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摘要

介绍了使用在可见光范围内操作的简单分光光度计测量糖原代谢关键酶活性的技术。

摘要

糖原是由从细菌到动物的各种生物体合成的葡萄糖储存形式。该分子包括α1，4-连接的葡萄糖残基的线性链，其分支通过添加α1，6-连接引入。了解糖原的合成和降解如何被调节以及糖原如何获得其特征性的支链结构需要研究糖原储存的酶。然而，最常用于研究这些酶活性的方法通常采用并非所有研究人员都可以使用的试剂或技术。在这里，我们讨论了一系列技术上简单，具有成本效益的程序，但仍能够为糖原储存的控制提供有价值的见解。这些技术需要使用在330至800nm范围内的分光光度计，并且假设用户将使用一次性塑料比色皿进行描述。然而，该程序易于扩展，并且可以修改以用于酶标仪，从而实现高度平行的分析。

引言

糖原在自然界中分布广泛，该化合物存在于细菌、许多原生生物、真菌和动物中。在微生物中，当营养物质有限时，糖原对细胞存活很重要，而在哺乳动物等高等生物中，糖原的合成和降解有助于缓冲血糖水平1，2，3。因此，糖原代谢的研究对微生物学和哺乳动物生理学等不同领域具有重要意义。了解糖原代谢需要研究糖原合成（糖原合酶和支化酶）和糖原降解（糖原磷酸化酶和脱支酶）的关键酶。糖原合酶、磷酸化酶、支化和脱支酶活性的金标准测定采用放射性同位素。例如，糖原合酶通常在停止的放射化学测定中通过将UDP-[14 C]葡萄糖（在动物和真菌酶的情况下）或ADP-[14C]葡萄糖（在细菌酶的情况下）掺入糖原4，5来测量。类似地，在将[14C]葡萄糖-1-磷酸中的葡萄糖掺入糖原6之后，沿糖原合成方向测量糖原磷酸化酶。通过测量该酶通过糖原磷酸化酶7刺激葡萄糖-1-磷酸中的[14C]葡萄糖掺入α1，4-连接链的能力来测定支化酶，并通过跟踪酶将[14C]葡萄糖掺入糖原的能力来确定脱支酶活性8.虽然放射性底物非常敏感，允许它们用于酶活性水平低的粗细胞提取物，但价格昂贵，并且受放射性同位素使用相关的监管要求的约束。这些障碍使许多工人无法使用某些检测方法。然而，在多年的过程中，已经描述了用于测量这些酶的各种令人印象深刻的分光光度法。一般来说，这些方法最终依赖于测量NADH / NADPH的产生或消耗，或糖原和碘之间有色复合物的产生。因此，它们很简单，可以使用仅配备钨或氙闪光灯的简单分光光度计进行。

糖原合酶的分光光度测定依赖于测量糖核苷酸供体释放的核苷二磷酸，因为葡萄糖被添加到生长的糖原链中9，10。下面协议第1节中描述的测量糖原合酶活性的程序是对Wayllace等人11概述的程序的修改，偶联方案如下所示:

（葡萄糖）n + UPD-葡萄糖→ （葡萄糖）n+1 + UDP

UDP + ATP → ADP + UTP

ADP + 磷酸烯醇丙酮酸 → 丙酮酸 + ATP

丙酮酸 + NADH + H+ →乳酸 + NAD+

糖原合酶将UDP-葡萄糖中的葡萄糖添加到糖原上。在此过程中产生的UDP通过核苷二磷酸激酶（NDP激酶）转化为UTP，在产生ADP的反应中。反过来，ADP作为丙酮酸激酶的底物，丙酮酸激酶使用磷酸烯醇丙酮酸作为磷酸供体磷酸化ADP。所得丙酮酸通过乳酸脱氢酶在消耗NADH的反应中转化为乳酸。因此，该测定可以以连续的方式进行，监测消耗NADH时340nm处吸光度的降低。它很容易与需要ADP-葡萄糖作为葡萄糖供体的酶一起使用。在这里，偶联步骤更简单，因为糖原合酶作用释放的ADP直接作用于丙酮酸激酶。

有多种分光光度法可用于测定糖原磷酸化酶活性。在经典版本中，酶向后驱动，朝糖原合成的方向，如下所示:

