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Resumo

Técnicas para medir a atividade de enzimas-chave do metabolismo do glicogênio são apresentadas, usando um espectrofotômetro simples operando na faixa visível.

Resumo

O glicogênio é sintetizado como uma forma de armazenamento de glicose por uma ampla gama de organismos, variando de bactérias a animais. A molécula compreende cadeias lineares de resíduos de glicose ligados a α1,4 com ramos introduzidos através da adição de ligações α1,6. Compreender como a síntese e degradação do glicogênio são reguladas e como o glicogênio atinge sua estrutura ramificada característica requer o estudo das enzimas de armazenamento de glicogênio. No entanto, os métodos mais comumente usados para estudar essas atividades enzimáticas normalmente empregam reagentes ou técnicas que não estão disponíveis para todos os investigadores. Aqui, discutimos uma bateria de procedimentos que são tecnicamente simples, econômicos e, ainda assim, capazes de fornecer informações valiosas sobre o controle do armazenamento de glicogênio. As técnicas requerem acesso a um espectrofotômetro, operando na faixa de 330 a 800 nm, e são descritas assumindo que os usuários empregarão cuvetes plásticas descartáveis. No entanto, os procedimentos são facilmente escaláveis e podem ser modificados para uso em um leitor de microplacas, permitindo análises altamente paralelas.

Introdução

O glicogênio é amplamente distribuído na natureza, com o composto sendo encontrado em bactérias, muitos protistas, fungos e animais. Nos microrganismos, o glicogênio é importante para a sobrevivência celular quando os nutrientes são limitantes e, em organismos superiores, como mamíferos, a síntese e a degradação do glicogênio servem para tamponar os níveis de glicose no sangue 1,2,3. O estudo do metabolismo do glicogênio é, portanto, de importância para campos tão diversos como a microbiologia e a fisiologia dos mamíferos. Compreender o metabolismo do glicogênio requer estudar as principais enzimas da síntese de glicogênio (glicogênio sintase e a enzima ramificada) e degradação do glicogênio (glicogênio fosforilase e enzima desramificadora). Os ensaios padrão-ouro de glicogênio sintase, fosforilase, atividades enzimáticas ramificadas e desramificantes empregam isótopos radioativos. Por exemplo, a glicogênio sintase é geralmente medida em um ensaio radioquímico interrompido seguindo a incorporação de glicose de UDP-[14 C]glicose (no caso de enzimas animais e fúngicas) ou ADP-[14C]glicose (no caso de enzimas bacterianas) no glicogênio 4,5. Da mesma forma, a glicogênio fosforilase é medida na direção da síntese de glicogênio, após a incorporação de glicose de [14C]glicose-1-fosfato em glicogênio6. A enzima ramificada é ensaiada medindo a capacidade desta enzima de estimular a incorporação de [14 C]glicose da glicose-1-fosfato em cadeias ligadas a α1,4 pela glicogênio fosforilase7, e a atividade enzimática de desramificação é determinada seguindo a capacidade da enzima de incorporar [14C]glicose no glicogênio8 . Embora muito sensíveis, permitindo seu uso em extratos de células brutas com baixos níveis de atividade enzimática, os substratos radioativos são caros e sujeitos aos requisitos regulatórios inerentes ao uso de radioisótopos. Essas barreiras colocam o uso de certos ensaios fora do alcance de muitos trabalhadores. No entanto, ao longo de muitos anos, uma impressionante variedade de abordagens espectrofotométricas para a medição dessas enzimas foram descritas. Em geral, essas abordagens dependem da medição da produção ou consumo de NADH / NADPH, ou a geração de complexos coloridos entre glicogênio e iodo. Assim, eles são simples e podem ser realizados usando espectrofotômetros simples equipados apenas com lâmpadas de tungstênio ou xenônio.

Os ensaios espectrofotométricos da glicogênio sintase dependem da medição do difosfato nucleosídeo liberado do doador de nucleotídeos de açúcar à medida que a glicose é adicionada à crescente cadeia de glicogênio 9,10. O procedimento para medir a atividade da glicogênio sintase descrito na seção 1 do protocolo, abaixo, é uma modificação do delineado por Wayllace et al.11, e o esquema de acoplamento é mostrado abaixo:

