Méthodes spectrophotométriques pour l’étude du métabolisme du glycogène eucaryote

Résumé

Des techniques pour mesurer l’activité des enzymes clés du métabolisme du glycogène sont présentées, à l’aide d’un spectrophotomètre simple fonctionnant dans la plage visible.

Résumé

Le glycogène est synthétisé comme une forme de stockage du glucose par un large éventail d’organismes, allant des bactéries aux animaux. La molécule comprend des chaînes linéaires de résidus de glucose liés α1,4 avec des branches introduites par l’ajout de liaisons α1,6. Comprendre comment la synthèse et la dégradation du glycogène sont régulées et comment le glycogène atteint sa structure ramifiée caractéristique nécessite l’étude des enzymes de stockage du glycogène. Cependant, les méthodes les plus couramment utilisées pour étudier ces activités enzymatiques utilisent généralement des réactifs ou des techniques qui ne sont pas disponibles pour tous les chercheurs. Ici, nous discutons d’une batterie de procédures techniquement simples, rentables et pourtant capables de fournir des informations précieuses sur le contrôle du stockage du glycogène. Les techniques nécessitent l’accès à un spectrophotomètre, fonctionnant dans la plage de 330 à 800 nm, et sont décrites en supposant que les utilisateurs utiliseront des cuvettes en plastique jetables. Cependant, les procédures sont facilement évolutives et peuvent être modifiées pour une utilisation dans un lecteur de microplaques, permettant une analyse hautement parallèle.

Introduction

Le glycogène est largement distribué dans la nature, le composé se trouvant dans les bactéries, de nombreux protistes, champignons et animaux. Dans les micro-organismes, le glycogène est important pour la survie des cellules lorsque les nutriments sont limitatifs et, chez les organismes supérieurs tels que les mammifères, la synthèse et la dégradation du glycogène servent à tamponner les niveaux de glucose sanguin ^1,2,3. L’étude du métabolisme du glycogène est donc importante pour des domaines aussi divers que la microbiologie et la physiologie des mammifères. Comprendre le métabolisme du glycogène nécessite d’étudier les enzymes clés de la synthèse du glycogène (glycogène synthase et enzyme ramifiée) et de la dégradation du glycogène (glycogène phosphorylase et enzyme débranchante). Les dosages de référence des activités enzymatiques de glycogène synthase, de phosphorylase, de ramification et de débranchement utilisent des isotopes radioactifs. Par exemple, la glycogène synthase est généralement mesurée dans un essai radiochimique arrêté en suivant l’incorporation du glucose de l’UDP-[14 C]glucose (dans le cas des enzymes animales et fongiques) ou de l’ADP-[¹⁴C]glucose (dans le cas des enzymes bactériennes) dans le glycogène ^4,5. De même, la glycogène phosphorylase est mesurée dans le sens de la synthèse du glycogène, suite à l’incorporation du glucose de [¹⁴C]glucose-1-phosphate dans le glycogène⁶. L’enzyme ramifiée est dosée en mesurant la capacité de cette enzyme à stimuler l’incorporation du [14 C]glucose du glucose-1-phosphate dans les chaînes liées α1,4 par la glycogène phosphorylase⁷, et l’activité enzymatique débranchante est déterminée en suivant la capacité de l’enzyme à incorporer [¹⁴C]glucose dans le glycogène⁸ . Bien que très sensibles, permettant leur utilisation dans des extraits cellulaires bruts à faible activité enzymatique, les substrats radioactifs sont coûteux et soumis aux exigences réglementaires liées à l’utilisation de radio-isotopes. Ces obstacles placent l’utilisation de certains tests hors de portée de nombreux travailleurs. Cependant, au cours de nombreuses années, une variété impressionnante d’approches spectrophotométriques pour la mesure de ces enzymes ont été décrites. En général, ces approches reposent en fin de compte sur la mesure de la production ou de la consommation de NADH / NADPH, ou la génération de complexes colorés entre le glycogène et l’iode. Ainsi, ils sont simples et peuvent être réalisés à l’aide de spectrophotomètres simples équipés uniquement de lampes flash au tungstène ou au xénon.