（葡萄糖）n + 葡萄糖-1-磷酸 → （葡萄糖）n+1 + Pi

在定时间隔下，除去反应混合物的等分试样，并定量释放的磷酸盐量12，13。在我们手中，由于在许多商业制备的葡萄糖-1-磷酸中存在易于测量的游离磷酸盐，以及磷酸化酶作用所需的高浓度葡萄糖-1-磷酸盐，因此该测定的使用有限。相反，我们常规采用另一种测定法，测量糖原被磷酸化酶13降解时释放的葡萄糖-1-磷酸盐。采用下图所示的偶联反应方案。

（葡萄糖）n + Pi → （葡萄糖）n-1 + 葡萄糖-1-磷酸

葡萄糖-1-磷酸 → 葡萄糖-6-磷酸

葡萄糖-6-磷酸 + NADP+ → 6-磷酸葡萄糖酸内酯 + NADPH + H+

葡萄糖-1-磷酸通过磷酸葡萄糖变位酶转化为葡萄糖-6-磷酸，然后将葡萄糖-6-磷酸氧化成6-磷酸葡萄糖酸内酯，同时NADP+ 还原为NADPH。下面协议第2节中详述的程序源自Mendicino等人14 和Schreiber&Bowling15描述的方法。该测定可以很容易地以连续的方式进行，随着时间的推移，340nm处的吸光度增加，从而可以测定反应速率。

分光光度法测定脱支酶活性依赖于测量酶对磷酸化酶极限糊精16的作用释放的葡萄糖。该化合物是通过用糖原磷酸化酶彻底处理糖原制成的。由于糖原磷酸化酶的作用使4个葡萄糖残基远离α1，6支链点，因此极限糊精含有糖原，其外链已缩短至~4个葡萄糖残基。这里描述了磷酸化酶极限糊精的制备，使用源自Taylor等人17 和Makino & Omichi18开发的那些程序。

去分支是一个两步过程。双功能脱支酶的4-α-葡聚糖转移酶活性首先将三个葡萄糖残基从支点转移到附近α1，4-连接的葡萄糖链的非还原端。然后，残留在分支点的单个α1，6-连接葡萄糖残基被α1，6-葡萄糖苷酶活性19水解。该测定通常以停止的方式进行，在给定时间（或一系列时间）后释放的葡萄糖在偶联酶测定中测量如下:

（葡萄糖）n → （葡萄糖）n-1 + 葡萄糖

葡萄糖 + ATP → 葡萄糖-6-磷酸 + ADP

葡萄糖-6-磷酸 + NADP+ → 6-磷酸葡萄糖酸内酯 + NADPH + H+

测定产生的NADPH可以测量葡萄糖的产生量度。下文议定书第3节概述的程序以Nelson等人描述的程序为基础，16。与依赖于NADH / NADPH的消耗或生成的其他方法一样，该测定非常敏感。然而，淀粉酶或其他葡萄糖苷酶的存在（它们也可以从磷酸化酶限制糊精中释放游离葡萄糖）将引起显着干扰（见讨论）。

支化酶活性的比色测定依赖于α1，4-连接的葡萄糖链采用与碘结合的螺旋结构，形成有色复合物的事实20。形成的配合物的颜色取决于α1，4-连接链的长度。因此，直链淀粉由长而大部分未支链的α1，4-连接的葡萄糖组成，与碘形成深蓝色复合物。相反，糖原，其外链通常只有6至8个葡萄糖残基长，形成橙红色复合物。如果直链淀粉溶液与支化酶一起孵育，将支链引入直链淀粉会导致产生较短的α1，4-连接的葡萄糖链。因此，直链淀粉/碘复合物的最大吸收向较短的波长移动。这里讨论的程序源自Boyer&Preiss21 的详细程序，支化酶活性被量化为随着时间的推移在660nm处直链淀粉/碘复合物的吸收减少。

从上面的讨论中应该很容易看出，碘链和α1，4-葡萄糖链之间形成的复合物的颜色随链长而变化的事实意味着糖原/碘复合物的吸光度光谱应随糖原支化程度而变化。情况确实如此，具有较长外链的支链较少的糖原/糖原比支链更细/外链较短的糖原吸收波长更长的光。因此，碘染色反应可用于获得关于糖原支化程度的快速定性数据22。当糖原与碘的复合物不是特别强烈时，形成橙棕色。然而，通过加入饱和氯化钙溶液22可以增强颜色显影。这使该方法的灵敏度提高了约10倍，并允许随时分析微量糖原。下面协议第4节中描述的用于确定分支的测定法改编自Krisman22开发的程序。只需将糖原样品与比色皿中的碘溶液和氯化钙混合并收集330nm至800nm的吸收光谱即可进行。随着分支程度的降低，吸光度最大值向更长的波长移动。

