Metodi spettrofotometrici per lo studio del metabolismo del glicogeno eucariotico

Riepilogo

Vengono presentate le tecniche per misurare l'attività degli enzimi chiave del metabolismo del glicogeno, utilizzando un semplice spettrofotometro operante nell'intervallo visibile.

Abstract

Il glicogeno è sintetizzato come una forma di stoccaggio del glucosio da una vasta gamma di organismi, che vanno dai batteri agli animali. La molecola comprende catene lineari di residui di glucosio legati all'α1,4 con rami introdotti attraverso l'aggiunta di legami α1,6. Comprendere come la sintesi e la degradazione del glicogeno sono regolate e come il glicogeno raggiunge la sua caratteristica struttura ramificata richiede lo studio degli enzimi di stoccaggio del glicogeno. Tuttavia, i metodi più comunemente usati per studiare queste attività enzimatiche impiegano tipicamente reagenti o tecniche che non sono disponibili per tutti i ricercatori. Qui, discutiamo una batteria di procedure che sono tecnicamente semplici, economiche e tuttavia in grado di fornire preziose informazioni sul controllo dello stoccaggio del glicogeno. Le tecniche richiedono l'accesso a uno spettrofotometro, operante nell'intervallo da 330 a 800 nm, e sono descritte supponendo che gli utenti utilizzeranno cuvette di plastica usa e getta. Tuttavia, le procedure sono facilmente scalabili e possono essere modificate per l'uso in un lettore di micropiastre, consentendo analisi altamente parallele.

Introduzione

Il glicogeno è ampiamente distribuito in natura, con il composto che si trova in batteri, molti protisti, funghi e animali. Nei microrganismi, il glicogeno è importante per la sopravvivenza cellulare quando i nutrienti sono limitanti e, negli organismi superiori come i mammiferi, la sintesi e la degradazione del glicogeno servono a tamponare i livelli di glucosio nel sangue ^1,2,3. Lo studio del metabolismo del glicogeno è, quindi, importante per campi così diversi come la microbiologia e la fisiologia dei mammiferi. Comprendere il metabolismo del glicogeno richiede lo studio degli enzimi chiave della sintesi del glicogeno (glicogeno sintasi e dell'enzima ramificato) e della degradazione del glicogeno (glicogeno fosforilasi ed enzima deramificante). I saggi gold standard della glicogeno sintasi, della fosforilasi, della ramificazione e delle attività enzimatiche di deramificazione impiegano isotopi radioattivi. Ad esempio, la glicogeno sintasi viene generalmente misurata in un saggio radiochimico interrotto seguendo l'incorporazione di glucosio da UDP-[14 C]glucosio (nel caso di enzimi animali e fungini) o ADP-[¹⁴C]glucosio (nel caso di enzimi batterici) nel glicogeno ^4,5. Analogamente, la glicogeno fosforilasi viene misurata nella direzione della sintesi del glicogeno, in seguito all'incorporazione del glucosio dal [¹⁴C]glucosio-1-fosfato nel glicogeno⁶. L'enzima ramificante viene analizzato misurando la capacità di questo enzima di stimolare l'incorporazione di [14 C]glucosio dal glucosio-1-fosfato in catene legate all'α1,4 mediante glicogeno fosforilasi⁷, e l'attività dell'enzima deramificante è determinata seguendo la capacità dell'enzima di incorporare [¹⁴C]glucosio nel glicogeno⁸ . Sebbene molto sensibili, consentendo il loro uso in estratti cellulari grezzi con bassi livelli di attività enzimatica, i substrati radioattivi sono costosi e soggetti ai requisiti normativi relativi all'uso di radioisotopi. Queste barriere pongono l'uso di determinati saggi fuori dalla portata di molti lavoratori. Tuttavia, nel corso di molti anni, è stata descritta un'impressionante varietà di approcci spettrofotometrici alla misurazione di questi enzimi. In generale, questi approcci si basano in ultima analisi sulla misurazione della produzione o del consumo di NADH / NADPH o sulla generazione di complessi colorati tra glicogeno e iodio. Pertanto, sono semplici e possono essere eseguiti utilizzando semplici spettrofotometri dotati solo di lampade flash al tungsteno o allo xeno.