Les dosages spectrophotométriques de la glycogène synthase reposent sur la mesure du diphosphate nucléosidique libéré par le donneur de nucléotides de sucre lorsque le glucose est ajouté à la chaîne de glycogène ^9,10 en croissance. La procédure de mesure de l’activité de la glycogène synthase décrite à la section 1 du protocole, ci-dessous, est une modification de celle décrite par Wayllace et ^coll.11, et le schéma de couplage est illustré ci-dessous :

(Glucose) _n + UPD-glucose → (Glucose)_n+1 + UDP

UDP + ATP → ADP + UTP

ADP + phosphoénolpyruvate → pyruvate + ATP

Pyruvate + NADH + H+ → Lactate + ^NAD+

La glycogène synthase ajoute du glucose de l’UDP-glucose au glycogène. L’UDP généré dans ce processus est converti en UTP par nucléoside diphosphate kinase (NDP kinase), dans une réaction qui génère de l’ADP. L’ADP, à son tour, sert ensuite de substrat pour la pyruvate kinase, qui phosphoryle l’ADP en utilisant le phosphoénolpyruvate comme donneur de phosphate. Le pyruvate résultant est converti en lactate par l’enzyme lactate déshydrogénase dans une réaction qui consomme du NADH. Le test peut donc être effectué de manière continue, en surveillant la diminution de l’absorbance à 340 nm lorsque le NADH est consommé. Il est facilement adapté pour une utilisation avec des enzymes qui nécessitent du glucose ADP comme donneur de glucose. Ici, les étapes de couplage sont plus simples puisque l’ADP libéré par l’action de la glycogène synthase est directement agité par la pyruvate kinase.

Il existe une variété de tests spectrophotométriques disponibles pour la détermination de l’activité de la glycogène phosphorylase. Dans la version classique, l’enzyme est poussée vers l’arrière, dans le sens de la synthèse du glycogène, comme indiqué ci-dessous:

(Glucose) _n + Glucose-1-phosphate → (Glucose)_n+1 + P_i

A intervalles temporels, les aliquotes du mélange réactionnel sont éliminées et la quantité de phosphate libérée est quantifiée^12,13. Dans nos mains, ce test a été d’une utilité limitée en raison de la présence de phosphate libre facilement mesurable dans de nombreuses préparations commerciales de glucose-1-phosphate, combinée aux concentrations élevées de glucose-1-phosphate nécessaires à l’action de la phosphorylase. Au lieu de cela, nous avons régulièrement utilisé un test alternatif qui mesure le glucose-1-phosphate libéré lorsque le glycogène est dégradé par la phosphorylase¹³. Un schéma de réaction couplée, illustré ci-dessous, est utilisé.

(Glucose) n + P_i → (Glucose)_n-1 + Glucose-1-phosphate

Glucose-1-phosphate → Glucose-6-phosphate

Glucose-6-phosphate + NADP+ → 6-phosphogluconolactone + NADPH + H⁺

Le glucose-1-phosphate est converti en glucose-6-phosphate par la phosphoglucomutase, et le glucose-6-phosphate est ensuite oxydé en 6-phosphogluconolactone, avec la réduction concomitante du NADP⁺ en NADPH. La procédure détaillée à la section 2 du protocole, ci-dessous, est dérivée des méthodes décrites par Mendicino et al.14 et Schreiber & Bowling¹⁵. Le test peut être facilement effectué de manière continue, avec l’augmentation de l’absorbance à 340 nm au fil du temps, permettant la détermination de la vitesse de réaction.

La détermination spectrophotométrique de l’activité enzymatique débranchante repose sur la mesure du glucose libéré par l’action de l’enzyme sur la phosphorylase limite la dextrine¹⁶. Ce composé est fabriqué en traitant le glycogène de manière exhaustive avec de la glycogène phosphorylase. Étant donné que l’action de la glycogène phosphorylase arrête 4 résidus de glucose d’un point de branche α1,6, la dextrine limite contient du glycogène, dont les chaînes externes ont été raccourcies à ~4 résidus de glucose. La préparation de la dextrine limite de phosphorylase est décrite ici, en utilisant une procédure dérivée de celles développées par Taylor et al.17 et Makino & Omichi ¹⁸.