总的来说，这里描述的方法提供了简单，可靠的方法来评估糖原代谢关键酶的活性，并获得有关糖原分支程度的定性数据。

研究方案

1.糖原合酶活性的测定

  1. 如 表1 所示制备所需试剂的储备溶液（实验日之前）。
元件方向
50 毫米三分尺 pH 8.0将 0.61 g Tris 碱溶解在 ~ 80 mL 水中。 冷却至4°C。  用HCl将pH调节至8.0，用水使体积达到100 mL。
20 mM HEPES缓冲液将 0.477 g HEPES 溶解在 ~ 80 mL 水中。 用NaOH将pH调节至7.0，并用水将体积补足至100 mL。
132 mM Tris/32 mM KCl 缓冲液 pH 7.8将 1.94 g Tris 碱和 0.239 g KCl 溶解在 ~90 mL 水中。 用HCl将pH调节至7.8，并用水将体积补足至100 mL。
0.8% w/v 牡蛎糖原称出80毫克牡蛎糖原，加入水中。 用水使最终体积达到 10 mL，轻轻加热/混合以完全溶解糖原。
100 mM UDP-葡萄糖将 0.31 g UDP-葡萄糖溶解在水中，使最终体积达到 1 mL。 分装储存，在-20°C冷冻。  稳定数月。
50 毫米泛氧瘟将 0.414 g ATP 溶解在 ~ 13 mL 水中。 用NaOH将pH调节至7.5，并用水将体积补足至15 mL。 以-20°C冷冻的等分试样储存。  稳定数月。
100 mM 葡萄糖-6-磷酸 pH 7.8将0.282克葡萄糖-6-磷酸溶解在~7至8毫升水中。 用氢氧化钠将pH值调节至7.8。 用水使体积高达 10 mL。 在-20°C下冷冻冷冻。  稳定至少六个月。
40 mM磷酸烯醇丙酮酸将 4 mg 磷酸烯醇丙酮酸溶解在 0.5 mL 的 20 mM HEPES 缓冲液 pH 7.0 中。 储存在-20°C。  稳定至少 1 周。
0.5 米氯化锰2将 9.90 g MnCl2 溶解在最终体积的 100 mL 水中。
新民主党激酶用足够的水重新配制冻干粉末，得到1U / μl溶液。 准备等分试样，在液氮中冷冻，并储存在-80°C。  稳定至少 1 年。

表1:糖原合酶活性测定所需的储备溶液。

  1. 在测定当天，通过将4.5mgNADH溶解在1.5mL的50mM Tris-HCl，pH 8.0中来制备4mM NADH的新鲜工作溶液。存放在冰上，避光。
  2. 在冰上解冻UDP-葡萄糖，ATP，磷酸烯醇丙酮酸和NDP激酶的储备溶液。
  3. 将水浴预热至30°C。
  4. 通过加入 表2中列出的反应混合物试剂，在1.5 mL管中设置每种糖原合酶测定。
元件体积（微升）
160 mM Tris/32 mM KCl 缓冲液 pH 7.8250
水179
100 mM 葡萄糖-6-磷酸， pH 7.858
0.8 % w/v 牡蛎糖原67
50 毫米泛氧瘟80
4 毫米纳德80
100 mM UDP-葡萄糖28
40 mM磷酸烯醇丙酮酸20
0.5 米氯化锰28
最终卷770

