Mikroinjektionsmethode für Anopheles gambiae Embryonen

Zusammenfassung

Mikroinjektionstechniken sind unerlässlich, um exogene Gene in die Genome von Moskitos einzuführen. Dieses Protokoll erklärt eine Methode, die vom James-Labor verwendet wird, um DNA-Konstrukte in Anopheles gambiae-Embryonen zu mikroinjizieren, um transformierte Moskitos zu erzeugen.

Zusammenfassung

Embryo-Mikroinjektionstechniken sind für viele molekulare und genetische Studien von Insektenarten unerlässlich. Sie bieten ein Mittel, um exogene DNA-Fragmente, die für interessante Gene sowie günstige Merkmale kodieren, stabil und vererbbar in die Keimbahn des Insekts einzuführen. Die resultierenden transgenen Stämme können auf phänotypische Veränderungen untersucht werden, die sich aus der Expression der integrierten DNA ergeben, um grundlegende Fragen zu beantworten oder in praktischen Anwendungen verwendet zu werden. Obwohl die Technologie unkompliziert ist, erfordert sie vom Ermittler Geduld und Übung, um ein Maß an Fähigkeiten zu erreichen, das die Effizienz maximiert. Hier ist eine Methode zur Mikroinjektion von Embryonen der afrikanischen Malariamücke, Anopheles gambiae, gezeigt. Ziel ist es, durch Mikroinjektion exogene DNA an den Embryo abzugeben, so dass sie in den sich entwickelnden Keimbahnzellen (Polzellen) aufgenommen werden kann. Die Expression von Transposasen, Integrasen, Rekombinasen oder anderen Nukleasen (z. B. CRISPR-assoziierte Proteine, Cas) aus der injizierten DNA kann Ereignisse auslösen, die zu ihrer kovalenten Insertion in Chromosomen führen. Transgene An. gambiae, die aus diesen Technologien erzeugt werden, wurden für grundlegende Studien von Komponenten des Immunsystems, Genen, die an der Bluternährung beteiligt sind, und Elementen des olfaktorischen Systems verwendet. Darüber hinaus wurden diese Techniken verwendet, um An. gambiae-Stämme mit Merkmalen herzustellen, die dazu beitragen können, die Übertragung von Malariaparasiten zu kontrollieren.

Einleitung

Mikroinjektionstechniken werden seit den frühen 1900er Jahren verwendet, um Organismen experimentell zu manipulieren¹. Die Mikroinjektion wurde verwendet, um sowohl grundlegende biologische Funktionen zu untersuchen als auch / oder wichtige Veränderungen in der Biologie eines gewünschten Organismus einzuführen. Die Mikroinjektionstechnik war für Vektorbiologen von besonderem Interesse und wurde häufig zur Manipulation von Vektorgenomen^2-11eingesetzt. Transgenese-Experimente an Arthropodenvektoren zielen oft darauf ab, Vektoren bei der Übertragung von Krankheitserregern weniger effizient zu machen, indem sie entweder Änderungen vornehmen, die die Fitness eines Vektors verringern, oder die Refraktivität gegenüber den von ihnen übertragenen Krankheitserregern erhöhen. Mücken übertragen eine Vielzahl von menschlichen Krankheitserregern und haben weltweit einen erheblichen Einfluss auf Morbidität und Mortalität. Die Anopheles-Mückengattung überträgt die parasitären Erreger Plasmodium spp. Gentechnische Experimente mit Anopheles zielten darauf ab, die Biologie besser zu verstehen und die vektorielle Kapazität dieser Moskitos zu reduzieren, um neuartige Strategien zur Eliminierung von Malaria zu entwickeln.

