Métodos espectrofotométricos para el estudio del metabolismo del glucógeno eucariota

Resumen

Se presentan técnicas para medir la actividad de enzimas clave del metabolismo del glucógeno, utilizando un espectrofotómetro simple que opera en el rango visible.

Resumen

El glucógeno se sintetiza como una forma de almacenamiento de glucosa por una amplia gama de organismos, que van desde bacterias hasta animales. La molécula comprende cadenas lineales de residuos de glucosa ligados a α1,4 con ramas introducidas mediante la adición de enlaces α1,6. Comprender cómo se regulan la síntesis y la degradación del glucógeno y cómo el glucógeno alcanza su estructura ramificada característica requiere el estudio de las enzimas de almacenamiento de glucógeno. Sin embargo, los métodos más comúnmente utilizados para estudiar estas actividades enzimáticas suelen emplear reactivos o técnicas que no están disponibles para todos los investigadores. Aquí, discutimos una batería de procedimientos que son técnicamente simples, rentables y, sin embargo, capaces de proporcionar información valiosa sobre el control del almacenamiento de glucógeno. Las técnicas requieren acceso a un espectrofotómetro, que opera en el rango de 330 a 800 nm, y se describen asumiendo que los usuarios emplearán cubetas de plástico desechables. Sin embargo, los procedimientos son fácilmente escalables y pueden modificarse para su uso en un lector de microplacas, lo que permite un análisis altamente paralelo.

Introducción

El glucógeno está ampliamente distribuido en la naturaleza, y el compuesto se encuentra en bacterias, muchos protistas, hongos y animales. En los microorganismos, el glucógeno es importante para la supervivencia celular cuando los nutrientes son limitantes y, en organismos superiores como los mamíferos, la síntesis y degradación del glucógeno sirven para amortiguar los niveles de glucosa en sangre ^1,2,3. El estudio del metabolismo del glucógeno es, por lo tanto, de importancia para campos tan diversos como la microbiología y la fisiología de los mamíferos. Comprender el metabolismo del glucógeno requiere estudiar las enzimas clave de la síntesis de glucógeno (glucógeno sintasa y la enzima ramificante) y la degradación del glucógeno (glucógeno fosforilasa y enzima desramificante). Los ensayos estándar de oro de glucógeno sintasa, fosforilasa, ramificación y actividades enzimáticas de desramificación emplean isótopos radiactivos. Por ejemplo, la glucógeno sintasa se mide generalmente en un ensayo radioquímico detenido siguiendo la incorporación de glucosa de UDP-[14 C]glucosa (en el caso de enzimas animales y fúngicas) o ADP-[¹⁴C]glucosa (en el caso de enzimas bacterianas) en glucógeno ^4,5. Del mismo modo, la glucógeno fosforilasa se mide en la dirección de la síntesis de glucógeno, después de la incorporación de glucosa de [¹⁴C] glucosa-1-fosfato en glucógeno⁶. La enzima de ramificación se ensaya midiendo la capacidad de esta enzima para estimular la incorporación de [14 C]glucosa de glucosa-1-fosfato en cadenas ligadas a α1,4 por la glucógeno fosforilasa⁷, y la actividad enzimática de desramificación se determina siguiendo la capacidad de la enzima para incorporar [¹⁴C]glucosa en glucógeno⁸ . Si bien son muy sensibles, lo que permite su uso en extractos de células crudas con bajos niveles de actividad enzimática, los sustratos radiactivos son caros y están sujetos a los requisitos reglamentarios relacionados con el uso de radioisótopos. Estas barreras ponen el uso de ciertos ensayos fuera del alcance de muchos trabajadores. Sin embargo, a lo largo de muchos años, se ha descrito una impresionante variedad de enfoques espectrofotométricos para la medición de estas enzimas. En general, estos enfoques se basan en última instancia en la medición de la producción o el consumo de NADH / NADPH, o la generación de complejos coloreados entre el glucógeno y el yodo. Por lo tanto, son sencillos y se pueden llevar a cabo utilizando espectrofotómetros simples equipados solo con lámparas de flash de tungsteno o xenón.