Le débranchement est un processus en deux étapes. L’activité de la 4-α-glucanotransférase de l’enzyme débranchante bifonctionnelle transfère d’abord trois résidus de glucose du point de branche à l’extrémité non réductrice d’une chaîne de glucose proche liée α1,4. Le seul résidu de glucose lié à l’α1,6 restant au point de branche est ensuite hydrolysé par l’activité α1,6-glucosidase¹⁹. Le test est généralement effectué de manière arrêtée, le glucose libéré après un temps donné (ou une série de fois) étant mesuré dans un dosage enzymatique couplé comme indiqué ci-dessous:

(Glucose) n → (glucose)_n-1 + glucose

Glucose + ATP → Glucose-6-phosphate + ADP

Glucose-6-phosphate + NADP+ → 6-phosphogluconolactone + NADPH + H⁺

La détermination du NADPH produit donne une mesure de la production de glucose. La procédure décrite à la section 3 du protocole, ci-dessous, est basée sur celle décrite par Nelson et ^al.16. Comme les autres méthodes qui reposent sur la consommation ou la génération de NADH / NADPH, le test est assez sensible. Cependant, la présence d’amylases ou d’autres glucosidases, qui peuvent également libérer le glucose libre de la phosphorylase limite la dextrine, provoquera des interférences importantes (voir Discussion).

La détermination colorimétrique de l’activité enzymatique ramifiée repose sur le fait que les chaînes de glucose liées à l’α1,4 adoptent des structures hélicoïdales qui se lient à l’iode, formant des complexes colorés²⁰. La couleur du complexe formé dépend de la longueur des chaînes liées α1,4. Ainsi, l’amylose, qui consiste en de longues chaînes largement non ramifiées de glucose lié à α1,4, forme un complexe bleu profond avec de l’iode. En revanche, les glycogènes, dont les chaînes externes sont généralement de l’ordre de 6 à 8 résidus de glucose de long, forment des complexes rouge-orangé. Si une solution d’amylose est incubée avec une enzyme ramifiée, l’introduction de branches dans l’amylose entraîne la génération de chaînes de glucose plus courtes liées à α1,4. Ainsi, le maximum d’absorption des complexes amylose/iode se déplace vers des longueurs d’onde plus courtes. La procédure discutée ici est dérivée de celle détaillée par Boyer & Preiss²¹ et l’activité enzymatique ramifiée est quantifiée comme une réduction de l’absorption du complexe amylose / iode à 660 nm au fil du temps.

Comme il ressort clairement de la discussion ci-dessus, le fait que les couleurs des complexes formés entre les chaînes iodée et α1,4-glucose varient avec la longueur de la chaîne signifie que les spectres d’absorbance des complexes glycogène/iode devraient varier avec le degré de ramification du glycogène. C’est en effet le cas, et les glycogènes moins ramifiés / glycogènes avec des chaînes externes plus longues absorbent la lumière à une longueur d’onde plus longue que les glycogènes qui sont plus ramifiés / ont des chaînes externes plus courtes. La réaction de coloration à l’iode peut donc être utilisée pour obtenir des données qualitatives rapides sur le degré de ramification du glycogène²². La couleur brun orangé se forme lorsque les complexes de glycogène avec de l’iode ne sont pas particulièrement intenses. Cependant, le développement de la couleur peut être amélioré par l’inclusion d’une solution saturée de chlorure de calcium²². Cela multiplie par 10 la sensibilité de la méthode et permet une analyse facile des quantités de microgrammes de glycogène. Le dosage pour la détermination de la ramification décrit à la section 4 du protocole, ci-dessous, est adapté d’une procédure développée par Krisman²². Elle est réalisée simplement en combinant l’échantillon de glycogène avec une solution d’iode et de chlorure de calcium dans une cuvette et en collectant le spectre d’absorption de 330 nm à 800 nm. L’absorbance maximale se déplace vers des longueurs d’onde plus longues à mesure que le degré de ramification diminue.

Collectivement, les méthodes décrites ici fournissent des moyens simples et fiables d’évaluer les activités des enzymes clés du métabolisme du glycogène et d’obtenir des données qualitatives sur l’étendue de la ramification du glycogène.