I saggi spettrofotometrici della glicogeno sintasi si basano sulla misurazione del difosfato nucleosidico rilasciato dal donatore di nucleotidi di zucchero quando il glucosio viene aggiunto alla catena di glicogeno in crescita ^9,10. La procedura per misurare l'attività della glicogeno sintasi descritta nella sezione 1 del protocollo, di seguito, è una modifica di quella delineata da Wayllace et ^al.11, e lo schema di accoppiamento è mostrato di seguito:

(Glucosio) _n + UPD-glucosio → (glucosio)_n+1 + UDP

UDP + ATP → ADP + UTP

ADP + fosfoenolpiruvato → piruvato + ATP

piruvato + NADH + H + → lattato + NAD ⁺

La glicogeno sintasi aggiunge glucosio da UDP-glucosio al glicogeno. L'UDP generato in questo processo viene convertito in UTP dalla nucleoside difosfato chinasi (NDP chinasi), in una reazione che genera ADP. L'ADP, a sua volta, funge quindi da substrato per la piruvato chinasi, che fosforila l'ADP usando il fosfoenolpiruvato come donatore di fosfato. Il piruvato risultante viene convertito in lattato dall'enzima lattato deidrogenasi in una reazione che consuma NADH. Il test può, quindi, essere eseguito in modo continuo, monitorando la diminuzione dell'assorbanza a 340 nm man mano che il NADH viene consumato. È facilmente adattato per l'uso con enzimi che richiedono ADP-glucosio come donatore di glucosio. Qui, le fasi di accoppiamento sono più semplici poiché l'ADP rilasciato dall'azione della glicogeno sintasi è direttamente agito dalla piruvato chinasi.

Sono disponibili diversi saggi spettrofotometrici per la determinazione dell'attività della glicogeno fosforilasi. Nella versione classica, l'enzima viene spinto all'indietro, nella direzione della sintesi del glicogeno, come mostrato di seguito:

(Glucosio) _n + Glucosio-1-fosfato → (Glucosio)_n+1 + P_i

Ad intervalli di tempo, vengono rimosse le aliquote della miscela di reazione e la quantità di fosfato liberata viene quantificata^12,13. Nelle nostre mani, questo test è stato di uso limitato a causa della presenza di fosfato libero facilmente misurabile in molti preparati commerciali di glucosio-1-fosfato, combinato con le alte concentrazioni di glucosio-1-fosfato necessarie per l'azione della fosforilasi. Piuttosto, abbiamo regolarmente impiegato un test alternativo che misura il glucosio-1-fosfato rilasciato quando il glicogeno viene degradato dalla fosforilasi¹³. Viene utilizzato uno schema di reazione accoppiata, illustrato di seguito.

(Glucosio) n + P_i → (Glucosio)_n-1 + _{Glucosio-1-fosfato}

Glucosio-1-fosfato → Glucosio-6-fosfato

Glucosio-6-fosfato + NADP + → 6-fosfogluconolattone + NADPH + H ⁺

Il glucosio-1-fosfato viene convertito in glucosio-6-fosfato dalla fosfoglucomutasi, e il glucosio-6-fosfato viene quindi ossidato a 6-fosfogluconolattone, con la concomitante riduzione di NADP⁺ a NADPH. La procedura descritta nella sezione 2 del protocollo, di seguito, deriva dai metodi descritti da Mendicino et al.14 e Schreiber & Bowling ¹⁵. Il saggio può essere facilmente eseguito in modo continuo, con l'aumento dell'assorbanza a 340 nm nel tempo, consentendo la determinazione della velocità di reazione.

La determinazione spettrofotometrica dell'attività enzimatica deramificante si basa sulla misurazione del glucosio rilasciato dall'azione dell'enzima sulla fosforilasi limite^{di destrina 16}. Questo composto è fatto trattando il glicogeno in modo esaustivo con glicogeno fosforilasi. Poiché l'azione della glicogeno fosforilasi blocca 4 residui di glucosio da un punto di diramazione α1,6, la destrina limite contiene glicogeno, le cui catene esterne sono state ridotte a ~ 4 residui di glucosio. La preparazione della destrina limite della fosforilasi è descritta qui, utilizzando una procedura derivata da quelle sviluppate da Taylor et al.17 e Makino & Omichi ¹⁸.

La deramificazione è un processo in due fasi. L'attività della 4-α-glucanotransferasi dell'enzima deramificante bifunzionale trasferisce prima tre residui di glucosio dal punto di ramificazione all'estremità non riducente di una vicina catena di glucosio legata all'α1,4. Il singolo residuo di glucosio legato all'α1,6 che rimane nel punto di diramazione viene quindi idrolizzato dall'attività dell'α1,6-glucosidasi¹⁹. Il test viene tipicamente eseguito in modo interrotto, il glucosio rilasciato dopo un dato tempo (o serie di volte) viene misurato in un saggio enzimatico accoppiato come mostrato di seguito:

(Glucosio) n → (Glucosio)_n-1 + Glucosio

Glucosio + ATP → Glucosio-6-fosfato + ADP

Glucosio-6-fosfato + NADP + → 6-fosfogluconolattone + NADPH + H ⁺

La determinazione del NADPH prodotto fornisce una misura della produzione di glucosio. La procedura descritta nella sezione 3 del protocollo, di seguito, si basa su quella descritta da Nelson et ^al.16. Come gli altri metodi che si basano sul consumo o sulla generazione di NADH / NADPH, il test è abbastanza sensibile. Tuttavia, la presenza di amilasi o altre glucosidasi, che possono anche liberare glucosio libero dalla destrina limite della fosforilasi, causerà interferenze significative (vedi Discussione).

