מודל מורין של חשיפה עוברית לדלקת אימהית כדי ללמוד את ההשפעות של Chorioamnionitis חריפה על התפתחות מעיים שזה עתה נולד

Summary

פיתחנו מודל של chorioamnionitis כדי לדמות חשיפה עוברית לדלקת אימהית (FEMI) ללא סיבוכים של אורגניזמים חיים כדי לבחון את ההשפעות של FEMI על התפתחות מערכת העיכול של הצאצאים. זה מאפשר מחקר של סיבות מכניות להתפתחות של פגיעה במעיים בעקבות chorioamnionitis.

Abstract

Chorioamnionitis הוא משקע נפוץ של לידה מוקדמת והוא קשור עם רבים של תחלואה של פגות, כולל אנטריוקוליטיס נמק (NEC). עם זאת, קשר מכני בין שני תנאים אלה עדיין לא התגלה. אימצנו מודל מורין של chorioamnionitis מעורבים lipopolysaccharide (LPS)-induced חשיפה עוברית לדלקת אימהית (FEMI). מודל זה של FEMI גורם למפל דלקתי סטרילי אימהי, שליה ועובר, אשר קיים גם במקרים רבים של chorioamnionitis קלינית. למרות שקיימים מודלים המשתמשים בחיידקים חיים ומחקים בצורה מדויקת יותר את הפתופיזיולוגיה של זיהום עולה וכתוצאה מכך chorioamnionitis, שיטות אלה עלולות לגרום להשפעות עקיפות על התפתחות מערכת העיכול הלא בוגרת ועל המיקרוביום המתפתח המשויך. באמצעות פרוטוקול זה, הוכחנו כי תוצאות FEMI הנגרמת על ידי LPS לעלייה תלוית מינון אובדן הריון ולידה מוקדמת, כמו גם שיבוש של התפתחות מעיים נורמלית בצאצאים. יתר על כן, הוכחנו כי FEMI מגביר באופן משמעותי פגיעה במעיים ציטוקינים בסרום בצאצאים, ובו זמנית הפחתת גביע ותאי Paneth, שניהם מספקים שורה ראשונה של חסינות מולדת נגד דלקת מעיים. למרות מודל דומה של FEMI הנגרמת על ידי LPS שימש כדי מודל הקשר בין chorioamnionitis ואת החריגות הבאות של מערכת העצבים המרכזית, למיטב ידיעתנו, פרוטוקול זה הוא הראשון לנסות להבהיר קשר מכני בין chorioamnionitis והפרעות מאוחר יותר בהתפתחות המעי כקשר פוטנציאלי בין chorioamnionitis ו NEC.

Introduction

הקרומים הכוריוניים ממלאים תפקיד אינטגרלי בהריון יונקים. הם כוללים את chorion ו amnion, אשר משרתים פונקציות מרובות. הם מקיפים ומגנים על העובר, מקלים על איתות פרוקרין בין התאים האימהיים והעובריים¹, ויוצרים לולאות משוב מקומיות בתוך הקרומים הכוריוניים, אשר עשויים להיות מעורבים בייזום parturition¹. ההבנה הנוכחית של הממברנות מצביעה על כך שהאמוניון מספק תפקוד מחסום מבני, והכוריון מספק חיץ חיסוני בעיקר כדי להגן על העובר המתפתח ממערכת החיסון האימהית². דלקת של ממברנות אלה ידועה בשם chorioamnionitis. מבחינה היסטורית, האבחנה של chorioamnionitis קליני נעשה בעקבות נוכחות של קדחת אימהית בתוספת אחד או יותר ממצאים קליניים עובריים או אימהיים^3,4. עם זאת, בעוד הגדרה זו שימושית קלינית, חוסר הדיוק שלה עשה מחקר chorioamnionitis מאתגר. בשנת 2015, בניסיון להבהיר את האבחנה, סדנת פאנל מומחים של המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם של יוניס קנדי שרייבר הגדירה את chorioamnionitis כדלקת תוך רחמית, או זיהום, או שניהם (משולש I)³. הבהרה זו חשובה כי בעוד זיהום המושרה מיקרוביאלית היא גורם חשוב של דלקת הרחם / מי השפיר, זה קורה פחות נפוץ מאשר דלקת הרחם / מי השפיר^{סטרילית 5,6,7}. בסך הכל, chorioamnionitis נשאר בעיה משמעותית בריאות הציבור, כפי שהוא נראה 2\u20124% של משלוחים לטווח ו 25 \u201230% של משלוחים פגים^8,9.