Los ensayos espectrofotométricos de glucógeno sintasa se basan en la medición del nucleósido difosfato liberado por el donante de nucleótido de azúcar a medida que la glucosa se agrega a la creciente cadena de glucógeno ^9,10. El procedimiento para medir la actividad de la glucógeno sintasa descrito en la sección 1 del protocolo, a continuación, es una modificación de la descrita por Wayllace et ^al.11, y el esquema de acoplamiento se muestra a continuación:

(Glucosa) _n + UPD-glucosa → (glucosa)_n+1 + UDP

UDP + ATP → ADP + UTP

ADP + fosfoenolpiruvato → piruvato + ATP

Piruvato + NADH + H+ → Lactato + NAD⁺

La glucógeno sintasa agrega glucosa de UDP-glucosa al glucógeno. El UDP generado en este proceso se convierte en UTP por nucleósido difosfato quinasa (NDP quinasa), en una reacción que genera ADP. El ADP, a su vez, sirve como sustrato para la piruvato quinasa, que fosforila el ADP utilizando fosfoenolpiruvato como donante de fosfato. El piruvato resultante se convierte en lactato por la enzima lactato deshidrogenasa en una reacción que consume NADH. Por lo tanto, el ensayo se puede realizar de manera continua, monitoreando la disminución de la absorbancia a 340 nm a medida que se consume NADH. Se adapta fácilmente para su uso con enzimas que requieren ADP-glucosa como donante de glucosa. Aquí, los pasos de acoplamiento son más simples ya que el ADP liberado por la acción de la glucógeno sintasa es directamente actuado por la piruvato quinasa.

Hay una variedad de ensayos espectrofotométricos disponibles para la determinación de la actividad de la glucógeno fosforilasa. En la versión clásica, la enzima es impulsada hacia atrás, en la dirección de la síntesis de glucógeno, como se muestra a continuación:

(Glucosa) _n + Glucosa-1-fosfato → (Glucosa)_n+1 + P_i

A intervalos de tiempo, se eliminan las alícuotas de la mezcla de reacción y se cuantifica la cantidad de fosfato liberado^12,13. En nuestras manos, este ensayo ha sido de uso limitado debido a la presencia de fosfato libre fácilmente medible en muchas preparaciones comerciales de glucosa-1-fosfato, combinado con las altas concentraciones de glucosa-1-fosfato requeridas para la acción de la fosforilasa. Más bien, hemos empleado rutinariamente un ensayo alternativo que mide la glucosa-1-fosfato liberada a medida que el glucógeno es degradado por la fosforilasa¹³. Se emplea un esquema de reacción acoplada, ilustrado a continuación.

(Glucosa) n + P_i → (Glucosa)_n-1 + _{Glucosa-1-fosfato}

Glucosa-1-fosfato → Glucosa-6-fosfato

Glucosa-6-fosfato + NADP+ → 6-fosfogluconolactona + NADPH + H⁺

La glucosa-1-fosfato se convierte en glucosa-6-fosfato por la fosfoglucomutasa, y la glucosa-6-fosfato se oxida a 6-fosfogluconolactona, con la reducción concomitante de NADP ⁺ a NADPH. El procedimiento detallado en la sección 2 del protocolo, a continuación, se deriva de los métodos descritos por Mendicino et al.14 y Schreiber & Bowling ¹⁵. El ensayo se puede realizar fácilmente de manera continua, con el aumento de la absorbancia a 340 nm con el tiempo, lo que permite la determinación de la velocidad de reacción.

La determinación espectrofotométrica de la actividad enzimática desramificante se basa en la medición de la glucosa liberada por la acción de la enzima sobre la dexforilasa límite de dextrina¹⁶. Este compuesto se elabora tratando el glucógeno exhaustivamente con glucógeno fosforilasa. Dado que la acción de la glucógeno fosforilasa detiene 4 residuos de glucosa lejos de un punto de ramificación α1,6, el límite de dextrina contiene glucógeno, cuyas cadenas externas se han acortado a ~ 4 residuos de glucosa. La preparación de la dextrina límite de fosforilasa se describe aquí, utilizando un procedimiento derivado de los desarrollados por Taylor et al.17 y Makino & Omichi¹⁸.

La desramificación es un proceso de dos pasos. La actividad de la 4-α-glucanotransferasa de la enzima desramificante bifuncional transfiere primero tres residuos de glucosa desde el punto de ramificación al extremo no reductor de una cadena de glucosa cercana ligada a α1,4. El único residuo de glucosa ligado a α1,6 que queda en el punto de ramificación es hidrolizado por la actividad de la α1,6-glucosidasa¹⁹. El ensayo generalmente se realiza de manera detenida, la glucosa liberada después de un tiempo determinado (o serie de veces) se mide en un ensayo enzimático acoplado como se muestra a continuación:

(Glucosa) n → (Glucosa)_n-1 + Glucosa

Glucosa + ATP → Glucosa-6-fosfato + ADP

Glucosa-6-fosfato + NADP+ → 6-fosfogluconolactona + NADPH + H⁺

La determinación de NADPH producido da una medida de la producción de glucosa. El procedimiento descrito en la sección 3 del protocolo, a continuación, se basa en uno descrito por Nelson et ^al.16. Al igual que los otros métodos que dependen del consumo o la generación de NADH / NADPH, el ensayo es bastante sensible. Sin embargo, la presencia de amilasas u otras glucosidasas, que también pueden liberar glucosa libre de la dextrina límite fosforilasa, causará interferencia significativa (ver Discusión).

