curcumin
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	To prepare the stock of the putative inhibitor
DPBS	Sigma-Aldrich	D8537	Buffer for the enzymatic reaction
Ethanol 95%	Fisher scientific	10542382	To dilute the CDNB
Glutathione S-Transferase from equine liver	Sigma-Aldrich	G6511	Used for the results section, to test the inhibition potency of curcumin
L-glutathione reduced (GSH)	Sigma-Aldrich	G4251	Co-substrate for the GST enzymatic assay
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher	23225	To quantify the amount of protein present in the enzymatic solution
Spectramax iD3	Molecular devices		To do spectrophotometric measurments