(Glicose) n + UPD-glicose → (Glicose)n+1 + UDP

UDP + ATP → ADP + UTP

ADP + fosfoenolpiruvato → piruvato + ATP

Piruvato + NADH + H + Lactato de → + NAD +

A glicogênio sintase adiciona glicose da UDP-glicose ao glicogênio. O UDP gerado neste processo é convertido em UTP pelo nucleosídeo difosfato quinase (NDP quinase), em uma reação que gera ADP. O ADP, por sua vez, serve então como substrato para a piruvato quinase, que fosforila o ADP usando fosfoenolpiruvato como doador de fosfato. O piruvato resultante é convertido em lactato pela enzima lactato desidrogenase em uma reação que consome NADH. O ensaio pode, portanto, ser realizado de forma contínua, monitorando a diminuição da absorvância a 340 nm à medida que o NADH é consumido. É prontamente adaptado para uso com enzimas que requerem ADP-glicose como um doador de glicose. Aqui, as etapas de acoplamento são mais simples, uma vez que o ADP liberado pela ação da glicogênio sintase é diretamente atuado pela piruvato quinase.

Há uma variedade de ensaios espectrofotométricos disponíveis para a determinação da atividade da glicogênio fosforilase. Na versão clássica, a enzima é conduzida para trás, na direção da síntese de glicogênio, como mostrado abaixo:

(Glicose) n + Glicose-1-fosfato → (Glicose)n+1 + Pi

Em intervalos cronometrados, as alíquotas da mistura reacional são removidas e a quantidade de fosfato liberado é quantificada12,13. Em nossas mãos, este ensaio tem sido de uso limitado devido à presença de fosfato livre prontamente mensurável em muitas preparações comerciais de glicose-1-fosfato, combinado com as altas concentrações de glicose-1-fosfato necessárias para a ação da fosforilase. Em vez disso, temos empregado rotineiramente um ensaio alternativo que mede a glicose-1-fosfato liberado à medida que o glicogênio é degradado pela fosforilase13. Um esquema de reação acoplado, ilustrado abaixo, é empregado.

(Glicose) n + Pi → (Glicose)n-1 + Glicose-1-fosfato

Glicose-1-fosfato → Glicose-6-fosfato

Glicose-6-fosfato + NADP+ → 6-fosfogluconolactona + NADPH + H+

A glicose-1-fosfato é convertida em glicose-6-fosfato pela fosfoglucomutase, e a glicose-6-fosfato é então oxidada em 6-fosfogluconolactona, com a concomitante redução de NADP+ para NADPH. O procedimento detalhado na seção 2 do protocolo, a seguir, é derivado dos métodos descritos por Mendicino et al.14 e Schreiber & Bowling 15. O ensaio pode ser prontamente realizado de forma contínua, com o aumento da absorbância a 340 nm ao longo do tempo, permitindo a determinação da taxa de reação.

A determinação espectrofotométrica da atividade enzimática desramificadora baseia-se na mensuração da glicose liberada pela ação da enzima sobre a dextrina limite de fosforilase16. Este composto é feito através do tratamento exaustivo do glicogênio com glicogênio fosforilase. Uma vez que a ação da glicogênio fosforilase pára 4 resíduos de glicose de distância de um ponto de ramificação α1,6, a dextrina limite contém glicogênio, cujas cadeias externas foram encurtadas para ~ 4 resíduos de glicose. O preparo da dextrina limite de fosforilase é descrito aqui, utilizando-se um procedimento derivado daqueles desenvolvidos por Taylor et al.17 e Makino & Omichi 18.

A desramificação é um processo de duas etapas. A atividade da 4-α-glucanotransferase da enzima desramificadora bifuncional primeiro transfere três resíduos de glicose do ponto de ramificação para a extremidade não redutora de uma cadeia de glicose ligada a α1,4 próxima. O único resíduo de glicose ligado a α1,6 remanescente no ponto de ramificação é então hidrolisado pela atividade da α1,6-glucosidase19. O ensaio é tipicamente realizado de forma interrompida, a glicose liberada após um determinado tempo (ou série de vezes) sendo medida em um ensaio enzimático acoplado, conforme mostrado abaixo:

(Glicose) n → (Glicose)n-1 + Glicose

Glicose + ATP → Glicose-6-fosfato + ADP

Glicose-6-fosfato + NADP+ → 6-fosfogluconolactona + NADPH + H+

A determinação do NADPH produzido fornece uma medida da produção de glicose. O procedimento descrito na seção 3 do protocolo, a seguir, baseia-se em um descrito por Nelson et al.16. Como os outros métodos que dependem do consumo ou geração de NADH / NADPH, o ensaio é bastante sensível. No entanto, a presença de amilases ou outras glucosidases, que também podem liberar glicose livre da dextrina limite de fosforilase, causará interferência significativa (ver Discussão).