La determinación colorimétrica de la actividad enzimática ramificada se basa en el hecho de que las cadenas de glucosa α1,4 adheridas adoptan estructuras helicoidales que se unen al yodo, formando complejos coloreados²⁰. El color del complejo formado depende de la longitud de las cadenas enlazadas α1,4. Por lo tanto, la amilosa, que consiste en cadenas largas, en gran parte no ramificadas, de glucosa ligada a α1,4, forma un complejo azul profundo con yodo. En contraste, los glucógenos, cuyas cadenas externas son generalmente del orden de solo 6 a 8 residuos de glucosa de largo, forman complejos de color rojo anaranjado. Si una solución de amilosa se incuba con enzima ramificada, la introducción de ramas en la amilosa da como resultado la generación de cadenas de glucosa ligadas a α1,4 más cortas. Por lo tanto, el máximo de absorción de los complejos amilosa / yodo se desplaza hacia longitudes de onda más cortas. El procedimiento discutido aquí se deriva del detallado por Boyer & Preiss²¹ y la actividad enzimática de ramificación se cuantifica como una reducción en la absorción del complejo amilosa / yodo a 660 nm con el tiempo.

Como debería ser fácilmente evidente a partir de la discusión anterior, el hecho de que los colores de los complejos formados entre las cadenas de yodo y α1,4-glucosa varíen con la longitud de la cadena significa que los espectros de absorbancia de los complejos glucógeno/yodo deberían variar con el grado de ramificación del glucógeno. Este es de hecho el caso, y los glucógenos / glucógenos menos ramificados con cadenas externas más largas absorben la luz a una longitud de onda más larga que los glucógenos que son más ramificados / tienen cadenas externas más cortas. Por lo tanto, la reacción de tinción de yodo puede utilizarse para obtener datos rápidos y cualitativos sobre el grado de ramificación del glucógeno²². El color marrón anaranjado se forma cuando los complejos de glucógeno con yodo no son particularmente intensos. Sin embargo, el desarrollo del color puede mejorarse con la inclusión de una solución saturada de cloruro de calcio²². Esto aumenta la sensibilidad del método unas 10 veces y permite un análisis rápido de cantidades de microgramos de glucógeno. El ensayo para la determinación de la ramificación descrito en la sección 4 del protocolo, a continuación, está adaptado de un procedimiento desarrollado por Krisman²². Se lleva a cabo simplemente combinando la muestra de glucógeno con solución de yodo y cloruro de calcio en una cubeta y recogiendo el espectro de absorción de 330 nm a 800 nm. El máximo de absorbancia cambia hacia longitudes de onda más largas a medida que disminuye el grado de ramificación.

En conjunto, los métodos descritos aquí proporcionan medios simples y confiables para evaluar las actividades de las enzimas clave del metabolismo del glucógeno y para obtener datos cualitativos sobre el alcance de la ramificación del glucógeno.

Protocolo

1. Determinación de la actividad de la glucógeno sintasa

1. Preparar soluciones madre de los reactivos necesarios como se indica en la Tabla 1 (antes del día experimental).

Componente	Indicaciones
50 mM Tris pH 8.0	Disuelva 0,61 g de base de Tris en ~ 80 ml de agua.  Enfriar a 4 °C.   Ajuste el pH a 8.0 con HCl y haga que el volumen sea de hasta 100 mL con agua.
Búfer HEPES de 20 mM	Disolver 0,477 g de HEPES en ~ 80 mL de agua.  Ajuste el pH a 7.0 con NaOH y enrasar el volumen a 100 ml con agua.
132 mM Tris/32 mM tampón KCl pH 7.8	Disolver 1,94 g de Tris base y 0,239 g de KCl en ~90 mL de agua.  Ajustar el pH a 7,8 con HCl y enrasar el volumen a 100 ml con agua.
0.8% p/v glucógeno de ostra	Pesar 80 mg de glucógeno de ostra y añadir al agua.  Haga que el volumen final sea de hasta 10 ml con agua y caliente suavemente / mezcle para disolver completamente el glucógeno.
100 mM UDP-glucosa	Disolver 0,31 g de UDP-glucosa en agua y hacer el volumen final hasta 1 mL.  Conservar en alícuotas, congelado a -20 °C.   Estable durante varios meses.
ATP de 50 mM	Disolver 0,414 g de ATP en ~ 13 mL de agua.  Ajuste el pH a 7.5 con NaOH y enrasar el volumen a 15 mL con agua.  Conservar en alícuotas congeladas a -20 °C.   Estable durante varios meses.
100 mM glucosa-6-fosfato pH 7.8	Disuelva 0.282 g de glucosa-6-fosfato en ~ 7 a 8 ml de agua.  Ajuste el pH a 7.8 con NaOH.  Haga que el volumen sea de hasta 10 mL con agua.  Conservar congelado en alícuotas a -20 °C.   Estable durante al menos seis meses.
40 mM fosfoenolpiruvato	Disolver 4 mg de fosfoenolpiruvato en 0,5 mL de tampón HEPES de 20 mM de pH 7,0.  Conservar a -20 °C.   Estable durante al menos 1 semana.
0,5 M MnCl2	Disolver 9,90 g de MnCl2 en un volumen final de 100 ml de agua.
NDP quinasa	Reconstituir el polvo liofilizado con suficiente agua para dar 1 U/μl de solución.  Preparar alícuotas, congelar en nitrógeno líquido y almacenar a -80 °C.   Estable durante al menos 1 año.