Protocole

1. Détermination de l’activité de la glycogène synthase

1. Préparer les solutions mères des réactifs requis comme indiqué dans le tableau 1 (avant le jour expérimental).

Composant	Itinéraire
50 mM Tris pH 8,0	Dissoudre 0,61 g de Tris base dans ~ 80 mL d’eau.  Refroidir à 4 °C.   Ajustez le pH à 8,0 avec HCl et faites le volume jusqu’à 100 mL avec de l’eau.
Tampon HEPES 20 mM	Dissoudre 0,477 g de HEPES dans ~ 80 mL d’eau.  Ajustez le pH à 7,0 avec NaOH et portez le volume à 100 mL avec de l’eau.
Tampon 132 mM Tris/32 mM KCl pH 7,8	Dissoudre 1,94 g de Tris base et 0,239 g de KCl dans ~90 mL d’eau.  Ajuster le pH à 7,8 avec HCl et compléter le volume à 100 mL avec de l’eau.
0,8 % p/v de glycogène d’huître	Peser 80 mg de glycogène d’huître et ajouter à l’eau.  Faire porter le volume final jusqu’à 10 ml avec de l’eau et réchauffer doucement/mélanger pour dissoudre complètement le glycogène.
100 mM UDP-glucose	Dissoudre 0,31 g d’UDP-glucose dans de l’eau et porter le volume final à 1 mL.  Conserver dans des aliquotes, congelées à -20 °C.   Stable pendant plusieurs mois.
50 mM ATP	Dissoudre 0,414 g d’ATP dans ~ 13 mL d’eau.  Ajuster le pH à 7,5 avec NaOH et porter le volume à 15 mL avec de l’eau.  Conserver dans des aliquotes congelées à -20 °C.   Stable pendant plusieurs mois.
100 mM glucose-6-phosphate pH 7,8	Dissoudre 0,282 g de glucose-6-phosphate dans ~ 7 à 8 mL d’eau.  Ajustez le pH à 7,8 avec NaOH.  Porter le volume jusqu’à 10 mL avec de l’eau.  Conserver congelé dans des aliquotes à -20 °C.   Stable depuis au moins six mois.
40 mM phosphoénolpyruvate	Dissoudre 4 mg de phosphoénolpyruvate dans 0,5 mL de tampon HEPES 20 mM pH 7,0.  Conserver à -20 °C.   Stable pendant au moins 1 semaine.
0,5 M MnCl2	Dissoudre 9,90 g de MnCl2dans un volume final de 100 mL d’eau.
Kinase du NPD	Reconstituer la poudre lyophilisée avec suffisamment d’eau pour donner 1 solution U/μl.  Préparer les aliquotes, les congeler dans de l’azote liquide et les conserver à -80 °C.   Stable depuis au moins 1 an.

Tableau 1 : Solutions mères requises pour le dosage de l’activité de la glycogène synthase.

2. Le jour du dosage, préparer une nouvelle solution de travail de 4 mM de NADH en dissolvant 4,5 mg de NADH dans 1,5 mL de Tris-HCl 50 mM, pH 8,0. Conserver sur de la glace, à l’abri de la lumière.
3. Décongeler des solutions mères d’UDP-glucose, d’ATP, de phosphoénolpyruvate et de NDP kinase sur de la glace.
4. Préchauffer un bain-marie à 30 °C.
5. Mettre en place chaque test de glycogène synthase dans un tube de 1,5 mL en ajoutant les réactifs de mélange réactionnel énumérés dans le tableau 2.

Composant	Volume (μl)
Tampon 160 mM Tris/32 mM KCl pH 7,8	250
Eau	179
100 mM glucose-6-phosphate, pH 7,8	58
0,8 % p/v de glycogène d’huître	67
50 mM ATP	80
4 mM de NADH	80
100 mM UDP-glucose	28
40 mM phosphoénolpyruvate	20
0,5 M MnCl2	8
Volume final	770

Tableau 2 : Composition du mélange réactionnel pour le dosage de l’activité de la glycogène synthase.

NOTE: Pour faciliter la mise en place, un mélange maître peut être fait contenant suffisamment de chacun des réactifs énumérés ci-dessus pour compléter le nombre de dosages prévus.

6. Préparer une réaction à blanc, où le NADH dans le mélange ci-dessus est remplacé par de l’eau. Transférer dans une cuvette de méthacrylate jetable et l’utiliser pour régler le zéro sur le spectrophotomètre à 340 nm.
7. Prélever une quantité de 770 μL de la partie aliquote du mélange réactionnel dans un tube de 1,5 mL. Ajouter 2 μL de NDP kinase et 2 μL de mélange pyruvate kinase/lactate déshydrogénase, mélanger doucement et incuber à 30 °C pendant 3 min pour préchauffer le mélange réactionnel.
8. Ajouter 30 μL de l’échantillon contenant la glycogène synthase dans un tampon Tris de 20 mM, pH 7,8; mélanger et transférer le mélange réactionnel dans une cuvette de méthacrylate jetable.
9. Placez la cuvette dans le spectrophotomètre et enregistrez l’absorbance à 340 nm à intervalles chronométrés pendant 10 à 20 min. Tracer les absorbances obtenues en fonction du temps.
   NOTE: Une réaction dans laquelle l’échantillon de glycogène synthase est remplacé par un tampon Tris de 20 mM doit être effectuée pour contrôler l’oxydation non enzymatique du NADH. Selon la pureté de l’échantillon, d’autres réactions de contrôle peuvent être nécessaires. Voir Discussion pour plus de détails.
10. Déterminez la vitesse de réaction (voir Résultats pour plus de détails).