La determinazione colorimetrica dell'attività enzimatica ramificata si basa sul fatto che le catene α1,4-legate di glucosio adottano strutture elicoidali che si legano allo iodio, formando complessi colorati²⁰. Il colore del complesso formato dipende dalla lunghezza delle catene α1,4-legate. Pertanto, l'amilosio, che consiste in lunghe catene in gran parte non ramificate di glucosio legato all'α1,4, forma un complesso blu profondo con iodio. Al contrario, i glicogeni, le cui catene esterne sono generalmente nell'ordine di soli 6-8 residui di glucosio, formano complessi rosso-arancio. Se una soluzione di amilosio viene incubata con enzima ramificato, l'introduzione di rami nell'amilosio provoca la generazione di catene di glucosio più corte legate all'α1,4. Pertanto, il massimo assorbimento dei complessi amilosio/iodio si sposta verso lunghezze d'onda più corte. La procedura qui discussa è derivata da quella dettagliata da Boyer & Preiss²¹ e l'attività enzimatica ramificata è quantificata come una riduzione dell'assorbimento del complesso amilosio/iodio a 660 nm nel tempo.

Come dovrebbe essere facilmente evidente dalla discussione precedente, il fatto che i colori dei complessi formati tra le catene di iodio e α1,4-glucosio varino con la lunghezza della catena significa che gli spettri di assorbanza dei complessi glicogeno/iodio dovrebbero variare con il grado di ramificazione del glicogeno. Questo è effettivamente il caso, e glicogeni / glicogeni meno ramificati con catene esterne più lunghe assorbono la luce a una lunghezza d'onda più lunga rispetto ai glicogeni che sono più ramificati / hanno catene esterne più corte. La reazione di colorazione dello iodio può quindi essere utilizzata per ottenere dati rapidi e qualitativi sul grado di ramificazione del glicogeno²². Il colore arancione-marrone si forma quando i complessi di glicogeno con iodio non sono particolarmente intensi. Tuttavia, lo sviluppo del colore può essere migliorato dall'inclusione della soluzione satura di cloruro di calcio²². Ciò aumenta la sensibilità del metodo di circa 10 volte e consente un'analisi pronta delle quantità di microgrammi di glicogeno. Il saggio per la determinazione della ramificazione descritto nella sezione 4 del protocollo, di seguito, è adattato da una procedura sviluppata da Krisman²². Viene condotto semplicemente combinando il campione di glicogeno con soluzione di iodio e cloruro di calcio in una cuvetta e raccogliendo lo spettro di assorbimento da 330 nm a 800 nm. Il massimo di assorbanza si sposta verso lunghezze d'onda più lunghe man mano che il grado di ramificazione diminuisce.

Collettivamente, i metodi qui descritti forniscono mezzi semplici e affidabili per valutare le attività degli enzimi chiave del metabolismo del glicogeno e per ottenere dati qualitativi sull'entità della ramificazione del glicogeno.

Protocollo

1. Determinazione dell'attività della glicogeno sintasi

1. Preparare le soluzioni madre dei reagenti necessari come indicato nella Tabella 1 (prima della giornata sperimentale).

Componente	Indicazioni
50 mM Tris pH 8,0	Sciogliere 0,61 g di Tris base in ~ 80 mL di acqua.  Raffreddare a 4 °C.   Regolare il pH a 8,0 con HCl e portare il volume a 100 ml con acqua.
Tampone HEPES da 20 mM	Sciogliere 0,477 g di HEPES in ~ 80 ml di acqua.  Regolare il pH a 7,0 con NaOH e portare il volume a 100 ml con acqua.
132 mM Tris/32 mM KCl tampone pH 7,8	Sciogliere 1,94 g di Tris base e 0,239 g di KCl in ~90 mL di acqua.  Regolare il pH a 7,8 con HCl e portare il volume a 100 ml con acqua.
0,8% p/v glicogeno ostrica	Pesare 80 mg di glicogeno ostrica e aggiungere all'acqua.  Portare il volume finale fino a 10 ml con acqua e riscaldare delicatamente/mescolare per sciogliere completamente il glicogeno.
100 mM UDP-glucosio	Sciogliere 0,31 g di UDP-glucosio in acqua e portare il volume finale a 1 ml.  Conservare in aliquote, congelato a -20 °C.   Stabile per diversi mesi.
50 mM di ATP	Sciogliere 0,414 g di ATP in ~ 13 ml di acqua.  Regolare il pH a 7,5 con NaOH e portare il volume a 15 ml con acqua.  Conservare in aliquote congelate a -20 °C.   Stabile per diversi mesi.
100 mM glucosio-6-fosfato pH 7,8	Sciogliere 0,282 g di glucosio-6-fosfato in ~ 7 a 8 ml di acqua.  Regolare il pH a 7,8 con NaOH.  Portare il volume a 10 ml con acqua.  Conservare congelato in aliquote a -20 °C.   Stabile per almeno sei mesi.
40 mM fosfoenolpiruvato	Sciogliere 4 mg di fosfoenolpiruvato in 0,5 mL di tampone HEPES 20 mM pH 7,0.  Conservare a -20 °C.   Stabile per almeno 1 settimana.
0,5 M MnCl2	Sciogliere 9,90 g di MnCl2 in un volume finale di 100 mL di acqua.
NDP chinasi	Ricostituire la polvere liofilizzata con acqua sufficiente a dare 1 U/μl di soluzione.  Preparare aliquote, congelare in azoto liquido e conservare a -80 °C.   Stabile da almeno 1 anno.