表2:用于测定糖原合酶活性的组合物反应混合物。

注意:为了便于设置，可以制备含有足够多的上述每种试剂的预混液，以完成计划的测定次数。

  1. 准备一个空白反应，其中上述混合物中的NADH用水代替。转移到一次性甲基丙烯酸酯比色皿中，并使用它来将分光光度计上的零点设置为 340 nm。
  2. 在 1.5 mL 管中取一个 770 μL 等分试样的反应混合物。加入 2 μL NDP 激酶和 2 μL 丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶混合物，轻轻混合，并在 30 °C 下孵育 3 分钟以预热反应混合物。
  3. 在 pH 7.8 的 20 mM Tris 缓冲液中加入 30 μL 含有糖原合酶的样品;混合，并将反应混合物转移到一次性甲基丙烯酸酯比色皿中。
  4. 将比色皿放入分光光度计中，并以定时间隔记录340nm处的吸光度10至20分钟。绘制获得的吸光度随时间的变化。
    注意:应进行用20mM Tris缓冲液替换糖原合酶样品的反应，以控制NADH的非酶氧化。根据样品的纯度，可能需要其他对照反应。有关详细信息，请参阅讨论。
  5. 确定反应速率（有关详细信息，请参阅 结果 ）。

2.糖原磷酸化酶活性的测定

  1. 按照 表3 （实验日前）所示制备储备溶液。
元件方向
125 mM 管 pH 6.8将3.78克管道溶解在水中。 用氢氧化钠将pH值调节至6.8，并用水补足体积至100mL。
8% w/v 牡蛎糖原称出0.8克牡蛎糖原，加入水中。 用水使最终体积达到 10 mL，轻轻加热/混合以溶解糖原。 储存在-20°C冷冻。
200 mM 磷酸钠 pH 6.8溶解 2.63 g Na 2 HPO 4.7H 2 O 和 1.41g NaH2PO4。H2O在水中。 用水将体积增加到 100 mL。
1 mM葡萄糖-1，6-二磷酸盐将 2 毫克葡萄糖-1，6-二磷酸盐溶解在 4 毫升水中。 等分并储存在-20°C冷冻。  稳定至少几个月。
10 毫米纳德普将 23 毫克 NADP 溶解在 3 毫升水中。 等分并储存在-20°C冷冻。  稳定至少几个月。

表3:糖原磷酸化酶活性测定所需的储备溶液。

  1. 将水浴预热至30°C
  2. 通过添加下面列出的反应混合物试剂，在 1.5 mL 管中设置每种糖原磷酸化酶测定（表 4）。
元件体积（微升）
125 mM 管道缓冲液 pH 6.8160
水70
8% w/v 牡蛎糖原100
200 mM 磷酸钠 6.8400
1 mM葡萄糖-1，6-二磷酸盐20
10 毫米纳德普20
最终卷770

表4:用于测定糖原磷酸化酶活性的组合物反应混合物。

注意:为了便于设置，可以制备含有足够多的上述每种试剂的预混液，以完成计划的测定次数。

  1. 制备含有 表4 中所列组分的空白反应物，但额外加入30 μL pH 6.8的25 mM PIPES缓冲液（通过用水稀释125 mM PIPES缓冲液1/5制备）。转移到一次性甲基丙烯酸酯比色皿中，用于将分光光度计上的零点设置为 340 nm。
  2. 在 1.5 mL 管中取一份 770 μL 等分试样的反应混合物。加入1μL葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和1μL磷酸葡萄糖变位酶，轻轻混合，并在30°C孵育3分钟以预热反应混合物。
  3. 在 pH 6.8 的 25 mM PIPES 缓冲液中加入 30 μL 含有糖原磷酸化酶的样品。混合并将反应混合物转移到一次性甲基丙烯酸比色皿中。
  4. 将比色皿放入分光光度计中，并以定时间隔记录340nm处的吸光度10至20分钟。绘制获得的吸光度随时间的变化。
    注意:应包括用25mM PIPES缓冲液替换糖原磷酸化酶的反应。根据糖原磷酸化酶样品的纯度，可能还需要其他对照（详见讨论）。
  5. 确定反应速率（详见代表性结果）。

3.糖原脱支酶活性的测定

  1. 按照 表5 （实验日之前）所示制备储备溶液。
元件方向
100 mM马来酸盐缓冲液将1.61克马来酸溶解在~80毫升水中。 用NaOH将pH调节至6.6，用水使最终体积达到100 mL。
300 mM 三乙醇胺盐酸盐/ 3 mM MgSO4 pH 7.5溶解27.85克盐酸三乙醇胺和0.370克MgSO4。7H2O 在 ~ 400 mL 水中。 用 NaOH 将 pH 值调节至 7.5，并用水补足至 500 mL 的最终体积。
150 毫米三磷酸腺啪啪/12 毫米三磷酸腺苷将 1.24 g ATP 溶解在 ~ 10 mL 水中。 监测pH值并加入NaOH以在ATP溶解时保持~7.5的pH值。 加入0.138克NADP。 用NaOH将pH调节至~7.5，并用水补足至15mL的最终体积。在– 20°C下等分储存。 稳定数月。
50 mM 磷酸钠缓冲液 pH 6.8溶解 32.81 g Na 2 HPO 4.7H 2 O 和 17.61 g NaH2PO4。H2O在水中。 用水使体积达到 5 L 的最终体积。