Die Mückenvektoren, die weltweit die meisten Malariainfektionen verursachen, befinden sich im Anopheles gambiae-Artenkomplex. Die meisten erfolgreichen Transgenese-Experimente wurden jedoch am Malaria-Vektor des indischen Subkontinents, Anopheles stephensi,durchgeführt. Während es viele laborangepasste Anopheles gambiae-Stämme gibt, ist die Anzahl der transgenen Anopheles gambiae spp.-Linien, die in der Literatur berichtet werden, nicht mit der von Anopheles stephensivergleichbar. Es wird angenommen, dass der Embryo von Anopheles gambiae schwieriger zu injizieren und eine erfolgreiche Transgenese zu erreichen ist als Anopheles stephensi, obwohl die Gründe für diese Unterschiede unbekannt sind. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, die sich bei der Transgenese von Anopheles gambiae-Embryonen durch Mikroinjektion als durchgängig erfolgreich erwiesen hat. Das Protokoll basiert auf einer Methode, die zuvor von Hervé Bossin und Mark Benedict¹² entwickelt wurde, wobei einige zusätzliche Details und Änderungen hinzugefügt wurden, die die Effizienz der Transgenese erhöhen.

Protokoll

1. Moskitos für die Mikroinjektion vorbereiten

1. Säen Sie einen^{Käfig 13} (~ 5000 cm³⁾mit ~ 100 männlichen und 200-300 weiblichen 1-2 Tage erwachsenen Mücken nach der Eklosion und lassen Sie sie sich für 2 Tage paaren.
2. Nach der Paarungszeit stellen Sie den Moskitos eine Blutmahlzeit mit entweder 2 ml Blut mit einem künstlichen Fütterungsgerät oder lebenden betäubten Tieren zur Verfügung, abhängig von den Insektationspraktiken¹⁴. Am nächsten Tag stellen Sie moskitos eine zweite Blutmahlzeit zur Verfügung, um sicherzustellen, dass alle verpaarten Weibchen die Möglichkeit hatten, sich zu ernähren und dass teilweise gefütterte Moskitos vollständig verstopft sind.
3. Verwenden Sie die Moskitos für die Embryonenentnahme 2-4 Tage nach der zweiten Blutmahlzeit.
   HINWEIS: Die Larvenernährung ist wichtig für die Robustheit und reproduktive Fitness von Erwachsenen. Siehe Benedict et al. (2020) für Informationen darüber, wie man gesunde Insekten aufzieht¹⁴. Es wurden keine signifikanten Unterschiede in der Eiablage beobachtet, wenn Moskitos mit einem künstlichen Futter gefüttert werden oder lebende anästhesierte Tiere leben. Verwenden Sie die Methode, die routinemäßig für Anopheles gambiae im Insektarium verwendet wird.

2. Embryonalisierung

1. Verwenden Sie einen Sauger, um 20-30 Weibchen in ein transparentes konisches 50-ml-Rohr zu legen, das (mit einer Bandsäge) geschnitten wurde, um an beiden Enden offen zu sein, und an einem Ende mit Latex-Dentalfolie und am anderen Ende mit Nylongewebe und Filterpapier bedeckt ist (Abbildung 1).
   HINWEIS: Die Moskitos deponieren ihre Eier auf dem Filterpapier und das Nylonnetz hält das Filterpapier sicher an Ort und Stelle. Mückeneier haben eine zylindrische Form, sind ~ 500 μm lang, an ihrer breitesten Stelle einen Durchmesser von ~ 200 μm und verjüngen sich an den vorderen und hinteren Enden (Abbildung 2).
2. Legen Sie das mit Mücken gefüllte Röhrchen in eine kleine (60 mm x 15 mm) Petrischale, die mit doppelt destilliertem Wasser (ddH_{2 O)}gefüllt ist. Das Röhrchen und die Schale 45 min lang bei 28 °C in einen Inkubator geben (Abbildung 3).
3. Entfernen Sie das Röhrchen aus dem Inkubator und führen Sie das Röhrchen in einen leeren Käfig ein. Klopfen Sie vorsichtig auf die Röhre, damit moskitos herausfliegen können, und entfernen Sie die Röhre aus dem Käfig, sobald alle Moskitos herausgeflogen sind.
4. Wenn das Röhrchen frei von Moskitos ist, schrauben Sie den unteren Ring ab, entfernen Sie das Nylon und entfernen Sie mit einer Pinzette vorsichtig das Filterpapier mit den Eiern aus dem Röhrchen. Legen Sie das Filterpapier in eine Kunststoff-Petrischale (100 mm x 15 mm), die eine mit ddH₂O angefeuchtete Schicht Filterpapier enthält.
5. Beobachten Sie die Eier. Eier, die bis zu dem Punkt gealtert sind, an dem sie hellgrau gefärbt sind (Abbildung 4), sind bereit für die Ausrichtung.
   1. Wenn die Eier noch weiß sind, bringen Sie sie in den Inkubator zurück und überprüfen Sie die Farbe alle 5 Minuten. Weiße Eier sind zerbrechlich, brechen leicht und überleben nach dem Injektionsprozess nicht gut, was zu einem geringen Schlüpfen führt.
   2. Eier, die dunkelgrau oder schwarz sind, sind zu stark gealtert. Verwenden Sie sie nicht.