A determinação colorimétrica da atividade enzimática ramificada baseia-se no fato de que cadeias de glicose ligadas a α1,4 adotam estruturas helicoidais que se ligam ao iodo, formando complexos coloridos20. A cor do complexo formado depende do comprimento das cadeias ligadas a α1,4. Assim, a amilose, que consiste em cadeias longas, em grande parte não ramificadas, de glicose ligada a α1,4, forma um complexo azul profundo com iodo. Em contraste, os glicogênios, cujas cadeias externas são geralmente da ordem de apenas 6 a 8 resíduos de glicose de comprimento, formam complexos vermelho-alaranjados. Se uma solução de amilose é incubada com enzima ramificada, a introdução de ramos na amilose resulta na geração de cadeias de glicose mais curtas ligadas a α1,4. Assim, o máximo de absorção dos complexos amilose/iodo muda para comprimentos de onda mais curtos. O procedimento discutido aqui é derivado do detalhado por Boyer & Preiss21 e a atividade enzimática ramificada é quantificada como uma redução na absorção do complexo amilose/iodo a 660 nm ao longo do tempo.

Como deve ser facilmente aparente a partir da discussão acima, o fato de que as cores dos complexos formados entre as cadeias de iodo e α1,4-glicose variam com o comprimento da cadeia significa que os espectros de absorvância dos complexos glicogênio/iodo devem variar com o grau de ramificação do glicogênio. Este é de fato o caso, e glicogênios / glicogênios menos ramificados com cadeias externas mais longas absorvem a luz em um comprimento de onda mais longo do que os glicogênios que são mais ramificados / têm cadeias externas mais curtas. A reação de coloração de iodo pode, portanto, ser usada para obter dados qualitativos rápidos sobre o grau de ramificação do glicogênio22. A cor laranja-marrom se forma quando os complexos de glicogênio com iodo não são particularmente intensos. No entanto, o desenvolvimento da cor pode ser potencializado pela inclusão de solução saturada de cloreto de cálcio22. Isso aumenta a sensibilidade do método cerca de 10 vezes e permite a análise pronta das quantidades de microgramas de glicogênio. O ensaio para a determinação da ramificação descrito na seção 4 do protocolo, a seguir, é adaptado de um procedimento desenvolvido por Krisman22. É realizado simplesmente combinando a amostra de glicogênio com solução de iodo e cloreto de cálcio em uma cubeta e coletando o espectro de absorção de 330 nm a 800 nm. A absorbância máxima muda para comprimentos de onda mais longos à medida que o grau de ramificação diminui.

Coletivamente, os métodos aqui descritos fornecem meios simples e confiáveis de avaliar as atividades das principais enzimas do metabolismo do glicogênio e de obter dados qualitativos sobre a extensão da ramificação do glicogênio.

Protocolo

1. Determinação da atividade da glicogênio sintase

  1. Preparar soluções-mãe dos reagentes necessários, conforme indicado no quadro 1 (antes do dia experimental).
ComponenteTrajeto
50 mM Tris pH 8,0Dissolva 0,61 g de base Tris em ~ 80 mL de água.  Arrefecer a 4 °C.   Ajuste o pH para 8,0 com HCl e faça o volume até 100 mL com água.
Buffer HEPES de 20 mMDissolva 0,477 g de HEPES em ~ 80 mL de água.  Ajuste o pH para 7,0 com NaOH e compense o volume para 100 mL com água.
Tampão KCl Tris/32 mM 132 mM pH 7,8Dissolva 1,94 g de base Tris e 0,239 g de KCl em ~90 mL de água.  Ajuste o pH para 7,8 com HCl e compense o volume para 100 mL com água.
0,8% p/v de glicogênio de ostraPese 80 mg de glicogênio de ostra e adicione à água.  Fazer o volume final até 10 mL com água e aquecer suavemente/misturar para dissolver totalmente o glicogênio.
100 mM UDP-glicoseDissolva 0,31 g de UDP-glicose em água e faça o volume final até 1 mL.  Conservar em alíquotas, congelado a -20 °C.   Estável por vários meses.
ATP de 50 mMDissolva 0,414 g de ATP em ~ 13 mL de água.  Ajuste o pH para 7,5 com NaOH e compense o volume para 15 mL com água.  Conservar em alíquotas congeladas a -20 °C.   Estável por vários meses.
100 mM glicose-6-fosfato pH 7,8Dissolva 0,282 g de glicose-6-fosfato em ~ 7 a 8 mL de água.  Ajuste o pH para 7,8 com NaOH.  Faça o volume até 10 mL com água.  Conservar congelado em alíquotas a -20 °C.   Estável por pelo menos seis meses.
40 mM fosfoenolpiruvatoDissolver 4 mg de fosfoenolpiruvato em 0,5 mL de tampão HEPES de 20 mM pH 7,0.  Conservar a -20 °C.   Estável por pelo menos 1 semana.
0,5 M MnCl2Dissolver 9,90 g de MnCl2 em um volume final de 100 mL de água.
NDP quinaseReconstituir pó liofilizado com água suficiente para dar 1 U/μl solução.  Preparar alíquotas, congelar em azoto líquido e armazenar a -80 °C.   Estável por pelo menos 1 ano.