2. Détermination de l’activité de la glycogène phosphorylase

1. Préparer les solutions mères comme indiqué dans le tableau 3 (avant le jour de l’expérimentation).

Composant	Itinéraire
125 mM TUYAUX pH 6,8	Dissoudre 3,78 g de PIPES dans l’eau.  Ajuster le pH à 6,8 avec NaOH et porter le volume à 100 mL avec de l’eau.
8 % p/v de glycogène d’huître	Peser 0,8 g de glycogène d’huître et ajouter à l’eau.  Faire porter le volume final jusqu’à 10 mL avec de l’eau et réchauffer doucement/mélanger pour dissoudre le glycogène.  Conserver congelé à -20 °C.
200 mM Na phosphate pH 6,8	Dissoudre 2,63 g de Na2HPO4.7H2Oet 1,41 g deNaH2PO4. H2Odans l’eau.  Porter le volume à 100 ml avec de l’eau.
1 mM de glucose-1,6-bisphosphate	Dissoudre 2 mg de glucose-1,6-bisphosphate dans 4 mL d’eau.  Aliquote et conserver congelé à -20 °C.   Stable depuis au moins plusieurs mois.
10 mM NADP	Dissoudre 23 mg de NADP dans 3 mL d’eau.  Aliquote et conserver congelé à -20 °C.   Stable depuis au moins plusieurs mois.

Tableau 3 : Solutions mères requises pour le dosage de l’activité de la glycogène phosphorylase.

2. Préchauffer un bain-marie à 30 °C
3. Mettre en place chaque essai de glycogène phosphorylase dans un tube de 1,5 mL en ajoutant les réactifs de mélange réactionnel énumérés ci-dessous (tableau 4).

Composant	Volume (μl)
Tampon PIPES 125 mM pH 6,8	160
Eau	70
8 % p/v de glycogène d’huître	100
200 mM Na phosphate 6,8	400
1 mM de glucose-1,6-bisphosphate	20
10 mM NADP	20
Volume final	770

Tableau 4 : Composition du mélange réactionnel pour le dosage de l’activité de la glycogène phosphorylase.

NOTE: Pour faciliter la mise en place, un mélange maître peut être fait contenant suffisamment de chacun des réactifs énumérés ci-dessus pour compléter le nombre de dosages prévus.

5. Préparer une réaction à blanc contenant les composants énumérés dans le tableau 4 , mais ajouter 30 μL supplémentaires de tampon PIPES 25 mM, pH 6,8 (préparé en diluant 125 mM de tampon PIPES 1/5 avec de l’eau). Transférer dans une cuvette de méthacrylate jetable et utiliser pour régler le zéro sur le spectrophotomètre à 340 nm.
6. Prélever une partie aliquote de 770 μL de mélange réactionnel dans un tube de 1,5 mL. Ajouter 1 μL de glucose-6-phosphate déshydrogénase et 1 μL de phosphoglucomutase, mélanger doucement et incuber à 30 °C pendant 3 min pour préchauffer le mélange réactionnel.
7. Ajouter 30 μL de l’échantillon contenant la glycogène phosphorylase dans un tampon PIPES 25 mM, pH 6,8. Mélanger et transférer le mélange réactionnel dans une cuvette de méthacrylate jetable.
8. Placez la cuvette dans le spectrophotomètre et enregistrez l’absorbance à 340 nm à intervalles chronométrés pendant 10 à 20 min. Tracer les absorbances obtenues en fonction du temps.
   REMARQUE : Une réaction dans laquelle la glycogène phosphorylase est remplacée par un tampon PIPES de 25 mM doit être incluse. Selon la pureté de l’échantillon de glycogène phosphorylase, d’autres contrôles peuvent également être nécessaires (voir la discussion pour plus de détails).
9. Déterminer la vitesse de réaction (voir Résultats représentatifs pour plus de détails).