Chorioamnionitis יכול להיות השפעות משמעותיות על העובר ניאונט. זה תועד היטב בספרות כי chorioamnionitis קשורה לסיכון מוגבר של רבים של תחלואה של פגות, כולל דיספלסיה ברונכופולמונארית¹⁰, פגיעה חומר לבן מוחי¹¹, דימום תוך חדרי¹², רטינופתיה של קדם בגרות¹³, ושניהם חשד ואישרו אלח דם יילודים תחילת מוקדם^14,15. כפי שאנו מעוניינים במנגנוני פציעה ותיקון של מערכת העיכול בשלה, חשוב לציין כי chorioamnionitis קשורה גם עם התפתחות מאוחרת יותר של enterocolitis נמק (NEC)^15,16. NEC היא מחלה הרסנית במערכת העיכול של פגים שתוצאתה תגובת מארח dysregulated לדלקת נמק מעיים הבאים¹⁷. בכל שנה, NEC משפיע על מעל 4000 תינוקות בארצות הברית, ועד שליש מהתינוקות האלה מתים מהמחלה¹⁸. הפתוגנזה של NEC ככל הנראה כרוכה בשילוב של חוסר בגרות במעיים, dysregulation של המערכת החיסונית בשלה, דלקת מעיים, טרנסלוקציה חיידקית¹⁹, שהגיע לשיאו במסלול משותף סופי של נמק מעיים. חשוב לציין, הופעת NEC מתרחשת לעתים קרובות שבועות לאחר הלידה וחשיפה פוטנציאלית chorioamnionitis, מה שהופך את הקשר המכניסטי בין chorioamnionitis ופיתוח לאחר מכן של NEC לא ברור²⁰. מנגנון פוטנציאלי אחד שבאמצעותו chorioamnionitis עשוי לתרום הפתופיזיולוגיה של NEC היא באמצעות upregulation של המערכת החיסונית האימהית, לאחר מכן לייצר תגובה דלקתית עוברית חזקה אשר עלול לשבש דפוסים התפתחותיים עובריים^{נורמליים 21,22,23}.

דגמי יונקים מרובים של chorioamnionitis קיימים מכרסמים וכבשים^24,25,26^{,27,28,29,30,31,32}. עם זאת, נתונים מעטים קיימים לגבי התפתחות מערכת העיכול מעבר לתקופת היילוד הראשונית לאחר חשיפה עוברית הנגרמת על ידי chorioamnionitis לדלקת אימהית (FEMI). על מנת לחקור את הקשר בין FEMI לבין ההתפתחות הבאה של פגיעה במערכת העיכול הלא בוגרת, התאמנו את מודל ה- FEMI המושרה על ידי Lipopolysaccharide (LPS). Lipopolysaccharides הם מרכיב מרכזי של פני השטח החוץ תאיים על חיידקים שליליים גרם והם ממריץ חזק של המערכת החיסונית המולדת של מינים אוקריוטיים מרובים, כולל בני אדם³³. תוצאות הזרקת LPS אימהית מפל דלקתי סטרילי ללא ההשפעות המבלבלות של חיידקים חיים, וזה מודל מבוסס היטב עבור אינדוקציה של לידה מוקדמת³⁴, כמו גם מודל של chorioamnionitis חריפה ותסמונת התגובה הדלקתית העוברית (FIRS), שהיא הצורה החמורה ביותר של chorioamnionitis^24,35. זה גם הוכח לגרום הן פגיעה חומר לבן ואפור מוחי בדגם כבשים³⁶ ומודל מורין^37,38,39,40. עם זאת, למיטב ידיעתנו, אנו הראשונים להשתמש במודל זה של chorioamnionitis ו FEMI כדי לחקור את השפעותיו על התפתחות מערכת העיכול בעבר הלידה, כמו גם לחקור קשר מכני אפשרי בין chorioamnionitis ופיתוח מאוחר יותר של NEC^41,42.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת איווה (פרוטוקול #8041401). כל בעלי החיים שוכנו באגודה להערכה והסמכה של מעבדה לטיפול בבעלי חיים (AALAC) אישר vivarium באוניברסיטת איווה. כל העכברים היו סוג פראי זן C57Bl/6J.