Tabella 1: Soluzioni madre necessarie per il dosaggio dell'attività della glicogeno sintasi.

2. Il giorno del test, preparare una nuova soluzione di lavoro di 4 mM NADH sciogliendo 4,5 mg di NADH in 1,5 mL di 50 mM Tris-HCl, pH 8,0. Conservare in ghiaccio, al riparo dalla luce.
3. Scongelare sul ghiaccio soluzioni stock di UDP-glucosio, ATP, fosfoenolpiruvato e NDP chinasi.
4. Preriscaldare un bagno d'acqua a 30 °C.
5. Impostare ciascun test della glicogeno sintasi in una provetta da 1,5 mL aggiungendo i reagenti della miscela di reazione elencati nella Tabella 2.

Componente	Volume (μl)
Tampone 160 mM Tris/32 mM KCl pH 7,8	250
Acqua	179
100 mM glucosio-6-fosfato, pH 7,8	58
0,8 % p/v di glicogeno ostrica	67
50 mM di ATP	80
4 mM NADH	80
100 mM UDP-glucosio	28
40 mM fosfoenolpiruvato	20
0,5 M MnCl2	8
Volume finale	770

Tabella 2: Miscela di reazione di composizione per il dosaggio dell'attività della glicogeno sintasi.

NOTA: Per facilitare la messa a punto, è possibile creare un master mix contenente un numero sufficiente di ciascuno dei reagenti sopra elencati per completare il numero di saggi pianificati.

6. Preparare una reazione in bianco, in cui il NADH nella miscela sopra viene sostituito con acqua. Trasferire in una cuvetta di metacrilato usa e getta e utilizzarla per impostare lo zero sullo spettrofotometro a 340 nm.
7. Prelevare 770 μL dell'aliquota della miscela di reazione in una provetta da 1,5 ml. Aggiungere 2 μL di NDP chinasi e 2 μL di piruvato chinasi/lattato deidrogenasi, mescolare delicatamente e incubare a 30 °C per 3 minuti per preriscaldare la miscela di reazione.
8. Aggiungere 30 μL del campione contenente glicogeno sintasi in 20 mM di tampone Tris, pH 7,8; mescolare e trasferire la miscela di reazione in una cuvetta di metacrilato usa e getta.
9. Posizionare la cuvetta nello spettrofotometro e registrare l'assorbanza a 340 nm a intervalli di tempo per 10-20 minuti. Traccia le assorbanze ottenute contro il tempo.
   NOTA: Deve essere condotta una reazione in cui il campione di glicogeno sintasi viene sostituito con tampone Tris 20 mM per controllare l'ossidazione non enzimatica del NADH. A seconda della purezza del campione, possono essere necessarie altre reazioni di controllo. Vedere Discussione per i dettagli.
10. Determinare la velocità di reazione (vedere Risultati per i dettagli).

2. Determinazione dell'attività della glicogeno fosforilasi

1. Preparare le soluzioni madre come indicato nella Tabella 3 (prima della giornata sperimentale).

Componente	Indicazioni
125 mM TUBI pH 6,8	Sciogliere 3,78 g di PIPES in acqua.  Regolare il pH a 6,8 con NaOH e portare il volume a 100 ml con acqua.
8% p/v glicogeno ostrica	Pesare 0,8 g di glicogeno ostrica e aggiungere all'acqua.  Portare il volume finale a 10 ml con acqua e riscaldare delicatamente/mescolare per sciogliere il glicogeno.  Conservare congelato a -20 °C.
200 mM Na fosfato pH 6,8	Sciogliere 2,63 g di Na 2 HPO4,7H 2 O e 1,41 g di NaH2PO4. H2O in acqua.  Portare il volume a 100 ml con acqua.
1 mM di glucosio-1,6-bisfosfato	Sciogliere 2 mg di glucosio-1,6-bisfosfato in 4 ml di acqua.  Aliquote e conservare congelati a -20 °C.   Stabile per almeno diversi mesi.
10 mM NADP	Sciogliere 23 mg di NADP in 3 ml di acqua.  Aliquote e conservare congelati a -20 °C.   Stabile per almeno diversi mesi.

Tabella 3: Soluzioni madre necessarie per il dosaggio dell'attività della glicogeno fosforilasi.