表5:糖原脱支酶活性测定所需的储备溶液。

  1. 制备磷酸化酶极限糊精
    1. 将 0.3 g 牡蛎糖原溶解在 10 mL 的 50 mM 磷酸钠缓冲液中，pH 6.8。
    2. 溶解足够的冻干磷酸化酶A粉末，在pH 6.8的50mM磷酸盐缓冲液中产生60U活性。
      注意:根据购买的磷酸化酶A批次，所需的质量会有所不同，但通常在5至10mg粉末之间。
  2. 向糖原溶液中加入60U磷酸化酶A并转移到透析袋中。在室温下对1L 50mM磷酸钠缓冲液透析，pH 6.888小时。更换为新鲜透析缓冲液并继续孵育过夜。
  3. 再加入10U磷酸化酶A，换成新鲜透析缓冲液。8小时后，再次更换为新鲜透析缓冲液并继续孵育过夜。
  4. 将透析袋的内容物转移到离心管中并煮沸10分钟。在冰上冷却，然后以10，000× g 离心15分钟。
  5. 将上清液转移到透析袋中，对2L蒸馏水的三次变化透析8小时。
  6. 将透析袋的内容物转移到 50 mL 离心管中。测量体积并加入两体积冰冷的无水乙醇以沉淀极限糊精。让管子在冰上静置30分钟。
    注意:加入乙醇后应立即开始形成白色沉淀，但如果没有，则添加一滴3M NaCl。
  7. 以15，000× g 离心15分钟，弃去上清液。用 66% v/v 乙醇冲洗极限糊精的白色沉淀两次，每次冲洗使用 ~30 mL。
  8. 将极限糊精转移到研钵中，让其完全风干。极限糊精干燥后，用研杵研磨成粉末，转移到合适的容器中储存;在4°C干燥。
  9. 为了用作脱支酶底物，在水中制备1% w/v溶液。
  10. 将水浴预热至30°C。
  11. 将加热块或水浴预热至95°C。
  12. 准备四个 1.5 mL 管，每个管含有 100 μL 马来酸盐缓冲液、80 μL 磷酸化酶极限糊精和 10 μL 水。这些试管将用于进行脱支酶测定。标记其中两个管反应和另外两个管对照。
  13. 每隔一段时间，向反应管中加入 10 μL 脱支酶样品，向对照管中加入 10 μL 用于制备支化酶样品的缓冲液。在30°C孵育。
  14. 在规定的时间点（例如，5分钟、10 分钟和 20 分钟孵育），从每个反应和控制管中取出 50 μL，并立即放入 95 °C 的加热块或水浴中。 加热3分钟。
  15. 以15，000× g 离心2分钟以除去沉淀的蛋白质。
    注意:此时，如果需要，可以停止该过程。加热的样品可以在-20°C下冷冻储存，直到继续测量游离的葡萄糖（下面的步骤17）。
  16. 释放葡萄糖的测量
    1. 将 40 μL 上清液从加热样品转移到一次性甲基丙烯酸酯比色皿中，并加入 833 μL 盐酸三乙醇胺/硫酸镁缓冲液、67 μL NADP/ATP 混合物和 60 μL 水。轻轻上下移液混合，注意不要引入气泡。
      注意:为了便于设置，可以制备含有足够多的上述每种试剂的预混液，以完成计划的测定次数。
    2. 通过混合 100 μL 马来酸盐缓冲液、80 μL 磷酸化酶极限糊精和 20 μL 水制备空白反应。充分混合，并将 40 μL 转移到一次性甲基丙烯酸酯比色皿中。加入833μL盐酸三乙醇胺/硫酸镁等，如步骤3.17.1中所述。
    3. 使用空白反应将分光光度计上的零点设置为 340 nm。
    4. 向每个比色皿中加入 0.5 μL 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。通过缓慢上下移液轻轻混合。在室温下孵育10分钟，然后记录340nm处的吸光度。
      注意:吸收值应较低，表示样品几乎没有葡萄糖-6-磷酸污染。
    5. 向每个比色皿中加入 0.5 μL 己糖激酶。通过缓慢上下移液轻轻混合。在室温下孵育15分钟，然后在340nm处记录吸光度。
    6. 继续在室温下孵育5分钟。再次记录340nm处的吸光度。如果吸收从15分钟记录的吸收增加，继续孵育5分钟，然后再次检查吸收。记录获得的340nm处的最终吸收。
    7. 对于每个样品，从加入己糖激酶后获得的最终吸光度中减去加入葡萄糖-6-磷酸脱氢酶后记录的340nm处的吸光度。根据相应样品用脱支酶孵育的时间长度绘制获得的值。

