Medição quantitativa assistida por software da espessura óssea subcondral osteoartrítica

Resumo

Este artigo de metodologia apresenta um protocolo de medição quantitativa assistido por software para quantificar a espessura óssea subcondral histológica nas articulações do joelho osteoartrrítico murina e articulações normais do joelho como controles. Este protocolo é altamente sensível ao espessamento sutil e é adequado para detectar alterações ósseas subcondriais osteoartríticas precoces.

Resumo

O espessamento ósseo subcondral e a esclerose são as principais marcas da osteoartrite (OA), tanto em modelos animais quanto em humanos. Atualmente, a gravidade do espessamento do osso subcondral histológico é determinada principalmente por sistemas de classificação semi-quantitativos baseados em estimativa visual. Este artigo apresenta um protocolo reprodutível e facilmente executado para medir quantitativamente a espessura óssea subcondral em um modelo de camundongo de joelho OA induzido pela desestabilização do menisco medial (DMM). Este protocolo utilizou o software ImageJ para quantificar a espessura óssea subcondral em imagens histológicas depois de definir uma região de interesse no condílo femoral medial e no platô tibial médico onde o espessamento do osso subcondral geralmente ocorre no OA do joelho induzido por DMM. Imagens histológicas das articulações do joelho com um procedimento falso foram usadas como controles. A análise estatística indicou que o recém-desenvolvido sistema de medição óssea subcondral quantitativa foi altamente reprodutível com baixas variabilidades intra e inter-observador. Os resultados sugerem que o novo protocolo é mais sensível ao espessamento de ossos subcondrais sutis ou leves do que os sistemas de classificação visual amplamente utilizados. Este protocolo é adequado para detectar alterações ósseas subcondriais osteoartríticas precoces e em andamento e para avaliar a eficácia in vivo dos tratamentos de OA em conjunto com a classificação da cartilagem OA.

Introdução

A osteoartrite (OA), caracterizada radiograficamente pelo estreitamento do espaço articular devido à perda de cartilagem articular, osteofitas e esclerose óssea subcondral (SCB), é a forma mais comum de ^artrite1,2. Embora o papel do osso peri-articular na etiologia da OA não seja totalmente compreendido, a formação de osteofitas e a esclerose SCB são geralmente consideradas como resultados do processo da doença em vez de fatores causadores, mas mudanças na arquitetura/forma e biologia óssea peri-articular podem contribuir para o desenvolvimento e progressão da ^OA3,4 . O desenvolvimento de um sistema de classificação OA preciso e facilmente executado, incluindo a medição de SCB, é fundamental para estudos comparativos entre laboratórios de pesquisa e para avaliar a eficácia de agentes terapêuticos projetados para prevenir ou atenuar a progressão de OA.

SCB é construído com uma fina placa óssea semelhante a uma cúpula e uma camada subjacente de osso trabecular. A placa SCB é a lamella cortical, situada paralelamente e imediatamente sob a cartilagem calcificada. Pequenos ramos de vasos arteriais e venosos, bem como nervos, penetram através dos canais na placa SCB, comunicando-se entre a cartilagem calcificada e o osso trabecular. O osso trabecular subcondral contém vasos sanguíneos, nervos sensoriais, medula óssea e é mais poroso e metabolicamente ativo que a placa SCB. Portanto, o SCB exerce funções de absorção de choque e suporte e também é importante para o fornecimento de nutrientes da cartilagem e metabolismo em articulações normais5,6,7,8.