1. הקמת FEMI בעכברים בהריון

1. הכנת LPS
   1. השתמש LPS נגזר Escherichia קולי O55:B5 (ריכוז מלאי 2 מ"ג / מ"ל).
   2. לדלל את ריכוז מלאי LPS 1:100 עם מלוחים סטריליים עבור ריכוז עבודה של 20 מיקרוגרם / מ"ל.
2. הזרקת LPS אימהית
   1. להזריק סכרים בהריון ביום ההריון e15. נקודת זמן זו היא כ 75% דרך ההריון מורין, מה שהופך את המודל הזה מבחינה התפתחותית דומה השליש השלישי המוקדם של הריונות אנושיים, וזה כאשר רוב לידות פגים עקב chorioamnionitis להתרחש.
   2. לשקול עכברים בהריון מיד לפני ההזרקה כדי לקבוע מנון LPS המתאים.
   3. לחשב את המינון של ריכוז עבודה באמצעות הנוסחה הבאה: 5 μL x משקל גוף גרם (gbw), עבור מנה כוללת של LPS של 100 מיקרוגרם / קילוגרם. עבור חיות בקרה, השתמש בנפח שווה ערך של מלוחים רגילים להזרקה.
   4. פתרון LPS Vortex שלוש פעמים במשך 15 שניות על גבוה לפני כל זריקה.
   5. צייר עוצמת LPS למזרק של 1 מ"ל.
   6. לרסן את העכבר בהריון עם טכניקת קשקוש. להחזיק בתנוחת נסיוב הגב ולבצע את הזריקה.
      1. הכנס 30 מד 8 מ"מ המחט משופע מעל הרבע התחתון הימני של הבטן (כדי למנוע שלפוחית השתן וכלי הבטן) בזווית 30 \u201240°. הכנס על 1/4 כדי 1/2 את אורך המחט.
      2. משוך בחזרה על בוכנה מזרק כדי להבטיח לחץ שלילי לפני הזרקה. המשך עם הזרקה אם קיים לחץ שלילי.
      3. לאחר ההזרקה, לפקח על עכברים במשך כ 30 דקות ולאחר מכן לחזור לכלובים למשך שארית ההריון.

2. משלוח וטיפול בצאצאים, וקציר מעיים

1. לספק גורים בדרך כלל באמצעות משלוח הנרתיק ב e20.
   הערה: לדגם זה יש שיעור אובדן עוברי תלוי מינון שניתן לראות באיור 1 והוא נדון בתוצאות שלהלן.
2. אפשר גורים להישאר עם אמהות ולקבל הזנות libitum המודעה.
3. ביום הקציר, בדרך כלל לאחר יום הלידה 14 (P14), המתת חסד גורים באמצעות נקע בצוואר הרחם בהתאם לפרוטוקולים מוסדיים של ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים.
4. באמצעות מספריים ומלקחיים, לבצע חתך אנכי לאורך קו האמצע של הבטן, דרך העור הצפק, לכל אורך הבטן. מוציאים את המעי הדק מהקיבה אל הסקום עם המספריים ומסירים את המזנטריה במלקחיים.
5. לבודד ולשמור על דיסטלי 1/3 של המעי הדק (נציג סעיף של איליום אנושי), השלכת המעי הדק הפרוקסימלי, cecum, ואת המעי הגס.
6. מחלקים את חלק האילום לשניים באמצעות מספריים.
7. מניחים את החצי הפרוקסימלי בתמיסת ייצוב RNA לכימות RNA מאוחר יותר.
8. מקם את החצי הדיסטלי בפורמלין אגירה ניטרלי 10% להכנת שקופית.