4.糖原支化酶活性的测定

  1. 在实验日之前，首先将2.6 g KI溶解在10 mL水中来制备碘/ KI溶液。在通风橱中，称出0.26克碘并添加到KI溶液中。
    注意:碘在与皮肤接触或吸入时是有害的。混合以溶解碘并储存在4°C，避光。同时准备125 mM PIPES缓冲液，pH 6.8（见 表3）。
  2. 开始实验时，制作酸化碘试剂的工作储备。
    1. 在 50 mL 管中取 45.7 mL 水，加入 150 μL 碘/KI 溶液，然后加入 150 μL 1 M HCl。
    2. 充分混合并储存在4°C，避光。在这些条件下，溶液至少稳定3天。
  3. 在实验当天，制作新鲜的10mg / mL直链淀粉溶液。
    1. 称出 50 mg 直链淀粉并转移到 15 mL 管中。
    2. 加入 200 μL 无水乙醇并轻轻摇晃。
    3. 加入 500 μL 2 M KOH 并轻轻摇晃。
      注意:KOH会导致严重的皮肤灼伤和眼睛损伤。使用适当的个人防护设备。
    4. 加入 0.5 mL 水，同时轻轻摇晃。如果直链淀粉不能完全溶解，请额外添加 0.5 mL 水。
    5. 用 1 M HCl 将 pH 值调节至 ~6.5 至 7.0。
      注意:HCl可能会引起眼睛，皮肤和呼吸道刺激。使用适当的个人防护设备。
    6. 加水至终体积 5 mL。
    7. 通过0.2μm注射器端部过滤器进行灭菌，并在室温下储存。不要冷却或冷冻。
  4. 将水浴预热至30°C。
  5. 准备 12 个 1.5 mL 试管，每个管含有 1 mL 酸化碘试剂。放在长凳上。这些将用于阻止支化酶反应。
  6. 准备四个 1.5 mL 管，每个管含有 150 μL 直链淀粉、150 μL PIPES 缓冲液和 45 μL 水。这些试管将用于进行支化酶测定。标记其中两个管反应和另外两个管对照。
  7. 每隔一段时间，向反应管中加入 5 μL 支化酶样品，向对照管中加入 5 μL 用于制备支化酶样品的缓冲液。在30°C孵育。
  8. 在确定的时间点（例如，5、10 和 15 分钟孵育），从每个反应和对照管中提取 10 μL，并添加到含有 1 mL 酸化碘试剂的 1.5 mL 管中。再加入 140 μL 水并充分混合。转移到一次性比色皿上。
    注意:样品应为蓝色，溶液应不含任何沉淀物。形成的颜色在室温下稳定至少2小时。
  9. 制备含有 1 mL 酸化碘试剂和 150 μL 水的样品。搅拌均匀并转移到比色皿中。使用此比色皿将分光光度计上的零点设置为 660 nm。
  10. 在660nm处读取十二个样品中每个样品的吸光度。当每个时间点不存在支化酶（对照）时，通过从吸光度中减去在支化酶存在下获得的吸光度（反应）来确定支化酶反应的速率。有关详细信息，请参阅代表性结果。