Tabla 1: Soluciones madre necesarias para el ensayo de la actividad de la glucógeno sintasa.

2. El día del ensayo, preparar una nueva solución de trabajo de 4 mM de NADH disolviendo 4,5 mg de NADH en 1,5 ml de 50 mM de Tris-HCl, pH 8,0. Almacenar en hielo, protegido de la luz.
3. Descongele las soluciones madre de UDP-glucosa, ATP, fosfoenolpiruvato y NDP quinasa en hielo.
4. Precalentar un baño maría a 30 °C.
5. Configure cada ensayo de glucógeno sintasa en un tubo de 1,5 ml agregando los reactivos de mezcla de reacción enumerados en la Tabla 2.

Componente	Volumen (μl)
160 mM Tris/32 mM TAMPÓN KCl pH 7.8	250
Agua	179
100 mM de glucosa-6-fosfato, pH 7.8	58
0,8 % p/v glucógeno de ostra	67
ATP de 50 mM	80
4 mM NADH	80
100 mM UDP-glucosa	28
40 mM fosfoenolpiruvato	20
0,5 M MnCl2	8
Volumen final	770

Tabla 2: Composición de la mezcla de reacción para el ensayo de la actividad de la glucógeno sintasa.

NOTA: Para facilitar la configuración, se puede hacer una mezcla maestra que contenga suficiente cantidad de cada uno de los reactivos mencionados anteriormente para completar el número de ensayos planificados.

6. Prepare una reacción en blanco, donde el NADH en la mezcla anterior se reemplaza con agua. Transfiera a una cubeta desechable de metacrilato y utilícela para establecer el cero en el espectrofotómetro a 340 nm.
7. Tomar un 770 μL de la alícuota de la mezcla de reacción en un tubo de 1,5 ml. Añadir 2 μL de NDP quinasa y 2 μL de mezcla de piruvato quinasa/lactato deshidrogenasa, mezclar suavemente e incubar a 30 °C durante 3 min para precalentar la mezcla de reacción.
8. Añadir 30 μL de la muestra que contiene glucógeno sintasa en tampón Tris de 20 mM, pH 7,8; mezclar y transferir la mezcla de reacción a una cubeta desechable de metacrilato.
9. Coloque la cubeta en el espectrofotómetro y registre la absorbancia a 340 nm a intervalos cronometrados de 10 a 20 min. Trazar las absorbancias obtenidas contra el tiempo.
   NOTA: Se debe realizar una reacción en la que la muestra de glucógeno sintasa se reemplaza con tampón Tris de 20 mM para controlar la oxidación no enzimática de NADH. Dependiendo de la pureza de la muestra, pueden ser necesarias otras reacciones de control. Consulte Discusión para obtener más detalles.
10. Determine la velocidad de reacción (consulte Resultados para obtener más información).

2. Determinación de la actividad de la glucógeno fosforilasa

1. Preparar las soluciones madre como se indica en la Tabla 3 (antes del día experimental).

Componente	Indicaciones
TUBERÍAS DE 125 mM pH 6.8	Disolver 3,78 g de PIPES en agua.  Ajuste el pH a 6.8 con NaOH y enrasar el volumen a 100 ml con agua.
8% p/v glucógeno de ostra	Pesar 0,8 g de glucógeno de ostra y añadir al agua.  Haga que el volumen final sea de hasta 10 ml con agua y caliente suavemente / mezcle para disolver el glucógeno.  Conservar congelado a -20 °C.
200 mM Na fosfato pH 6.8	Disuelva 2,63 g de Na2 HPO 4,7H2O y1,41 g de NaH2PO4. H2Oen agua.  Lleve el volumen hasta 100 ml con agua.
1 mM de glucosa-1,6-bisfosfato	Disolver 2 mg de glucosa-1,6-bisfosfato en 4 mL de agua.  Alícuota y conservar congelado a -20 °C.   Estable durante al menos varios meses.
NADP de 10 mM	Disuelva 23 mg de NADP en 3 ml de agua.  Alícuota y conservar congelado a -20 °C.   Estable durante al menos varios meses.