O espessamento de SCB (em histologia) e a esclerose (na radiografia) são as principais marcas da OA e das principais áreas de pesquisa da fisiopatologia OA. Medir o espessamento de SCB é um componente importante das avaliações histológicas da gravidade da OA. A microradiografia digital relatada anteriormente para medição da densidade mineral SCB ⁹, bem como a medição quantitativa de SCB baseada em microcândia (microcdáciclo) em modelos de roedores de OA10,11,12,13 melhoraram nossa compreensão da estrutura scb e o papel das mudanças de SCB na fisiopatologia OA. A área e a espessura do SCB também foram quantificadas com lâminas histológicas usando um sofisticado sistema de computador com software específico e caro de histomorfometria ^óssea14. No entanto, os sistemas de classificação OA semi-quantitativos baseados em estimativas visuais, incluindo a classificação de espessamento SCB, são mais amplamente utilizados do que micro-CT no momento, porque os sistemas de classificação são fáceis de usar, particularmente para a triagem de numerosas imagens histológicas. No entanto, a maioria dos sistemas de classificação OA existentes concentra-se principalmente em alterações de cartilagem15,16,17. Um método de classificação de espessura de SCB osteoartrítico amplamente utilizado que classifica o espessamento de SCB como leve, moderado e grave é em grande parte subjetivo, e sua confiabilidade não foi totalmente ^validada15. Um protocolo de medição de espessura SCB osteoartrrítico confiável e facilmente executado passo a passo não é totalmente desenvolvido ou não padronizado.

Este estudo teve como objetivo desenvolver um protocolo reprodutível, sensível e facilmente executado para medir quantitativamente a espessura do SCB em um modelo de mouse de OA. Nossos rigorosos testes de medição e análise estatística demonstraram que este protocolo de medição quantitativa assistido pelo software ImageJ poderia quantificar a espessura do SCB nas articulações normais e osteoartríticas do joelho. O protocolo recém-desenvolvido é reprodutível e mais sensível a mudanças leves de SCB do que os sistemas de classificação visual amplamente utilizados. Pode ser usado para detectar alterações precoces de SCB osteoartrvérticos e para avaliar a eficácia in vivo dos tratamentos de OA em conjunto com a classificação da cartilagem OA.

Protocolo

Todos os procedimentos animais incluídos neste protocolo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Centro Médico da Universidade do Kansas, em conformidade com todas as leis e regulamentos federais e estaduais.

1. Criação de oa de joelho em camundongos

1. Crie um modelo de camundongo de joelho OA por desestabilização cirúrgica do menisco medial (DMM), conforme descrito por Glasson et ^al.18 em 22 camundongos balb/c do tipo selvagem com 10-11 semanas de idade. Realizar uma cirurgia falsa como procedimento de controle em oito camundongos com o mesmo histórico e idade.
   NOTA: Ambos os sexos foram utilizados para o projeto original para atender ao requisito do NIH para consideração do sexo como variável biológica, embora o exame da diferença de sexo não seja o escopo deste protocolo.
2. Anesthetize animais por inalação de Isoflurane. Verifique a profundidade da anestesia monitorando sua taxa/esforço respiratório e falta de resposta ao dedo do dedo do sol/aperto de cauda. Coloque animais em uma posição supina.
3. Raspe a pele na área do joelho e limpe a pele com Povidone-Iodo + esfoliante de pele alcoólica; três ciclos alternados.
4. Realize o procedimento DMM no joelho direito sob um microscópio cirúrgico. Exponha a articulação do joelho através de uma incisão parapaelar medial (1,2-1,5 cm de comprimento) e inciso a cápsula articular. Mantenha a patela e o tendão patelar intactos. Após a exposição cuidadosa do ligamento meniscotibial medial (MML), que ancora o menisco medial ao planalto tibial, transecte-o com uma tesoura microcirurgia para desestabilizar o menisco medial.
5. Realizar uma cirurgia falsa no joelho direito como procedimento de controle, no qual o MML foi visualizado, mas não transeccionado.
6. Feche a cápsula articular com 8-0 suturas de poliglactina absorvível e incisão da pele com suturas não absorvíveis 7-0 para procedimentos DMM e sham para garantir o uso adequado do joelho uma vez que a cicatrização tenha ocorrido.
7. Injete A Buprenorfina SR (0,20-0,5 mg/kg) subcutânea (SC) imediatamente antes do procedimento cirúrgico para analgesia, que proporciona alívio da dor até 72 h após uma única injeção. Monitor operou animais após a cirurgia.
8. Eutanize animais usando uma câmara de _CO2 às 2, 8 e 16 semanas após a cirurgia. Após a inconsciência, confirme a morte dos animais por um método físico (abertura da cavidade torácica). Esses métodos de eutanásia são consistentes com as recomendações do Painel de Eutanásia da Associação Médica Veterinária Americana (AVMA).
9. Colher as articulações do joelho para análises histológicas aos 2, 8 e 16 semanas após a cirurgia de DMM e às 2 e 16 semanas após a cirurgia de Sham para obter articulações do joelho do rato com diferentes graus de gravidade de OA ou espessamento de SCB.