5. 糖原分支的定性评估

  1. 将74.5g无水氯化钙加入~40mL水中并搅拌制备饱和氯化钙溶液。再加一点水，继续搅拌。用水使体积达到 100 mL，并继续搅拌直至 CaCl2 完全溶解。
  2. 通过在 15 mL 管中将 50 μL KI/碘储备溶液（参见上面的步骤 4.1）与 13 mL 饱和 CaCl 2 溶液混合，制备碘/CaCl2 颜色试剂的工作储备液。充分混合并储存在4°C，避光。在这些条件下，溶液至少稳定1周。
  3. 分支的确定
    1. 在 1.5 mL 管中，将 650 μL 碘/CaCl2 颜色试剂原液与 100 μL 水混合并充分混合。将溶液转移到一次性甲基丙烯酸酯比色皿中。
      注意:比色皿中的溶液应透明且呈淡黄色。
    2. 放入分光光度计中，以波长扫描模式运行，收集330nm至800nm的背景光谱。
    3. 在 1.5 mL 管中，将 650 μL 工作碘/CaCl2 颜色试剂与 50 μg 牡蛎糖原混合。用水将最终体积降至 750 μL 并充分混合。将溶液转移到一次性甲基丙烯酸酯比色皿中。
      注意:比色皿中的溶液应该是透明的，呈深橙色/棕色。
    4. 放入分光光度计并收集330nm至800nm的吸收光谱。
    5. 用50μg支链淀粉和30μg直链淀粉重复步骤4.4.3至4.4.4。
      注意:支链淀粉样品应为黄色/绿色，直链淀粉样品应为绿色/蓝色。两个样本都应该是清晰的。形成的有色配合物在室温下稳定，吸收光谱没有变化至少1小时。
    6. 为了获得未表征糖原样品的支链结构指示，将 25 μg 至 50 μg 糖原与 650 μL 工作碘/CaCl2 颜色试剂混合。如上所述，用水使体积达到 750 μL，充分混合，然后转移到甲基丙烯酸比色皿中。
      注意:糖原样品应产生黄色/橙色至橙色/棕色，具体取决于存在的糖原的分支程度（外链长度）。同样，样品应该是透明的。有关详细信息，请参阅 代表性结果 。
    7. 收集吸收光谱。

结果

糖原合酶活性的测定
图1 显示了使用纯化酶进行糖原合酶测定的代表性结果。在图A中，在轻微滞后之后，随着时间的推移，340nm处的吸收呈线性下降，持续约12分钟。 图1A 中的吸收变化率为~0.12吸光度单位/分钟。~0.010至~0.20吸光度单位/min之间的吸光度变化率是最佳的，应将糖原合酶的添加量调整为该范围内的产量。在图B中，显示了在测?...

讨论

一般来说，所介绍的所有方法的主要优点是成本低、简单、速度快，并且不依赖专用设备。与其他可用方法相比，它们共有的主要缺点是灵敏度。涉及生产或消费NADH/NADPH的程序的敏感性很容易估计。鉴于NADH / NADPH的消光系数为6.22 M-1 cm-1，简单的算术表明可以很容易地检测到~10-20μM浓度的变化。使用本文中描述的测定体积，这对应于测量~10-20 nmol范围内的数量的能力。可以说，这?...

披露声明

这项工作没有已知的利益冲突，也没有可能影响其结果的财政支持。

致谢

作者要感谢Karoline Dittmer和Andrew Brittingham的见解和许多有益的讨论。这项工作得到了爱荷华州整骨教育和研究基金（IOER 03-17-05和03-20-04）的部分资助。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Amylopectin (amylose free) from waxy cornFisher ScientificA0456
AmyloseBiosynth CarbosynthYA10257
ATP, disodium saltMilliporeSigmaA3377
D-Glucose-1,6-bisphosphate, potassium saltMilliporeSigmaG6893
D-glucose-6-phosphate, sodium saltMilliporeSigmaG7879
Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Grade I, from yeastMilliporeSigma10127655001
Glycogen, Type II from oysterMilliporeSigmaG8751
HexokinaseMilliporeSigma11426362001
Methacrylate cuvettes, 1.5 mLFisher Scientific14-955-128Methacrylate is required since some procedures are conducted at 340 nm or below
β-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium saltMilliporeSigmaN0505
β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium saltMilliporeSigma43420
Nucleoside 5'-diphosphate kinaseMilliporeSigmaN0379
Phosphoenolpyruvate, monopotassium saltMilliporeSigmaP7127
Phosphoglucomutase from rabbit muscleMilliporeSigmaP3397
Phosphorylase A from rabbit muscleMilliporeSigmaP1261
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscleMilliporeSigmaP0294
UDP-glucose, disodium saltMilliporeSigmaU4625

参考文献

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