2. Preriscaldare un bagno d'acqua a 30 °C
3. Impostare ciascun saggio della glicogeno fosforilasi in una provetta da 1,5 mL aggiungendo i reagenti della miscela di reazione elencati di seguito (Tabella 4).

Componente	Volume (μl)
Tampone PIPES 125 mM pH 6,8	160
Acqua	70
8% p/v glicogeno ostrica	100
200 mM Na fosfato 6,8	400
1 mM di glucosio-1,6-bisfosfato	20
10 mM NADP	20
Volume finale	770

Tabella 4: Miscela di reazione di composizione per il dosaggio dell'attività della glicogeno fosforilasi.

NOTA: Per facilitare la messa a punto, è possibile creare un master mix contenente un numero sufficiente di ciascuno dei reagenti sopra elencati per completare il numero di saggi pianificati.

5. Preparare una reazione in bianco contenente i componenti elencati nella tabella 4 , ma aggiungere altri 30 μL di tampone PIPES da 25 mM, pH 6,8 (preparato diluendo 125 mM tampone PIPES 1/5 con acqua). Trasferire in una cuvetta di metacrilato monouso e utilizzare per impostare lo zero sullo spettrofotometro a 340 nm.
6. Prelevare un'aliquota da 770 μL di miscela di reazione in una provetta da 1,5 ml. Aggiungere 1 μL di glucosio-6-fosfato deidrogenasi e 1 μL di fosfoglucomutasi, mescolare delicatamente e incubare a 30 °C per 3 minuti per preriscaldare la miscela di reazione.
7. Aggiungere 30 μL del campione contenente glicogeno fosforilasi in tampone PIPES da 25 mM, pH 6,8. Mescolare e trasferire la miscela di reazione in una cuvetta di metacrilato monouso.
8. Posizionare la cuvetta nello spettrofotometro e registrare l'assorbanza a 340 nm a intervalli di tempo per 10-20 minuti. Traccia le assorbanze ottenute contro il tempo.
   NOTA: Deve essere inclusa una reazione in cui la glicogeno fosforilasi viene sostituita con tampone PIPES da 25 mM. A seconda della purezza del campione di glicogeno fosforilasi, possono essere necessari anche altri controlli (vedere Discussione per i dettagli).
9. Determinare la velocità di reazione (vedere Risultati rappresentativi per i dettagli).

3. Determinazione dell'attività dell'enzima deramificante del glicogeno

1. Preparare le soluzioni madre come indicato nella Tabella 5 (prima della giornata sperimentale).

Componente	Indicazioni
Tampone maleato da 100 mM	Sciogliere 1,61 g di acido maleico in ~ 80 ml di acqua.  Regolare il pH a 6,6 con NaOH e portare il volume finale a 100 ml con acqua.
300 mM trietanolammina cloridrato/ 3 mM MgSO4 pH 7,5	Sciogliere 27,85 g di trietanolammina cloridrato e 0,370 g di MgSO4. 7H2O in ~ 400 ml di acqua.  Regolare il pH a 7,5 con NaOH e portare a un volume finale di 500 ml con acqua.
150 mM ATP/12 mM NADP	Sciogliere 1,24 g di ATP in ~ 10 ml di acqua.  Monitorare il pH e aggiungere NaOH per mantenere un pH di ~ 7,5 mentre l'ATP si dissolve.  Aggiungere 0,138 g di NADP.  Regolare il pH a ~ 7,5 con NaOH e portare a un volume finale di 15 ml con acqua. Conservare in aliquote a – 20 °C. Stabile per diversi mesi.
50 mM tampone fosfato Na pH 6,8	Sciogliere 32,81 g di Na 2 HPO4,7H 2 O e 17,61 g di NaH2PO4. H2O in acqua.  Portare il volume fino a un volume finale di 5 L con acqua.

Tabella 5: Soluzioni madre necessarie per il dosaggio dell'attività dell'enzima deramificante del glicogeno.