2. Preparação de seções teciduais e imagens histólógicas

1. Fixar amostras de tecido articular do joelho do rato em 2% de paraformaldeído, descalcificá-las em ácido fórmico de 25%, incorporar em parafina e seção coronally para examinar os compartimentos medial e lateral.
2. Corte amostras de joelho do lado posterior do joelho usando um microtome e colete seções de tecido que têm 5-μm-espessura em intervalos de 70-80 μm para obter cerca de 40 lâminas de tecido em toda a articulação do joelho. Uma estimativa assistida por micrômetro sugere que os números de slides 1-6 são do distante posterior, 11-18 do meio-posterior, 23-30 do meio-anterior e 35-40 da parte anterior da articulação do joelho. Descarte ou colete seções intervenientes para obter manchas adicionais.
3. Realize safranin-o e manchas verdes rápidas de acordo com as instruções do fabricante para identificar especificamente células de cartilagem e matrizes em cada cinco slides. Realize a coloração hematoxilina-eosina de acordo com as instruções do fabricante para examinar as articulações do joelho nos níveis celular e tecidual, conforme descrito anteriormente19,20,21,22.
4. Adquira imagens histológicas com um microscópio equipado com uma câmera digital. A análise histopatológica geral e a classificação histológica da OA foram realizadas conforme descrito anteriormente15,19,20,21,22.