Quadro 1: Soluções-mãe necessárias para o ensaio da actividade da glicogénio sintase.

  1. No dia do ensaio, preparar uma solução de trabalho fresca de 4 mM NADH dissolvendo 4,5 mg de NADH em 1,5 ml de 50 mM Tris-HCl, pH 8,0. Armazenar no gelo, protegido da luz.
  2. Descongelar soluções-estoque de UDP-glicose, ATP, fosfoenolpiruvato e NDP quinase no gelo.
  3. Pré-aqueça um banho-maria a 30 °C.
  4. Configure cada ensaio de glicogênio sintase em um tubo de 1,5 mL adicionando os reagentes da mistura de reação listados na Tabela 2.
ComponenteVolume (μl)
160 mM Tris/32 mM KCl tampão pH 7,8250
Água179
100 mM de glicose-6-fosfato, pH 7,858
0,8 % p/v de glicogênio de ostra67
ATP de 50 mM80
4 mM NADH80
100 mM UDP-glicose28
40 mM fosfoenolpiruvato20
0,5 M MnCl28
Volume final770

Tabela 2: Composição da mistura reacional para o ensaio da atividade da glicogênio sintase.

NOTA: Para facilitar a configuração, um master mix pode ser feito contendo o suficiente de cada um dos reagentes listados acima para completar o número de ensaios planejados.

  1. Prepare uma reação em branco, onde o NADH na mistura acima é substituído por água. Transfira para uma cubeta de metacrilato descartável e use-a para definir o zero no espectrofotômetro a 340 nm.
  2. Tome um 770 μL da alíquota da mistura de reação em um tubo de 1,5 mL. Adicionar 2 μL de quinase NDP e 2 μL de mistura piruvato quinase/lactato desidrogenase, misturar suavemente e incubar a 30 °C durante 3 min para pré-aquecer a mistura de reacção.
  3. Adicionar 30 μL da amostra contendo glicogénio sintase em tampão Tris de 20 mM, pH 7,8; misturar e transferir a mistura de reação para uma cubeta de metacrilato descartável.
  4. Coloque a cubeta no espectrofotômetro e registre a absorvância a 340 nm em intervalos cronometrados por 10 a 20 min. Plotar as absorvâncias obtidas em relação ao tempo.
    NOTA: Uma reação na qual a amostra de glicogênio sintase é substituída por tampão Tris de 20 mM deve ser conduzida para controlar a oxidação não enzimática do NADH. Dependendo da pureza da amostra, podem ser necessárias outras reações de controlo. Consulte Discussão para obter detalhes.
  5. Determine a taxa de reação (consulte Resultados para obter detalhes).

2. Determinação da atividade da glicogênio fosforilase

  1. Preparar as soluções-mãe indicadas no quadro 3 (antes do dia experimental).
ComponenteTrajeto
TUBOS 125 mM pH 6,8Dissolver 3,78 g de TUBOS em água.  Ajuste o pH para 6,8 com NaOH e compense o volume para 100 mL com água.
8% p/v de glicogênio de ostraPese 0,8 g de glicogênio de ostra e adicione à água.  Faça o volume final até 10 mL com água e aqueça suavemente/misture para dissolver o glicogênio.  Conservar congelado a -20 °C.
200 mM Fosfato de Na pH 6,8Dissolver 2,63 g de Na 2 HPO 4,7H 2 Oe 1,41 g de NaH2PO4. H2O na água.  Traga o volume até 100 mL com água.
1 mM de glicose-1,6-bisfosfatoDissolver 2 mg de glicose-1,6-bisfosfato em 4 mL de água.  Alíquota e conservar congelados a -20 °C.   Estável por pelo menos vários meses.
NADP de 10 mMDissolva 23 mg de NADP em 3 mL de água.  Alíquota e conservar congelados a -20 °C.   Estável por pelo menos vários meses.

Quadro 3: Soluções-mãe necessárias para o ensaio da actividade da glicogénio fosforilase.