2. Preparare la destrina limite fosforilasi
   1. Sciogliere 0,3 g di glicogeno ostrica in 10 ml di tampone fosfato di sodio da 50 mM, pH 6,8.
   2. Sciogliere una quantità sufficiente di polvere di fosforilasi A liofilizzata per produrre 60 U di attività in tampone fosfato da 50 mM, pH 6,8.
      NOTA: A seconda del lotto di fosforilasi A acquistato, la massa necessaria varierà ma è generalmente compresa tra 5 e 10 mg di polvere.
3. Aggiungere 60 U di fosforilasi A alla soluzione di glicogeno e trasferire in una sacca per dialisi. Dialisi a temperatura ambiente contro 1 L di tampone fosfato di sodio da 50 mM, pH 6,8 per 8 ore. Passare al tampone per dialisi fresco e continuare l'incubazione durante la notte.
4. Aggiungere altri 10 U di fosforilasi A e passare a tampone per dialisi fresco. Dopo le 8 ore, passare nuovamente al tampone per dialisi fresco e continuare l'incubazione durante la notte.
5. Trasferire il contenuto della sacca di dialisi in una provetta da centrifuga e far bollire per 10 minuti. Raffreddare sul ghiaccio, quindi centrifugare a 10.000 x g per 15 minuti.
6. Trasferire il surnatante in una sacca per dialisi e dializzarlo per 8 ore contro tre cambi di 2 L di acqua distillata.
7. Trasferire il contenuto della sacca per dialisi in una provetta da centrifuga da 50 ml. Misurare il volume e aggiungere due volumi di etanolo assoluto ghiacciato per precipitare la destrina limite. Lasciare riposare il tubo sul ghiaccio per 30 minuti.
   NOTA: Un precipitato bianco dovrebbe iniziare a formarsi immediatamente dopo l'aggiunta di etanolo ma, in caso contrario, aggiungere una goccia di 3 M NaCl.
8. Centrifugare a 15.000 x g per 15 minuti ed eliminare il surnatante. Risciacquare il pellet bianco di destrina limite due volte con etanolo al 66% v / v, utilizzando ~ 30 ml per ogni risciacquo.
9. Trasferire la destrina limite in un mortaio e lasciare asciugare completamente all'aria. Quando la destrina limite è asciutta, macinare in polvere con un pestello e trasferire in una nave adatta per la conservazione; asciugare a 4 °C.
10. Per l'uso come substrato enzimatico deramificante, preparare una soluzione all'1% p/v in acqua.
11. Preriscaldare un bagno d'acqua a 30 °C.
12. Preriscaldare un blocco riscaldante o un bagno d'acqua a 95 °C.
13. Preparare quattro provette da 1,5 ml contenenti ciascuna 100 μL di tampone maleato, 80 μL di destrina limite fosforilasi e 10 μL di acqua. Queste provette saranno utilizzate per condurre il saggio enzimatico deramificante. Etichettare due dei tubi Reazione e gli altri due tubi Controllo.
14. A intervalli di tempo, aggiungere 10 μL del campione dell'enzima deramificante alle provette di reazione e 10 μL di tampone che è stato utilizzato per preparare il campione dell'enzima ramificata alle provette di controllo. Incubare a 30 °C.
15. In punti temporali definiti (ad es. incubazione di 5, 10 e 20 minuti), prelevare 50 μL da ciascun tubo di reazione e controllo e inserirli immediatamente nel blocco riscaldante o nel bagno d'acqua a 95 °C. Riscaldare per 3 min.
16. Centrifugare a 15.000 x g per 2 minuti per rimuovere le proteine precipitate.
    NOTA: a questo punto, la procedura può essere interrotta se necessario. I campioni riscaldati possono essere conservati congelati a -20 °C fino a procedere alla misurazione del glucosio rilasciato (fase 17, sotto).
17. Misurazione del glucosio rilasciato
    1. Trasferire 40 μL di surnatante dai campioni riscaldati alle cuvette di metacrilato monouso e aggiungere 833 μL di tampone trietanolammina cloridrato/solfato di magnesio, 67 μL di miscela NADP/ATP e 60 μL di acqua. Mescolare pipettando su e giù delicatamente, facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria.
       NOTA: Per facilitare la messa a punto, è possibile creare un master mix contenente un numero sufficiente di ciascuno dei reagenti sopra elencati per completare il numero di saggi pianificati.
    2. Preparare una reazione in bianco combinando 100 μL di tampone maleato, 80 μL di destrina limite fosforilasi e 20 μL di acqua. Mescolare bene e trasferire 40 μL in una cuvetta di metacrilato usa e getta. Aggiungere 833 μL di trietanolammina cloridrato/solfato di magnesio, ecc. come descritto al punto 3.17.1.
    3. Impostare lo zero sullo spettrofotometro a 340 nm usando la reazione in bianco.
    4. Aggiungere 0,5 μL di glucosio-6-fosfato deidrogenasi a ciascuna cuvetta. Mescolare delicatamente pipettando su e giù lentamente. Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti, quindi registrare l'assorbanza a 340 nm.
       NOTA: I valori di assorbimento devono essere bassi, il che significa poca contaminazione dei campioni con glucosio-6-fosfato.
    5. Aggiungere 0,5 μL di esochinasi a ciascuna cuvetta. Mescolare delicatamente pipettando su e giù lentamente. Incubare a temperatura ambiente per 15 minuti, quindi registrare l'assorbanza a 340 nm.
    6. Continuare l'incubazione a temperatura ambiente per altri 5 minuti. Registrare nuovamente l'assorbanza a 340 nm. Se l'assorbimento è aumentato rispetto a quello registrato a 15 minuti, continuare l'incubazione per altri 5 minuti e controllare nuovamente l'assorbimento. Registrare l'assorbimento finale a 340 nm ottenuto.
    7. Per ciascun campione, sottrarre l'assorbanza a 340 nm registrata dopo l'aggiunta di glucosio-6-fosfato deidrogenasi dall'assorbanza finale ottenuta dopo aggiunta di esochinasi. Tracciare i valori ottenuti rispetto al periodo di tempo in cui il campione corrispondente è stato incubato con enzima deramificante.