3. Medição quantitativa do osso subcondral osteoartrético com software ImageJ

1. Baixe o software ImageJ e abra imagens histológicas de interesse.
   1. Baixe o ImageJ empacotado com Java 1.8.0_172 de https://imagej.nih.gov/ij/.
   2. Abra o programa ImageJ. Clique na guia Arquivo na Fita e clique na opção Abrir para abrir a imagem histológica.
   3. Encontre o endereço do diretório do arquivo, selecione o arquivo de imagem e clique em Abrir.
2. Calibrar ImageJ com o micrômetro nas imagens histólógicas.
   1. Use a ferramenta de linha reta para desenhar uma unidade de comprimento no micrômetro e clique em Analisar > (em seguida) Definir escala. Defina a relação distância conhecida e do aspecto Pixel para 1 e clique em OK. ImageJ pode converter o comprimento do pixel para o comprimento da unidade em micrometro.
   2. Defina o fator medido para a área. Clique em Analisar > definir medição e verificar área e limite para caixa de limiar sob nova janela. Esta etapa define ImageJ para medir o parâmetro "Área" dentro de "Limiar" selecionado.
3. Medir a área de interesse total do osso subcondral (SCB).
   1. Defina a região de interesse do SCB (ROI) como mostrado nas caixas laranjas da Figura 1A, que cobre a placa cortical SCB e uma parte do osso trabecular subjacente adjacente à placa cortical no condíle femoral medial (MFC) e planalto tibial medial (MTP) com dimensões específicas para cada ROI. O espessamento de SCB osteoartrvértico geralmente ocorre nessas áreas. Defina o ROI SCB com a mesma forma e dimensão em cada MFC ou MTP para todas as juntas examinadas para garantir que o mesmo tamanho do ROI específico seja medido para todos os animais.
   2. Esboce o contorno da área total de interesse do SCB usando a ferramenta de seleção do Polígono sob a janela principal do ImageJ.
      NOTA: As ferramentas de seleção dão ao sistema um limite para limitar a área medida.
   3. Meça a área total de SCB: Após a 300, clique em Analisar > Medida. Uma janela "Resultados" com medição de área será aberta.
4. Meça a área de substância óssea que contém osso sólido sem medula óssea.
   1. Clique em Editar > Limpar para fora para excluir a área fora da área total do SCB.
      NOTA: Apenas a área total de SCB é visível após clicar na opção Limpar de fora . A imagem fora da área total do SCB ficará preta. Esta etapa permite que os observadores se concentrem na área de substância óssea dentro da área de interesse.
   2. Clique em Imagem > Ajuste > limite de cores para abrir a janela "Cor limiar". Clique em Original na parte inferior da janela "Cor limiar" para restaurar a imagem ao status original. Use ferramentas de seleção na etapa 3.3.2 para desenhar uma pequena caixa na região da substância óssea. Clique na opção Amostra na parte inferior da janela "Cor limiar" para definir a área da substância óssea.
      NOTA: A opção "Amostra" na janela "Cor limiar" permite que o ImageJ selecione todos os mesmos pixels na área total de SCB como a área da amostra de substância óssea. A área de substância óssea selecionada ficará vermelha.
   3. Clique em Selecionar na parte inferior da janela de equilíbrio de cores limiar para criar um limiar de medição de área. Clique em Analisar > Medida no menu principal do ImageJ, e o resultado da medição da área da substância óssea será exibido na janela "Resultados".
   4. Salve os dados da área total de SCB e da área da substância óssea.
5. Calcule a razão da área da substância óssea (^mm2) para a área total de SCB (^mm2) de interesse que representa a espessura da substância óssea (^mm2/1,0 ^mm2) dentro da área total de SCB.
6. Meça a espessura SCB de seções/imagens histológicas (conforme descrito nas etapas 3.1-3.5) de áreas distantes, mid-posterior, mid-anterior e far-anterior (conforme descrito na etapa 2.2) da OA induzida por DMM para avaliar a espessura de SCB específica da área de 6 articulações do joelho (Figura 1B).
   NOTA: Isso pode validar a confiabilidade deste protocolo de medição quantitativa porque sabe-se que o SCB osteoartrrítico altera co-localizar com lesões de cartilagem e que o dano da cartilagem osteoartrítica com espessamento de SCB é mais grave nas áreas de rolamento de peso (porção média) das articulações do joelho de ^{roedores14,15}. Portanto, é apropriado usar seções médias para medição quantitativa do espessamento de SCB osteoartrático.

4. Estatísticas

1. Realizar análises estatísticas utilizando dados de medição quantitativa e classificação visual da espessura de SCB. Determine a variabilidade e reprodubilidade entre e intra-observadores pelas análises do coeficiente de correlação de Pearson.
2. Determine a significância das diferenças entre os grupos de estudo usando os t-tests do Student ou a ANOVA unidirecional, seguido de um teste pós-hoc (Tukey) usando software de planilha. Considere um valor p inferior a 0,05 como estatisticamente significativo.

Resultados

Comparação de reprodutibilidade entre classificação de estimativa visual e medição quantitativa assistida por ImageJ:
A espessura de SCB em 48 regiões de interesse (ROI) (24 MFC e 24 MTP), definida a partir de uma seção média de cada joelho de 24 joelhos/animais, foi pontuada por três indivíduos independentes utilizando o esquema de pontuação visual existente 0-3, conforme descrito na ^{literatura15,23}, quando 0 = normal (sem espes...

Discussão

Medir o espessamento de SCB é um componente importante das avaliações histológicas da gravidade da OA. A maioria dos sistemas de classificação OA existentes concentra-se principalmente em alterações de cartilagem15,16,17. Um método de classificação de espessura scb osteoartrrítico de murina amplamente utilizado que classifica o espessamento de SCB como leve, moderado e grave é em grande parte subjetivo, e sua confia...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Safranin-O	Sigma-Aldrich	S8884
Fast green	Sigma-Aldrich	F7252
Hematoxylin	Sigma-Aldrich	GHS216
Eosin	Sigma-Aldrich	E4382
illustrator	Adobe	Not applicable