3. Ausrichtung des Embryos

1. Schneiden Sie ein Stück Nylon-Löschmembran (2 cm x 1 cm) mit einer Rasierklinge ab und achten Sie darauf, dass der Rand ordentlich beschnitten ist.
   HINWEIS: Wenn der Rand nicht gerade ist, bleiben die Eier während des Injektionsprozesses nicht richtig an der Membran befestigt.
2. Legen Sie eine Membran auf einen Glasobjektträger und bedecken Sie die Membran mit einem Stück Filterpapier (2 cm x 2 cm), wobei ~ 1 mm des Membranfilters unbedeckt bleiben (Abbildung 5).
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Objektträger vor dem Gebrauch sauber sind, und verwenden Sie eine saubere Pinzette, um den Membranfilter zu manipulieren.
3. Befeuchten Sie das Filterpapier mit entionisiertem_H2O,da Eier bei längerem Austrocknen absterben.
   HINWEIS: Geben Sie nicht zu viel Wasser auf das Papier, da sich die Embryonen während des Injektionsprozesses bewegen, aber stellen Sie sicher, dass genügend vorhanden ist, um das Austrocknen des Embryos zu verhindern (Abbildung 6A, B). Überschüssiges Wasser kann entfernt werden, indem es mit einem Stück Filterpapier absorbiertwird.
4. Übertragen Sie vorsichtig 30-50 Embryonen mit einem Pinsel (Größe #0) an den Rand der Membran. Verwenden Sie die Bürste, um die Eier vertikal entlang der Membran auszurichten, indem Sie sie vorsichtig auf dem Objektträger überrollen, so dass die ventrale Seite (konvex) nach oben zeigt.
5. Richten Sie alle Eier in die gleiche Richtung aus, so dass bei der Beobachtung der Eier unter dem Mikroinjektionsmikroskop das hintere Ende (spitzer, Abbildung 6A, B) in einer abwärts gerichteten Position ist und mit der Nadel einen Winkel von ~15° bildet ( Abbildung6C). Den gesamten Rand der Membran mit Eiern (30-50) auskleiden und den Objektträger zur Injektion unter das Mikroskop legen.
   HINWEIS: Wählen Sie die Eier sorgfältig aus. Verwerfen Sie diejenigen, die weiß (zu jung oder unentwickelt) oder dunkelgrau (zu alt und brechen die Nadel) sind, und die abnormalen (Abbildung 7). Achten Sie darauf, dass das Filterpapier immer feuchtbleibt.