  1. Pré-aqueça um banho-maria a 30 °C
  2. Configure cada ensaio de glicogênio fosforilase em um tubo de 1,5 mL, adicionando os reagentes da mistura de reação listados abaixo (Tabela 4).
ComponenteVolume (μl)
Tampão PIPES de 125 mM pH 6,8160
Água70
8% p/v de glicogênio de ostra100
200 mM Na fosfato 6.8400
1 mM de glicose-1,6-bisfosfato20
NADP de 10 mM20
Volume final770

Tabela 4: Composição da mistura reacional para o ensaio da atividade da glicogênio fosforilase.

NOTA: Para facilitar a configuração, um master mix pode ser feito contendo o suficiente de cada um dos reagentes listados acima para completar o número de ensaios planejados.

  1. Preparar uma reacção em branco contendo os componentes enumerados no quadro 4 , mas adicionar mais 30 μL de tampão PIPES de 25 mM, pH 6,8 (preparado diluindo 125 mM tampão PIPES 1/5 com água). Transfira para uma cubeta de metacrilato descartável e use para definir o zero no espectrofotômetro a 340 nm.
  2. Tome uma alíquota de 770 μL de mistura de reação em um tubo de 1,5 mL. Adicionar 1 μL de glicose-6-fosfato desidrogenase e 1 μL de fosfoglucomutase, misturar suavemente e incubar a 30 °C durante 3 min para pré-aquecer a mistura de reacção.
  3. Adicionar 30 μL da amostra contendo glicogénio fosforilase em tampão PIPES de 25 mM, pH 6,8. Misture e transfira a mistura de reação para uma cubeta de metacrilato descartável.
  4. Coloque a cubeta no espectrofotômetro e registre a absorvância a 340 nm em intervalos cronometrados por 10 a 20 min. Plotar as absorvâncias obtidas em relação ao tempo.
    NOTA: Deve ser incluída uma reacção na qual a fosforilase de glicogénio é substituída por tampão PIPES de 25 mM. Dependendo da pureza da amostra de glicogênio fosforilase, outros controles também podem ser necessários (consulte Discussão para obter detalhes).
  5. Determine a taxa de reação (consulte Resultados representativos para obter detalhes).

3. Determinação da atividade enzimática desramificadora do glicogênio

  1. Preparar as soluções-mãe indicadas no quadro 5 (antes do dia experimental).
ComponenteTrajeto
Tampão maleato de 100 mMDissolva 1,61 g de ácido maleico em ~ 80 mL de água.  Ajuste o pH para 6,6 com NaOH e faça o volume final até 100 mL com água.
Cloridrato de trietanolamina 300 mM/ 3 mM MgSO4 pH 7,5Dissolver 27,85 g de cloridrato de trietanolamina e 0,370 g de MgSO4. 7H2O em ~ 400 mL de água.  Ajustar o pH para 7,5 com NaOH e completar até um volume final de 500 ml com água.
150 mM ATP/12 mM NADPDissolva 1,24 g de ATP em ~ 10 mL de água.  Monitore o pH e adicione NaOH para manter um pH de ~ 7,5 à medida que o ATP se dissolve.  Adicionar 0,138 g de NADP.  Ajustar o pH para ~ 7,5 com NaOH e completar até um volume final de 15 mL com água. Conservar em alíquotas a – 20 °C. Estável por vários meses.
50 mM Na tampão fosfato pH 6,8Dissolver 32,81 g de Na 2 HPO 4,7H 2 Oe 17,61 g de NaH2PO4. H2O na água.  Leve o volume até um volume final de 5 L com água.

Quadro 5: Soluções-mãe necessárias para o ensaio da actividade enzimática desramificadora do glicogénio.