3. ניקוד פציעות מעיים

1. סעיף רקמה מוטבעת פרפין לפרוסות 5 מיקרומטר עבה הרכבה על שקופיות זכוכית.
   
   הערה: אנו שולחים את הדגימות לליבת היסטולוגיה להטמעת פרפין, חתך והרכבה על שקופיות.
2. נקה שקופיות בהתאם לנהלים סטנדרטיים.
3. כתמים עם המטוקסילין ואאוסין על פי נהלים סטנדרטיים.
4. קטעי ציון בסולם של 3 נקודות עבור פגיעה במעיים כפי שתואר קודם לכן^42,43.
   1. באמצעות מיקרוסקופיה קלה, להעריך פגיעה במעיים כללית על ידי שני חוקרים עיוורים נפרדים בסולם של 3 נקודות הערכת שלמות villus והפרדה מן קרום המרתף⁴³ (איור משלים 1). פגיעה במעיים מוערכת בצורה הטובה ביותר בהגדלה של 20x וצמצם מספרי 0.50.
   2. להקצות ציון של 0 כדי לתאר רירית נורמלית.
   3. להקצות ציון של 1 לתאר פציעה קלה הכוללת את הפיתוח של החלל של גרואנהאגן subepithelial, vacuolization או הרמה subepithelial מוגבל לנמינה פרופריה או טיפים של וילי.
   4. להקצות ציון של 2 כדי לתאר פציעה חמורה, המצוין על ידי הרמת אפיתל ו vacuolization גדול ממחצית הווילי, עיוות וילי, או כיב רירית והתפוררות של פרופריה למינה.