4. Determinazione dell'attività enzimatica di ramificazione del glicogeno

1. Prima della giornata sperimentale, preparare la soluzione di iodio/KI sciogliendo prima 2,6 g di KI in 10 ml di acqua. In una cappa aspirante, pesare 0,26 g di iodio e aggiungere alla soluzione KI.
   ATTENZIONE: Lo iodio è dannoso a contatto con la pelle o se inalato. Mescolare per sciogliere lo iodio e conservare a 4 °C, al riparo dalla luce. Preparare anche tampone PIPES da 125 mM, pH 6,8 (vedere Tabella 3).
2. Quando si iniziano gli esperimenti, fare uno stock di lavoro di reagente di iodio acidificato.
   1. Prelevare 45,7 ml di acqua in un tubo da 50 ml e aggiungere 150 μL di soluzione di iodio/KI seguita da 150 μL di 1 M HCl.
   2. Mescolare bene e conservare a 4 °C, al riparo dalla luce. La soluzione è stabile per almeno 3 giorni in queste condizioni.
3. Il giorno dell'esperimento, preparare una soluzione fresca da 10 mg / ml di amilosio.
   1. Pesare 50 mg di amilosio e trasferirli in un tubo da 15 ml.
   2. Aggiungere 200 μL di etanolo assoluto e agitare delicatamente.
   3. Aggiungere 500 μL di 2 M KOH e agitare delicatamente.
      ATTENZIONE: KOH provoca gravi ustioni cutanee e danni agli occhi. Utilizzare adeguati dispositivi di protezione individuale.
   4. Aggiungere 0,5 ml di acqua agitando delicatamente. Se l'amilosio non si dissolve completamente, aggiungere altri 0,5 ml di acqua.
   5. Regolare il pH da ~ 6,5 a 7,0 con 1 M HCl.
      ATTENZIONE: HCl può causare irritazione agli occhi, alla pelle e al tratto respiratorio. Utilizzare adeguati dispositivi di protezione individuale.
   6. Aggiungere acqua per raggiungere un volume finale di 5 ml.
   7. Sterilizzare mediante passaggio attraverso un filtro terminale della siringa da 0,2 μm e conservare a temperatura ambiente. Non raffreddare o congelare.
4. Preriscaldare un bagno d'acqua a 30 °C.
5. Preparare dodici provette da 1,5 ml, ciascuna contenente 1 mL di reagente di iodio acidificato. Mettere da parte sulla panchina. Questi saranno usati per fermare la reazione enzimatica ramificata.
6. Preparare quattro provette da 1,5 ml contenenti ciascuna 150 μL di amilosio, 150 μL di tampone PIPES e 45 μL di acqua. Questi tubi saranno utilizzati per condurre il saggio enzimatico ramificato. Etichettare due dei tubi Reazione e gli altri due tubi Controllo.
7. A intervalli di tempo, aggiungere 5 μL di campione enzimatico ramificato alle provette di reazione e 5 μL di tampone utilizzato per preparare il campione di enzimi ramificati alle provette di controllo. Incubare a 30 °C.
8. In punti temporali definiti (ad esempio, 5, 10 e 15 minuti di incubazione), prelevare 10 μL da ciascuna provetta di reazione e controllo e aggiungere alle provette da 1,5 mL che contengono 1 mL di reagente di iodio acidificato. Aggiungere altri 140 μL di acqua e mescolare bene. Trasferimento in cuvette usa e getta.
   NOTA: i campioni devono essere di colore blu e la soluzione deve essere priva di precipitato. Il colore formato è stabile per almeno 2 ore a temperatura ambiente.
9. Preparare un campione contenente 1 mL di reagente di iodio acidificato e 150 μL di acqua. Mescolare bene e trasferire in una cuvetta. Utilizzare questa cuvetta per impostare lo zero sullo spettrofotometro a 660 nm.
10. Leggere l'assorbanza di ciascuno dei dodici campioni a 660 nm. Determinare la velocità della reazione enzimatica ramificata sottraendo l'assorbanza ottenuta in presenza di enzima ramificante (Reazione) dall'assorbanza quando non è presente alcun enzima ramificante (Controllo) in ogni punto temporale. Per informazioni dettagliate, vedere Risultati rappresentativi.