  1. Preparar dextrina limite de fosforilase
    1. Dissolver 0,3 g de glicogênio de ostra em 10 mL de tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 6,8.
    2. Dissolva o pó de fosforilase A liofilizada suficiente para produzir 60 U de atividade em tampão fosfato de 50 mM, pH 6,8.
      NOTA: Dependendo do lote de fosforilase A comprada, a massa necessária irá variar, mas é geralmente entre 5 e 10 mg de pó.
  2. Adicionar 60 U de fosforilase A à solução de glicogénio e transferir para um saco de diálise. Dializar à temperatura ambiente contra 1 L de tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 6,8 durante 8 h. Mude para o tampão de diálise fresco e continue a incubação durante a noite.
  3. Adicione mais 10 U de fosforilase A e mude para tampão de diálise fresco. Após 8 h, mude novamente para tampão de diálise fresco e continue a incubação durante a noite.
  4. Transfira o conteúdo do saco de diálise para um tubo de centrífuga e ferva por 10 min. Esfrie no gelo e, em seguida, centrifugar a 10.000 x g por 15 min.
  5. Transfira o sobrenadante para uma bolsa de diálise e dialize por 8 h contra três trocas de 2 L de água destilada.
  6. Transfira o conteúdo da bolsa de diálise para um tubo de centrífuga de 50 mL. Meça o volume e adicione dois volumes de etanol absoluto gelado para precipitar a dextrina limite. Deixe o tubo repousar sobre o gelo por 30 min.
    NOTA: Um precipitado branco deve começar a se formar imediatamente após a adição de etanol, mas, se não o fizer, adicione uma gota de 3 M de NaCl.
  7. Centrifugar a 15.000 x g durante 15 min e eliminar o sobrenadante. Lave o pellet branco de dextrina limite duas vezes com etanol a 66% v/v, usando ~30 mL para cada enxágue.
  8. Transfira a dextrina limite para uma argamassa e deixe secar completamente ao ar. Quando a dextrina limite estiver seca, moer até um pó com um pilão e transferir para um recipiente adequado para armazenamento; seco a 4 °C.
  9. Para uso como substrato enzimático de desramificação, prepare uma solução a 1% p/v em água.
  10. Pré-aqueça um banho-maria a 30 °C.
  11. Pré-aqueça um bloco de aquecimento ou banho-maria a 95 °C.
  12. Prepare quatro tubos de 1,5 mL cada um contendo 100 μL de tampão de maleato, 80 μL de dextrina limite de fosforilase e 10 μL de água. Esses tubos serão usados para conduzir o ensaio enzimático de desramificação. Rotule dois dos tubos Reação e os outros dois tubos Controle.
  13. Em intervalos cronometrados, adicionar 10 μL da amostra de enzima desramificante aos tubos de reação e 10 μL de tampão que foi usado para preparar a amostra de enzima ramificada para os tubos de controle. Incubar a 30 °C.
  14. Em pontos de tempo definidos (por exemplo, incubação de 5, 10 e 20 minutos), retire 50 μL de cada tubo de Reação e Controle e coloque imediatamente no bloco de aquecimento ou banho-maria a 95 °C. Aqueça por 3 min.
  15. Centrifugar a 15.000 x g durante 2 minutos para remover a proteína precipitada.
    Observação : neste ponto, o procedimento pode ser interrompido, se necessário. As amostras aquecidas podem ser armazenadas congeladas a -20 °C até se proceder à medição da glicose liberada (etapa 17, abaixo).
  16. Medição da glicose liberada
    1. Transferir 40 μL do sobrenadante das amostras aquecidas para cuvetes de metacrilato descartáveis e adicionar 833 μL de cloridrato de trietanolamina/tampão sulfato de magnésio, 67 μL de mistura NADP/ATP e 60 μL de água. Misture pipetando para cima e para baixo suavemente, tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar.
      NOTA: Para facilitar a configuração, um master mix pode ser feito contendo o suficiente de cada um dos reagentes listados acima para completar o número de ensaios planejados.
    2. Prepare uma reação em branco combinando 100 μL de tampão de maleato, 80 μL de dextrina limite de fosforilase e 20 μL de água. Misture bem e transfira 40 μL para uma cubeta de metacrilato descartável. Adicionar 833 μL de cloridrato de trietanolamina/sulfato de magnésio, etc., conforme descrito na etapa 3.17.1.
    3. Defina o zero no espectrofotômetro em 340 nm usando a reação em branco.
    4. Adicionar 0,5 μL de glicose-6-fosfato desidrogenase a cada cubeta. Misture suavemente pipetando para cima e para baixo lentamente. Incubar à temperatura ambiente durante 10 min e, em seguida, registar a absorvância a 340 nm.
      NOTA: Os valores de absorção devem ser baixos, significando pouca contaminação das amostras com glicose-6-fosfato.
    5. Adicionar 0,5 μL de hexoquinase a cada cubeta. Misture suavemente pipetando para cima e para baixo lentamente. Incubar à temperatura ambiente durante 15 min e, em seguida, registar a absorvância a 340 nm.
    6. Continue a incubação à temperatura ambiente por mais 5 min. Registre a absorvância a 340 nm mais uma vez. Se a absorção tiver aumentado em relação à registada aos 15 minutos, continuar a incubação durante mais 5 minutos e verificar novamente a absorção. Registar a absorção final a 340 nm obtidos.
    7. Para cada amostra, subtrair a absorvância a 340 nm registada após a adição de glicose-6-fosfato desidrogenase da absorvância final obtida após adição de hexoquinase. Plotar os valores obtidos em relação ao período de tempo em que a amostra correspondente foi incubada com enzima desramificadora.