4. DNA-Präparation

1. Reinigen Sie Plasmid-DNAs zur Injektion mindestens mit einem endotoxinfreien DNA-Plasmid-Maxiprep-Kit gemäß den Protokollen des Herstellers.
2. Resuspendieren Sie die DNA in PCR-Wasser und zentrifugieren Sie bei 17.100 x g in einer gekühlten Zentrifuge für 30 min bei 4 °C. Übertragen Sie dann den Überstand auf ein neues, sauberes 1,5 ml konisches Rohr. Vorsichtig Mikropipette, um unerwünschte Partikel aus der Säule zu vermeiden.
3. Führen Sie eine zweite Fällung der DNA mit einem Zehntel Volumen von 3M Natriumacetat und einem zweifachen Volumen von 100% Ethanol durch.
4. Resuspendieren Sie die DNA in 300-500 μL PCR-Wasser für eine endgültige Plasmidkonzentration von 1000 ng / μL. Mischen Sie den Plasmidcocktail im Injektionspuffer für eine endgültige Plasmidkonzentration von 300-400 ng / μL und machen Sie 10-20 μL Aliquots.
   HINWEIS: DNA kann bei -20 °C gespeichert werden. DNA-Mikroinjektions-Aliquots können bei -20 °C oder bei -80 °C gespeichert werden, wenn RNA-Komponenten verwendet werden. Überschreiten Sie nicht 800 ng / μL DNA in der Injektionsmischung, da die Viskosität dazu führt, dass die Nadeln verstopfen.

5. Nadelvorbereitung

1. Machen Sie die Nadeln, indem Sie 10 cm Quarzkapillaren mit einem programmierbaren Mikropipettenabzieher ziehen.
2. Untersuchen Sie die Nadel unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Spitze gut geformt ist. Stellen Sie sicher, dass die Nadeleinstellung am programmierbaren Abzieher eine Spitze ergibt, die sich ~0,5 mm vom Klemmenende entfernt zu verjüngen beginnt und in einem feinen Punkt endet (siehe Abbildung 6). Nadeln, die leicht brechen, haben normalerweise eine zu lange Verjüngung.
   HINWEIS: Die Bedingungen können je nach Nadelzieher unterschiedlich sein (Die Autoren stellen auf Anfrage die Einstellungen für den von ihnen verwendeten programmierbaren Abzieher zur Verfügung. Zeitschriftenbeschränkungen hindern uns daran, eine bestimmte Marke zu zitieren). Nadeln können von Hand gezogen werden, aber dies erfordert Fähigkeiten, die in den meisten Labors nicht verfügbar sind.

6. Embryo-Mikroinjektion

1. Verwenden Sie eine Mikroladerspitze, um die Nadeln mit 2 μL DNA-Mischung zu füllen. Führen Sie die Nadel in den Nadelhalter ein, und schließen Sie den Schlauch der automatischen Druckpumpe an (Abbildung 8).
2. Wichtig: Richten Sie die Nadel so aus, dass sie einen Winkel von 15° mit der Ebene des Objektträgers bildet (Abbildung 8).
3. Öffnen Sie die Nadelspitze, indem Sie das erste Ei vorsichtig berühren, und injizieren Sie es, indem Sie die Nadelspitze ≤ 10 μm in die hintere Stange einführen. Eine erfolgreiche Injektion führt zu einer kleinen Bewegung des Zytoplasmas innerhalb des Eies.
4. Verwenden Sie die koaxialen Stufensteuerungen des Mikroskops, um zum nächsten Ei zu gelangen, um die Injektion fortzusetzen.
   1. Um sicherzustellen, dass die Nadelspitze offen bleibt und nicht verstopft ist, drücken Sie die Injektionstaste, bevor Sie in einen anderen Embryo eintreten, und visualisieren Sie den kleinen Tröpfchen an der Öffnung der Nadel.
   2. Wenn die Nadel verstopft ist, drücken Sie die Clear-Taste, um die Nadel zu löschen und den Tröpfchenvisualisierungstest zu wiederholen. Stellen Sie den Druck nach Bedarf ein, wenn die Nadelspitzenöffnung etwas größer wird, um sicherzustellen, dass die Größe des Tröpfchens klein bleibt.
   3. Injizieren Sie ~ 40-50 Eier mit einer Nadel.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Filterpapier immer feucht bleibt. Halten Sie ausreichend Gegendruck auf die Nadel, um sie frei zu halten. Eine Nadel, die nicht verstopft werden kann, muss durch eine neue Nadel ersetzt werden. Die Platzierung des Embryos, das Einführen der Nadel und die Injektion werden durch Mikroskope erleichtert, die über koaxiale Kontrollen für die horizontale Bewegung des Stadiums verfügen (Abbildung 9).
5. Nachdem die Injektionen abgeschlossen sind, spülen Sie die Eier in einen mit Filterpapier ausgekleideten Und mit 50 ml entionisiertem_H2Ogefüllten Glasbehälter ab (Abbildung 10).
   HINWEIS: Embryonen beginnen 2 Tage nach der Injektion zu schlüpfen und können bis zu 3-5 Tage dauern. Geschlüpfte Larven im ersten Stadium müssen sofort (2-mal täglich) in einen sauberen Behälter mit Wasser und Futter überführt werden.