5. Valutazione qualitativa della ramificazione del glicogeno

1. Preparare la soluzione satura di cloruro di calcio aggiungendo 74,5 g di cloruro di calcio anidro a ~ 40 ml di acqua e mescolando. Aggiungere ancora un po' d'acqua e continuare a mescolare. Portare il volume a 100 mL con acqua e continuare a mescolare fino a quando il CaCl₂ è completamente sciolto.
2. Preparare una riserva di lavoro di reagente colorante iodio/CaCl 2 mescolando 50 μL di soluzione madre di KI/iodio (vedere il punto 4.1, sopra) con 13 mL di soluzione satura di CaCl₂ in una provetta da 15 ml. Mescolare bene e conservare a 4 °C, al riparo dalla luce. La soluzione è stabile per almeno 1 settimana in queste condizioni.
3. Determinazione della ramificazione
   1. In una provetta da 1,5 ml, combinare 650 μL di reagente colorato iodio/CaCl₂ con 100 μL di acqua e mescolare accuratamente. Trasferire la soluzione in una cuvetta di metacrilato monouso.
      NOTA: La soluzione nella cuvetta deve essere limpida e di colore giallo pallido.
   2. Posizionare lo spettrofotometro e, eseguendo in modalità di scansione della lunghezza d'onda, raccogliere uno spettro di fondo da 330 nm a 800 nm.
   3. In una provetta da 1,5 ml, combinare 650 μL di reagente colorante iodio/CaCl₂ funzionante con 50 μg di glicogeno ostrica. Portare il volume finale a 750 μL con acqua e mescolare accuratamente. Trasferire la soluzione in una cuvetta di metacrilato monouso.
      NOTA: La soluzione nella cuvetta deve essere limpida e di colore arancione/marrone intenso.
   4. Inserire lo spettrofotometro e raccogliere uno spettro di assorbimento da 330 nm a 800 nm.
   5. Ripetere i punti da 4.4.3 a 4.4.4 con 50 μg di amilopectina e 30 μg di amilosio.
      NOTA: Il campione di amilopectina deve essere giallo/verde e il campione di amilosio deve essere verde/blu. Entrambi i campioni dovrebbero essere chiari. I complessi colorati formati sono stabili, senza variazioni nello spettro di assorbimento, per almeno 1 h a temperatura ambiente.
   6. Per ottenere un'indicazione della struttura ramificata di un campione di glicogeno non caratterizzato, combinare da 25 μg a 50 μg di glicogeno con 650 μL di reagente colorante iodio/CaCl₂ funzionante. Procedere come sopra, portando il volume a 750 μL con acqua, mescolando accuratamente e trasferendo in una cuvetta di metacrilato.
      NOTA: Il campione di glicogeno dovrebbe produrre un colore da giallo/arancione ad arancione/marrone a seconda del grado di ramificazione (lunghezza delle catene esterne) del glicogeno presente. Ancora una volta, il campione dovrebbe essere chiaro. Per informazioni dettagliate, vedere Risultati rappresentativi .
   7. Raccogli lo spettro di assorbimento.

Risultati

Determinazione dell'attività della glicogeno sintasi
La figura 1 mostra risultati rappresentativi dei saggi della glicogeno sintasi utilizzando enzimi purificati. Nel pannello A, a seguito di un leggero ritardo, si è verificata una diminuzione lineare dell'assorbimento a 340 nm nel tempo per un periodo di circa 12 minuti. Il tasso di variazione dell'assorbimento nella Figura 1A era ~0,12 unità di assorbanza/min. Un tasso di variazione dell...

Discussione

In generale, i principali vantaggi di tutti i metodi presentati sono il loro basso costo, la facilità, la velocità e la mancanza di dipendenza da attrezzature specializzate. Il principale svantaggio che tutti condividono è la sensibilità rispetto ad altri metodi disponibili. La sensibilità delle procedure che comportano la produzione o il consumo di NADH / NADPH è facile da stimare. Dato che il coefficiente di estinzione di NADH / NADPH è 6,22 M-1 cm-1, l'aritmetica semplice indica che ~ ^10-20 μM i cam...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amylopectin (amylose free) from waxy corn	Fisher Scientific	A0456
Amylose	Biosynth Carbosynth	YA10257
ATP, disodium salt	MilliporeSigma	A3377
D-Glucose-1,6-bisphosphate, potassium salt	MilliporeSigma	G6893
D-glucose-6-phosphate, sodium salt	MilliporeSigma	G7879
Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Grade I, from yeast	MilliporeSigma	10127655001
Glycogen, Type II from oyster	MilliporeSigma	G8751
Hexokinase	MilliporeSigma	11426362001
Methacrylate cuvettes, 1.5 mL	Fisher Scientific	14-955-128	Methacrylate is required since some procedures are conducted at 340 nm or below
β-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium salt	MilliporeSigma	N0505
β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt	MilliporeSigma	43420
Nucleoside 5'-diphosphate kinase	MilliporeSigma	N0379
Phosphoenolpyruvate, monopotassium salt	MilliporeSigma	P7127
Phosphoglucomutase from rabbit muscle	MilliporeSigma	P3397
Phosphorylase A from rabbit muscle	MilliporeSigma	P1261
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle	MilliporeSigma	P0294
UDP-glucose, disodium salt	MilliporeSigma	U4625