4. Determinação da atividade enzimática ramificadora do glicogênio

  1. Antes do dia experimental, prepare a solução de iodo/KI dissolvendo primeiro 2,6 g de KI em 10 mL de água. Em um exaustor, pesar 0,26 g de iodo e adicionar à solução de KI.
    CUIDADO: O iodo é prejudicial quando em contato com a pele ou se inalado. Misturar para dissolver o iodo e conservar a 4 °C, protegido da luz. Prepare também tampão PIPES de 125 mM, pH 6,8 (ver Tabela 3).
  2. Ao iniciar experimentos, faça um estoque de trabalho de reagente de iodo acidificado.
    1. Tomar 45,7 ml de água num tubo de 50 ml e adicionar 150 μL de solução de iodo/KI seguido de 150 μL de HCl 1 M.
    2. Misture bem e guarde a 4 °C, protegido da luz. A solução é estável por pelo menos 3 dias sob estas condições.
  3. No dia do experimento, fazer uma solução fresca de 10 mg/mL de amilose.
    1. Pesar 50 mg de amilose e transferir para um tubo de 15 ml.
    2. Adicionar 200 μL de etanol absoluto e agitar suavemente.
    3. Adicione 500 μL de 2 M KOH e agite suavemente.
      CUIDADO: KOH causa queimaduras graves na pele e danos nos olhos. Use equipamentos de proteção individual apropriados.
    4. Adicione 0,5 mL de água agitando suavemente. Se a amilose não se dissolver completamente, adicione mais 0,5 mL de água.
    5. Ajuste o pH para ~6,5 a 7,0 com 1 M de HCl.
      CUIDADO: HCl pode causar irritação nos olhos, pele e vias respiratórias. Use equipamentos de proteção individual apropriados.
    6. Adicione água para atingir um volume final de 5 mL.
    7. Esterilizar por passagem através de um filtro final de seringa de 0,2 μm e conservar à temperatura ambiente. Não arrepie nem congele.
  4. Pré-aqueça um banho-maria a 30 °C.
  5. Prepare doze tubos de 1,5 mL, cada um contendo 1 mL de reagente de iodo acidificado. Reserve-se no banco. Estes serão usados para parar a reação da enzima ramificada.
  6. Prepare quatro tubos de 1,5 mL cada um contendo 150 μL de amilose, 150 μL de tampão PIPES e 45 μL de água. Estes tubos serão utilizados para conduzir o ensaio enzimático de ramificação. Rotule dois dos tubos Reação e os outros dois tubos Controle.
  7. Em intervalos cronometrados, adicionar 5 μL de amostra de enzima ramificada aos tubos de reação e 5 μL de tampão que foi usado para preparar a amostra de enzima ramificada para os tubos de controle. Incubar a 30 °C.
  8. Em pontos de tempo definidos (por exemplo, 5, 10 e 15 min de incubação), retire 10 μL de cada tubo de Reação e Controle e adicione aos tubos de 1,5 mL que contenham 1 mL de reagente de iodo acidificado. Adicione mais 140 μL de água e misture bem. Transferência para cuvetes descartáveis.
    NOTA: As amostras devem ser de cor azul e a solução deve estar isenta de qualquer precipitado. A cor formada é estável por pelo menos 2 h à temperatura ambiente.
  9. Prepare uma amostra que contenha 1 mL de reagente de iodo acidificado e 150 μL de água. Misture bem e transfira para uma cubeta. Use esta cubeta para definir o zero no espectrofotômetro a 660 nm.
  10. Ler a absorvância de cada uma das doze amostras a 660 nm. Determine a taxa da reação enzimática ramificada subtraindo a absorvância obtida na presença de enzima ramificada (Reação) da absorvância quando nenhuma enzima ramificada estiver presente (Controle) em cada ponto de tempo. Consulte Resultados do Representante para obter detalhes.