Tabla 3: Soluciones madre necesarias para el ensayo de la actividad de la glucógeno fosforilasa.

2. Precalentar un baño maría a 30 °C
3. Configure cada ensayo de glucógeno fosforilasa en un tubo de 1,5 ml agregando los reactivos de mezcla de reacción que se enumeran a continuación (Tabla 4).

Componente	Volumen (μl)
Tampón PIPES de 125 mM pH 6.8	160
Agua	70
8% p/v glucógeno de ostra	100
200 mM Na fosfato 6.8	400
1 mM de glucosa-1,6-bisfosfato	20
NADP de 10 mM	20
Volumen final	770

Tabla 4: Composición de la mezcla de reacción para el ensayo de la actividad de la glucógeno fosforilasa.

NOTA: Para facilitar la configuración, se puede hacer una mezcla maestra que contenga suficiente cantidad de cada uno de los reactivos mencionados anteriormente para completar el número de ensayos planificados.

5. Preparar una reacción en blanco que contenga los componentes enumerados en la Tabla 4 , pero añadir 30 μL adicionales de tampón PIPES de 25 mM, pH 6,8 (preparado diluyendo 125 mM PIPES tampón 1/5 con agua). Transfiera a una cubeta desechable de metacrilato y utilícela para establecer el cero en el espectrofotómetro a 340 nm.
6. Tomar una alícuota de 770 μL de mezcla de reacción en un tubo de 1,5 ml. Añadir 1 μL de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y 1 μL de fosfoglucommutasa, mezclar suavemente e incubar a 30 °C durante 3 min para precalentar la mezcla de reacción.
7. Añadir 30 μL de la muestra que contiene glucógeno fosforilasa en tampón PIPES de 25 mM, pH 6,8. Mezclar y transferir la mezcla de reacción a una cubeta desechable de metacrilato.
8. Coloque la cubeta en el espectrofotómetro y registre la absorbancia a 340 nm a intervalos cronometrados de 10 a 20 min. Trazar las absorbancias obtenidas contra el tiempo.
   NOTA: Se debe incluir una reacción en la que la glucógeno fosforilasa se reemplaza con tampón PIPES de 25 mM. Dependiendo de la pureza de la muestra de glucógeno fosforilasa, también pueden ser necesarios otros controles (ver Discusión para más detalles).
9. Determine la velocidad de reacción (consulte Resultados representativos para obtener más detalles).

3. Determinación de la actividad enzimática desramificante del glucógeno

1. Preparar las soluciones madre como se indica en la Tabla 5 (antes del día experimental).

Componente	Indicaciones
Tampón de maleato de 100 mM	Disuelva 1,61 g de ácido maleico en ~ 80 ml de agua.  Ajuste el pH a 6.6 con NaOH y haga que el volumen final sea de hasta 100 ml con agua.
300 mM clorhidrato de trietanolamina/ 3 mM MgSO4 pH 7.5	Disolver 27,85 g de clorhidrato de trietanolamina y 0,370 g de MgSO4. 7H2O en ~ 400 mL de agua.  Ajustar el pH a 7,5 con NaOH y enrasar hasta un volumen final de 500 mL con agua.
150 mM ATP/12 mM NADP	Disuelva 1,24 g de ATP en ~ 10 ml de agua.  Controle el pH y agregue NaOH para mantener un pH de ~ 7.5 a medida que el ATP se disuelve.  Añadir 0,138 g de NADP.  Ajuste el pH a ~ 7.5 con NaOH y enrasar hasta un volumen final de 15 mL con agua. Conservar en alícuotas a – 20 °C. Estable durante varios meses.
Tampón fosfato de Na de 50 mM pH 6.8	Disuelva 32,81 g de Na2 HPO 4.7H2O y17,61 g de NaH2PO4. H2Oen agua.  Llevar el volumen hasta un volumen final de 5 L con agua.

Tabla 5: Soluciones madre necesarias para el ensayo de la actividad enzimática desramificante del glucógeno.