Ergebnisse

Ein repräsentatives Beispiel für die Anwendung des beschriebenen Mikroinjektionsprotokolls findet sich in Carballar-Lejarazú et al⁵. Die Absicht dabei war, ein autonomes Gene-Drive-System in die Keimbahn eines Laborstamms, G3, von An. gambiaeeinzufügen. Das System wurde entwickelt, um den Kardinalortholog locus (Agcd) auf dem dritten Chromosom dieser Spezies anzusprechen, der für eine Hämperoxidase kodiert, die die Umwandlung von 3-Hydroxykynurenin in Xanthommatin ...

Diskussion

Mit der erhöhten Verfügbarkeit präziser und flexibler gentechnischer Technologien wie CRISPR/Cas9 können transgene Organismen einfacher und stabiler als bisher entwickelt werden. Diese Werkzeuge haben es den Forschern ermöglicht, transgene Stämme von Mückenvektoren zu erzeugen, die den gewünschten Eigenschaften der Refraktärität gegenüber Krankheitserregern (Populationsmodifikation) oder der vererbbaren Sterilität (Populationsunterdrückung) sehr nahe kommen. Um jedoch möglichst sichere und stabilste gentech...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Microinjection Buffer	-	-	1 mM NaHPO4 buffer, pH 6.8, 50 mM KCl
Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane)	Bio-Rad		Neatly and straightly cut into 2x1 cm piece
Conical tubes 50 ml (disposable centrifuge tube, polypropylene)	Fisher Brand		Ends cut
De-ionized or double-distilled water (ddH20)	Mili-Q		In a wash bottle
Dissecting microscope	Leica	Leica MZ12	For embryo alignment
Forceps			No. 5 size
Glass container	Pyrex	No. 3140	125 x 65
Glass slide	Fisher Brand	No. 12-549-3	75x26 mm
Incubator	Barnsted Lab-line	Model No. 150	28 °C
KCl			50 mM
Latex dental film	Crosstex International	No. 19302
Microinjector	Sutter Instrument		XenoWorks Digital Microinjector
Microloader Pipette tips	Eppendorf		20 µL microloader epT.I.P.S.
Micromanipulator	Sutter Instrument		XenoWorks Micromanipulator
Micropipette	Rainin		20 µL
Micropipette puller	Sutter Instrument	Sutter P-2000 micropipette puller
Microscope	Leica	DM 1000 LED or M165 FC	For microinjection
Minimum fiber filter paper	Fisher Brand	No. 05-714-4	Chromatography Paper, Thick
Mosquitoes	MR4, BEI Resources		Anopheles gambiae, mated adult females, blood-fed 4-5 days post-eclosion
NaHPO4 buffer			1 mM, ph 6.8
Nylon mesh
Paint brush	Blick	No. 05831-7040	Fine, size 4/0
Petri dish			Plastic, (60x15 mm, 90x15 mm)
Sodium acetate			3M
Quartz glass capillaries	Sutter Instrument	No. QF100-70-10	With filament, 1 mm OD,  ID 0.7 10 cm length
Water PCR grade	Roche	No. 03315843001