4. כימות של פאנת ותאי גביע

1. לאחר deparaffinization, כתמים שקופיות של מקטעי רקמה משלב 2.8 עם כתם כחול /תקופתי Alcian שיף כדי לציין הן גביע תאים Paneth כפי שתואר קודם לכן^44,45 על פי השלבים הבאים.
   הערה: בעוד כתם Alcian כחול / תקופתי חומצה שיף אינו ספציפי או Paneth או תאים גביע, מניסיוננו, חוקרים מנוסים עיוורים יש כימות הסלולר שווה ערך באמצעות כתם זה לעומת נוגדנים ממוקדים הסלולר, עם משמעותית פחות כתמי רקע⁴⁶.
2. Deparaffinize, כתם, ומייבש שקופיות כדלקמן.
   1. שקוע שקופיות בקסילן במשך 10 דקות פעמיים.
      התראה: Xylene יש להשתמש במכסה המנוע אדים.
   2. יש לשטוף עם 100% אט"ו.
   3. שקופיות שקועות ב- 100 % EtOH למשך 3 דקות, ולאחר מכן ב- 90% EtOH למשך 3 דקות, ואחריהן 70% EtOH למשך 3 דקות, ולבסוף שקופיות שקועות ב- 50% EtOH למשך 3 דקות.
   4. לשטוף תחת מי ברז זורמים במשך 5 דקות.
      התראה: כוון את המקטע הרחק מהמים הזורמים כדי למנוע אובדן של דגימת רקמה.
   5. סנן פתרון כתם כחול אלקיאני עם מסנן קפה סטנדרטי.
   6. כתמים מחליקים בכתם כחול אלסי במשך 15 דקות ולאחר מכן לשטוף תחת מי ברז זורמים במשך 2 דקות.
   7. לדלל 1 מ"ג של חומצה תקופתית ב 200 מ"ל של מים מזוקקים כפולים. שקוע שקופיות בפתרון זה במשך 5 דקות. ואז לשטוף תחת מי ברז זורמים במשך 1 דקות.
   8. כתם עם ריאגנט של שיף במשך 10 דקות. לשטוף תחת מי ברז זורמים במשך 5 דקות.
   9. הכתימו את המגלשות בהמטוקסילין במשך דקה אחת ולאחר מכן שטפו תחת מי ברז זורמים במשך 2 דקות.
   10. לטבול אותם אלכוהול חומצה (1 מ"ל של חומצה הידרוכלורית מעורבב 99 מ"ל של 70% EtOH) במשך 1 דקות.
   11. שקועים במי הברז של סקוט (0.1% ריכוז NaHCO₃ במי ברז) במשך דקה ולאחר מכן לשטוף תחת מי ברז זורמים במשך דקה.
   12. לייבש את השקופיות.
       1. טובלים כל שקופית 10 פעמים ב-70% EtOH, ואז טובלים 10 פעמים ב-90% EtOH, ו-10 פעמים ב-100% EtOH.
       2. שקופיות שקועות ב- 100% EtOH למשך 10 דקות, ולאחר מכן שקועות פעמיים בקסילן טרי במשך 3 דקות כל אחת.
   13. מניחים טיפה של מדיה הרכבה על הדגימה ומניחים כיסוי על זה.
3. ספירת תאי גביע
   1. באמצעות מיקרוסקופיה קלה, לספור תאי גביע (איור משלים 2). עבור כל פיסת רקמת מעיים, לספור את מספר תאי הגביע ו 500 תאי אפיתל ויחס תא גביע אקספרס כיחס לכל 100 תאי אפיתל. תאי גביע נספרים בצורה הטובה ביותר בהגדלה פי 20 וצמצם מספרי 0.5.
4. ספירת תאים בחלונית
   1. באמצעות מיקרוסקופיה קלה, לספור תאים Paneth (איור משלים 2). עבור כל פיסת רקמת מעיים, להביע כיחס של תאים Paneth לכל קריפטה מעיים. לספור 100 קריפטות מעיים לכל פיסת רקמת מעיים. התאים החלונית נספרים בצורה הטובה ביותר בהגדלה של 20x-60x ובצמצם מספרי 0.50-1.30.

תוצאות

חשיפה ל-FEMI ביום העוברי 15 מובילה לאובדן הריון תלוי מינון ולשיעור תלוי מינון של לידה מוקדמת (איור 1)⁴². עבור הניסויים, בחרנו להשתמש במינון LPS של 100 מיקרוגרם / קילוגרם כדי למזער את אובדן ההריון ואת פגות (50% אובדן בין פגות ומוות עוברי תוך רחמי) תוך חשיפת העוברים עלבון דל...

Discussion

Chorioamnionitis משפיע 2\u20124% של המונח ו 25\u201230% של משלוחי פגים^8,9. עם זאת, ההשפעה של chorioamnionitis יכול להאריך זמן רב לידת העבר כפי שהוכח יש השפעות משמעותיות על העובר ניאונט^{10,11,12,13,14,...}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% neutral buffered formalin	Sigma	HT501128
Alcian blue stain	Newcomer supply	1003A
C57Bl6/J mice	Jackson Laboratories	664
Ethanol	Decon labs	2701
HCl	Sigma	H1758
Hematoxylin stain	Leica	381562
LPS	Sigma	L2880
NaHCO3	Sigma	S6014
Nikon Eclipse Ni-U Microscope	Nikon	2CE-MQVJ-1
Periodic Acid	ACROS	H5106	CAS# 10450-59-9
RNAlater	Thermofisher	Am7021
Schiff's reagent	Sigma	S5133
Secor Imager 2400	Meso Scale Discovery (MSD)
V-Plex Assay	Meso Scale Discovery (MSD)
Xylene	Sigma	534056