2. Preparar la dextrina límite fosforilasa
   1. Disolver 0,3 g de glucógeno de ostra en 10 mL de tampón fosfato de sodio de 50 mM, pH 6,8.
   2. Disuelva suficiente polvo de fosforilasa A liofilizada para producir 60 U de actividad en tampón fosfato de 50 mM, pH 6.8.
      NOTA: Dependiendo del lote de fosforilasa A comprado, la masa necesaria variará, pero generalmente es entre 5 y 10 mg de polvo.
3. Agregue 60 U de fosforilasa A a la solución de glucógeno y transfiérala a una bolsa de diálisis. Dializar a temperatura ambiente contra 1 L de tampón fosfato sódico de 50 mM, pH 6,8 durante 8 h. Cambie al tampón de diálisis fresco y continúe la incubación durante la noche.
4. Agregue otros 10 U de fosforilasa A y cambie a tampón de diálisis nuevo. Después de 8 h, cambie nuevamente a tampón de diálisis fresco y continúe la incubación durante la noche.
5. Transfiera el contenido de la bolsa de diálisis a un tubo de centrífuga y hierva durante 10 minutos. Enfriar sobre hielo y luego centrifugar a 10,000 x g durante 15 min.
6. Transfiera el sobrenadante a una bolsa de diálisis y dialice durante 8 h contra tres cambios de 2 L de agua destilada.
7. Transfiera el contenido de la bolsa de diálisis a un tubo de centrífuga de 50 ml. Mida el volumen y agregue dos volúmenes de etanol absoluto helado para precipitar el límite de dextrina. Deje reposar el tubo sobre hielo durante 30 minutos.
   NOTA: Un precipitado blanco debe comenzar a formarse inmediatamente después de la adición de etanol pero, si no lo hace, agregue una gota de 3 M NaCl.
8. Centrifugar a 15.000 x g durante 15 min y desechar el sobrenadante. Enjuague el pellet blanco de dextrina límite dos veces con etanol al 66% v/v, usando ~30 mL para cada enjuague.
9. Transfiera la dextrina límite a un mortero y deje secar completamente al aire. Cuando el límite de dextrina esté seco, moler hasta obtener un polvo con un mortero y transferirlo a un recipiente adecuado para su almacenamiento; seco a 4 °C.
10. Para su uso como sustrato enzimático desramificador, prepare una solución p/v al 1% en agua.
11. Precalentar un baño maría a 30 °C.
12. Precaliente un bloque calefactor o un baño de agua a 95 °C.
13. Prepare cuatro tubos de 1,5 ml cada uno con 100 μL de tampón maleato, 80 μL de dextrina límite de fosforilasa y 10 μL de agua. Estos tubos se utilizarán para realizar el ensayo de la enzima desramificante. Etiquete dos de los tubos Reacción y los otros dos tubos Control.
14. A intervalos cronometrados, añadir 10 μL de la muestra de la enzima desramificante a los tubos de reacción y 10 μL de tampón que se utilizó para preparar la muestra de la enzima ramificada a los tubos de control. Incubar a 30 °C.
15. En momentos de tiempo definidos (por ejemplo, incubación de 5, 10 y 20 minutos), extraiga 50 μL de cada tubo de reacción y control y colóquelos inmediatamente en el bloque de calentamiento o en el baño de agua a 95 °C. Calentar durante 3 min.
16. Centrifugar a 15.000 x g durante 2 min para eliminar la proteína precipitada.
    NOTA: En este punto, el procedimiento se puede detener si es necesario. Las muestras calentadas pueden almacenarse congeladas a -20 °C hasta proceder a la medición de la glucosa liberada (paso 17, a continuación).
17. Medición de la glucosa liberada
    1. Transfiera 40 μL del sobrenadante de las muestras calentadas a cubetas de metacrilato desechables y agregue 833 μL de tampón de clorhidrato de trietanolamina/sulfato de magnesio, 67 μL de mezcla NADP/ATP y 60 μL de agua. Mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo suavemente, teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire.
       NOTA: Para facilitar la configuración, se puede hacer una mezcla maestra que contenga suficiente cantidad de cada uno de los reactivos mencionados anteriormente para completar el número de ensayos planificados.
    2. Prepare una reacción en blanco combinando 100 μL de tampón de maleato, 80 μL de dextrina límite de fosforilasa y 20 μL de agua. Mezclar bien y transferir 40 μL a una cubeta desechable de metacrilato. Añadir 833 μL de clorhidrato de trietanolamina/sulfato de magnesio, etc., como se describe en el paso 3.17.1.
    3. Ajuste el cero en el espectrofotómetro a 340 nm usando la reacción en blanco.
    4. Agregue 0.5 μL de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa a cada cubeta. Mezclar suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo lentamente. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min, y luego registrar la absorbancia a 340 nm.
       NOTA: Los valores de absorción deben ser bajos, lo que significa poca contaminación de las muestras con glucosa-6-fosfato.
    5. Agregue 0.5 μL de hexoquinasa a cada cubeta. Mezclar suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo lentamente. Incubar a temperatura ambiente durante 15 min, y luego registrar la absorbancia a 340 nm.
    6. Continúe la incubación a temperatura ambiente durante 5 minutos adicionales. Registre la absorbancia a 340 nm una vez más. Si la absorción ha aumentado con respecto a la registrada a los 15 min, continúe la incubación durante otros 5 minutos y vuelva a comprobar la absorción. Registrar la absorción final a 340 nm obtenida.
    7. Para cada muestra, restar la absorbancia a 340 nm registrada después de la adición de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa de la absorbancia final obtenida después de la adición de hexoquinasa. Trazar los valores obtenidos contra el tiempo que la muestra correspondiente había sido incubada con la enzima desramificante.