5. Avaliação qualitativa da ramificação do glicogênio

  1. Preparar solução saturada de cloreto de cálcio adicionando 74,5 g de cloreto de cálcio anidro a ~40 mL de água e agitando. Adicione um pouco mais de água e continue a mexer. Faça o volume até 100 mL com água e continue mexendo até que o CaCl2 esteja totalmente dissolvido.
  2. Preparar um estoque de trabalho de reagente de cor iodo/CaCl 2 misturando 50 μL de solução de estoque de KI/iodo (ver etapa 4.1, acima) com 13 mL de solução saturada de CaCl2 em um tubo de 15 mL. Misture bem e guarde a 4 °C, protegido da luz. A solução é estável por pelo menos 1 semana sob estas condições.
  3. Determinação da ramificação
    1. Em um tubo de 1,5 mL, combine 650 μL de iodo/CaCl2 com 100 μL de água e misture bem. Transfira a solução para uma cubeta de metacrilato descartável.
      NOTA: A solução na cubeta deve ser clara e de cor amarelo pálido.
    2. Coloque no espectrofotômetro e, funcionando em um modo de varredura de comprimento de onda, colete um espectro de fundo de 330 nm a 800 nm.
    3. Em um tubo de 1,5 mL, combine 650 μL de iodo/CaCl2 de trabalho com 50 μg de glicogênio de ostra. Leve o volume final para 750 μL com água e misture bem. Transfira a solução para uma cubeta de metacrilato descartável.
      NOTA: A solução na cubeta deve ser clara e uma cor laranja/marrom profunda.
    4. Colocar no espectrofotómetro e recolher um espectro de absorção de 330 nm a 800 nm.
    5. Repetir os passos 4.4.3 a 4.4.4 com 50 μg de amilopectina e 30 μg de amilose.
      NOTA: A amostra de amilopectina deve ser amarela/verde e a amostra de amilose deve ser verde/azul. Ambas as amostras devem ser claras. Os complexos coloridos formados são estáveis, sem alteração no espectro de absorção, por pelo menos 1 h à temperatura ambiente.
    6. Para obter uma indicação da estrutura ramificada de uma amostra de glicogênio não caracterizada, combine 25 μg a 50 μg de glicogênio com 650 μL de iodo/reagente de cor CaCl2 em funcionamento. Prossiga como acima, trazendo o volume para 750 μL com água, misturando bem e transferindo para uma cubeta de metacrilato.
      NOTA: A amostra de glicogênio deve produzir uma cor amarela/laranja a laranja/marrom, dependendo do grau de ramificação (comprimento das cadeias externas) do glicogênio presente. Mais uma vez, a amostra deve ser clara. Consulte Resultados do Representante para obter detalhes.
    7. Recolher o espectro de absorção.

Resultados

Determinação da atividade da glicogênio sintase
A Figura 1 mostra resultados representativos de ensaios de glicogênio sintase utilizando enzimas purificadas. No painel A, após um ligeiro atraso, houve uma diminuição linear na absorção a 340 nm ao longo do tempo por um período de cerca de 12 min. A taxa de mudança na absorção na Figura 1A foi de ~0,12 unidades de absorbância/min. Uma taxa de mudança na absorbância entre ~0,010 ...

Discussão

Em geral, as principais vantagens de todos os métodos apresentados são seu baixo custo, facilidade, velocidade e falta de dependência de equipamentos especializados. A principal desvantagem que todos eles compartilham é a sensibilidade em comparação com outros métodos disponíveis. A sensibilidade dos procedimentos que envolvem a produção ou o consumo de NADH/NADPH é fácil de estimar. Dado que o coeficiente de extinção do NADH/NADPH é de 6,22 M-1 cm-1, a aritmética simples indica que ~10-20 μM ...

Divulgações

Não há conflitos de interesse conhecidos associados a este trabalho e não houve apoio financeiro para este trabalho que pudesse ter influenciado o seu resultado.

Agradecimentos

O autor gostaria de agradecer a Karoline Dittmer e Andrew Brittingham por seus insights e muitas discussões úteis. Este trabalho foi apoiado em parte por doações do Iowa Osteopathic Education and Research Fund (IOER 03-17-05 e 03-20-04).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Amylopectin (amylose free) from waxy cornFisher ScientificA0456
AmyloseBiosynth CarbosynthYA10257
ATP, disodium saltMilliporeSigmaA3377
D-Glucose-1,6-bisphosphate, potassium saltMilliporeSigmaG6893
D-glucose-6-phosphate, sodium saltMilliporeSigmaG7879
Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Grade I, from yeastMilliporeSigma10127655001
Glycogen, Type II from oysterMilliporeSigmaG8751
HexokinaseMilliporeSigma11426362001
Methacrylate cuvettes, 1.5 mLFisher Scientific14-955-128Methacrylate is required since some procedures are conducted at 340 nm or below
β-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium saltMilliporeSigmaN0505
β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium saltMilliporeSigma43420
Nucleoside 5'-diphosphate kinaseMilliporeSigmaN0379
Phosphoenolpyruvate, monopotassium saltMilliporeSigmaP7127
Phosphoglucomutase from rabbit muscleMilliporeSigmaP3397
Phosphorylase A from rabbit muscleMilliporeSigmaP1261
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscleMilliporeSigmaP0294
UDP-glucose, disodium saltMilliporeSigmaU4625

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