4. Determinación de la actividad enzimática de ramificación del glucógeno

1. Antes del día experimental, prepare la solución de yodo/KI disolviendo primero 2,6 g de KI en 10 ml de agua. En una campana extractora, pese 0,26 g de yodo y agréguelo a la solución de KI.
   PRECAUCIÓN: El yodo es dañino cuando está en contacto con la piel o si se inhala. Mezclar para disolver el yodo y almacenar a 4 °C, protegido de la luz. Prepare también un tampón PIPES de 125 mM, pH 6.8 (ver Tabla 3).
2. Al comenzar los experimentos, haga un material de trabajo de reactivo de yodo acidificado.
   1. Tome 45,7 ml de agua en un tubo de 50 ml y añadir 150 μL de solución de yodo/KI seguido de 150 μL de HCl 1 M.
   2. Mezclar bien y conservar a 4 °C, protegido de la luz. La solución es estable durante al menos 3 días en estas condiciones.
3. El día del experimento, haga una solución fresca de 10 mg / ml de amilosa.
   1. Pesar 50 mg de amilosa y transferir a un tubo de 15 ml.
   2. Añadir 200 μL de etanol absoluto y agitar suavemente.
   3. Añadir 500 μL de 2 M KOH y agitar suavemente.
      PRECAUCIÓN: KOH causa quemaduras graves en la piel y daño ocular. Use el equipo de protección personal adecuado.
   4. Agregue 0.5 ml de agua mientras agita suavemente. Si la amilosa no se disuelve completamente, agregue 0,5 ml adicionales de agua.
   5. Ajuste el pH a ~6.5 a 7.0 con 1 M HCl.
      PRECAUCIÓN: HCl puede causar irritación de los ojos, la piel y las vías respiratorias. Use el equipo de protección personal adecuado.
   6. Agregue agua para alcanzar un volumen final de 5 mL.
   7. Esterilizar por paso a través de un filtro final de jeringa de 0,2 μm y almacenar a temperatura ambiente. No enfríe ni congele.
4. Precalentar un baño maría a 30 °C.
5. Prepare doce tubos de 1,5 ml, cada uno con 1 ml de reactivo de yodo acidificado. Dejar a un lado en el banco. Estos se utilizarán para detener la reacción enzimática de ramificación.
6. Prepare cuatro tubos de 1,5 ml cada uno con 150 μL de amilosa, 150 μL de tampón PIPES y 45 μL de agua. Estos tubos se utilizarán para realizar el ensayo de la enzima de ramificación. Etiquete dos de los tubos Reacción y los otros dos tubos Control.
7. A intervalos cronometrados, agregue 5 μL de muestra de enzima ramificada a los tubos de reacción y 5 μL de tampón que se utilizó para preparar la muestra de enzima ramificada a los tubos de control. Incubar a 30 °C.
8. En momentos de tiempo definidos (p. ej., incubación de 5, 10 y 15 minutos), retire 10 μL de cada tubo de reacción y control y agréguelos a los tubos de 1,5 ml que contienen 1 ml de reactivo de yodo acidificado. Añadir 140 μL adicionales de agua y mezclar bien. Traslado a cubetas desechables.
   NOTA: Las muestras deben ser de color azul y la solución debe estar libre de cualquier precipitado. El color formado es estable durante al menos 2 h a temperatura ambiente.
9. Prepare una muestra que contenga 1 ml de reactivo de yodo acidificado y 150 μL de agua. Mezclar bien y transferir a una cubeta. Utilice esta cubeta para establecer el cero en el espectrofotómetro a 660 nm.
10. Lea la absorbancia de cada una de las doce muestras a 660 nm. Determinar la velocidad de la reacción de la enzima de ramificación restando la absorbancia obtenida en presencia de la enzima de ramificación (reacción) de la absorbancia cuando no hay ninguna enzima de ramificación presente (Control) en cada punto de tiempo. Consulte los resultados representativos para obtener más información.

5. Evaluación cualitativa de la ramificación del glucógeno

1. Prepare una solución saturada de cloruro de calcio agregando 74.5 g de cloruro de calcio anhidro a ~ 40 ml de agua y agitando. Agregue un poco más de agua y continúe removiendo. Haga el volumen hasta 100 ml con agua y continúe agitando hasta que el CaCl₂ se disuelva por completo.
2. Preparar una masa funcional de yodo/CaCl 2 reactivo colorante mezclando 50 μL de solución madre de KI/yodo (ver paso 4.1, arriba) con 13 ml de solución saturada de CaCl₂ en un tubo de 15 ml. Mezclar bien y conservar a 4 °C, protegido de la luz. La solución es estable durante al menos 1 semana en estas condiciones.
3. Determinación de la ramificación
   1. En un tubo de 1,5 ml, combine 650 μL de reactivo de color yodo/CaCl₂ con 100 μL de agua y mezcle bien. Transfiera la solución a una cubeta desechable de metacrilato.
      NOTA: La solución en la cubeta debe ser transparente y de color amarillo pálido.
   2. Colóquelo en el espectrofotómetro y, funcionando en modo de escaneo de longitud de onda, recopile un espectro de fondo de 330 nm a 800 nm.
   3. En un tubo de 1,5 ml, combine 650 μL de yodo funcional/reactivo de color CaCl₂ con 50 μg de glucógeno de ostra. Llevar el volumen final a 750 μL con agua y mezclar bien. Transfiera la solución a una cubeta desechable de metacrilato.
      NOTA: La solución en la cubeta debe ser transparente y de un color naranja / marrón intenso.
   4. Coloque en el espectrofotómetro y recoja un espectro de absorción de 330 nm a 800 nm.
   5. Repita los pasos 4.4.3 a 4.4.4 con 50 μg de amilopectina y 30 μg de amilosa.
      NOTA: La muestra de amilopectina debe ser amarilla/verde y la muestra de amilosa debe ser verde/azul. Ambas muestras deben ser claras. Los complejos coloreados formados son estables, sin cambios en el espectro de absorción, durante al menos 1 h a temperatura ambiente.
   6. Para obtener una indicación de la estructura ramificada de una muestra de glucógeno no caracterizada, combine de 25 μg a 50 μg de glucógeno con 650 μL de yodo de trabajo/reactivo de color CaCl₂ . Proceda como se indicó anteriormente, llevando el volumen a 750 μL con agua, mezclando bien y transfiriendo a una cubeta de metacrilato.
      NOTA: La muestra de glucógeno debe producir un color amarillo/naranja a naranja/marrón dependiendo del grado de ramificación (longitud de las cadenas externas) del glucógeno presente. Una vez más, la muestra debe ser clara. Consulte los resultados representativos para obtener más información.
   7. Recoge el espectro de absorción.

Resultados

Determinación de la actividad de la glucógeno sintasa
La Figura 1 muestra resultados representativos de ensayos de glucógeno sintasa utilizando enzimas purificadas. En el panel A, después de un ligero retraso, hubo una disminución lineal en la absorción a 340 nm con el tiempo durante un período de alrededor de 12 minutos. La tasa de cambio en la absorción en la Figura 1A fue ~0.12 unidades de absorbancia/min. Una tasa de cambio en la ...

Discusión

En general, las ventajas clave de todos los métodos presentados son su bajo costo, facilidad, velocidad y falta de dependencia de equipos especializados. La principal desventaja que todos comparten es la sensibilidad en comparación con otros métodos disponibles. La sensibilidad de los procedimientos que implican la producción o el consumo de NADH/NADPH es fácil de estimar. Dado que el coeficiente de extinción de NADH/NADPH es 6.22 M-1 ^cm-1 , la aritmética simple indica que ~ ^10-20 μM cambios...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amylopectin (amylose free) from waxy corn	Fisher Scientific	A0456
Amylose	Biosynth Carbosynth	YA10257
ATP, disodium salt	MilliporeSigma	A3377
D-Glucose-1,6-bisphosphate, potassium salt	MilliporeSigma	G6893
D-glucose-6-phosphate, sodium salt	MilliporeSigma	G7879
Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Grade I, from yeast	MilliporeSigma	10127655001
Glycogen, Type II from oyster	MilliporeSigma	G8751
Hexokinase	MilliporeSigma	11426362001
Methacrylate cuvettes, 1.5 mL	Fisher Scientific	14-955-128	Methacrylate is required since some procedures are conducted at 340 nm or below
β-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium salt	MilliporeSigma	N0505
β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt	MilliporeSigma	43420
Nucleoside 5'-diphosphate kinase	MilliporeSigma	N0379
Phosphoenolpyruvate, monopotassium salt	MilliporeSigma	P7127
Phosphoglucomutase from rabbit muscle	MilliporeSigma	P3397
Phosphorylase A from rabbit muscle	MilliporeSigma	P1261
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle	MilliporeSigma	P0294
UDP-glucose, disodium salt	MilliporeSigma	U4625