3. Détermination de l’activité enzymatique débranchante du glycogène

1. Préparer les solutions mères comme indiqué dans le tableau 5 (avant le jour expérimental).

Composant	Itinéraire
Tampon maléate de 100 mM	Dissoudre 1,61 g d’acide maléique dans ~ 80 mL d’eau.  Ajustez le pH à 6,6 avec NaOH et faites le volume final jusqu’à 100 mL avec de l’eau.
300 mM de chlorhydrate de triéthanolamine/ 3 mM de MgSO4 pH 7,5	Dissoudre 27,85 g de chlorhydrate de triéthanolamine et 0,370 g deMgSO4. 7H2O dans ~ 400 mL d’eau.  Ajuster le pH à 7,5 avec NaOH et compléter jusqu’à un volume final de 500 mL avec de l’eau.
150 mM ATP/12 mM NADP	Dissoudre 1,24 g d’ATP dans ~ 10 mL d’eau.  Surveillez le pH et ajoutez du NaOH pour maintenir un pH de ~ 7,5 lorsque l’ATP se dissout.  Ajouter 0,138 g de PNDA.  Ajuster le pH à ~ 7,5 avec NaOH et compléter à un volume final de 15 mL avec de l’eau. Conserver dans des aliquotes à – 20 °C. Stable pendant plusieurs mois.
Tampon phosphate Na 50 mM pH 6,8	Dissoudre 32,81 g deNa2HPO4,7H2Oet 17,61 g de NaH2PO4. H2Odans l’eau.  Porter le volume à un volume final de 5 L avec de l’eau.

Tableau 5 : Solutions mères requises pour l’essai de l’activité enzymatique débranchante du glycogène.

2. Préparer la phosphorylase limite la dextrine
   1. Dissoudre 0,3 g de glycogène d’huître dans 10 mL de tampon phosphate de sodium 50 mM, pH 6,8.
   2. Dissoudre suffisamment de poudre de phosphorylase A lyophilisée pour donner 60 U d’activité dans un tampon phosphate de 50 mM, pH 6,8.
      NOTE: Selon le lot de phosphorylase A acheté, la masse nécessaire variera mais se situe généralement entre 5 et 10 mg de poudre.
3. Ajouter 60 U de phosphorylase A à la solution de glycogène et transférer dans une poche de dialyse. Dialyser à température ambiante contre 1 L de tampon phosphate de sodium 50 mM, pH 6,8 pendant 8 h. Passez au tampon de dialyse frais et poursuivez l’incubation pendant la nuit.
4. Ajouter encore 10 U de phosphorylase A et passer à un tampon de dialyse frais. Après 8 h, passez à nouveau au tampon de dialyse frais et continuez l’incubation pendant la nuit.
5. Transférer le contenu de la poche de dialyse dans un tube centrifuge et faire bouillir pendant 10 min. Refroidir sur la glace, puis centrifuger à 10 000 x g pendant 15 min.
6. Transvaser le surnageant dans une poche de dialyse et dialyser pendant 8 h contre trois changements de 2 L d’eau distillée.
7. Transférer le contenu de la poche de dialyse dans un tube à centrifuger de 50 mL. Mesurer le volume et ajouter deux volumes d’éthanol absolu glacé pour précipiter la limite de dextrine. Laissez le tube reposer sur la glace pendant 30 minutes.
   NOTE: Un précipité blanc devrait commencer à se former immédiatement après l’ajout d’éthanol, mais, si ce n’est pas le cas, ajouter une goutte de 3 M NaCl.
8. Centrifuger à 15 000 x g pendant 15 min et jeter le surnageant. Rincer deux fois la pastille blanche de dextrine limite avec de l’éthanol à 66 % v/v, en utilisant ~30 mL pour chaque rinçage.
9. Transférer la limite de dextrine dans un mortier et laisser sécher complètement à l’air. Lorsque la limite de dextrine est sèche, broyer en poudre à l’aide d’un pilon et transférer dans un récipient approprié pour le stockage; sec à 4 °C.
10. Pour une utilisation comme substrat enzymatique débranchant, préparer une solution à 1% p/v dans de l’eau.
11. Préchauffer un bain-marie à 30 °C.
12. Préchauffez un bloc chauffant ou un bain-marie à 95 °C.
13. Préparer quatre tubes de 1,5 mL contenant chacun 100 μL de tampon maléate, 80 μL de phosphorylase limite la dextrine et 10 μL d’eau. Ces tubes seront utilisés pour effectuer le dosage enzymatique de débranchement. Étiqueter deux des tubes Réaction et les deux autres tubes Contrôle.
14. À intervalles réguliers, ajouter 10 μL de l’échantillon d’enzyme débranchante dans les tubes de réaction et 10 μL de tampon qui a été utilisé pour préparer l’échantillon d’enzyme ramifiée dans les tubes témoins. Incuber à 30 °C.
15. À des moments définis (p. ex. incubation de 5, 10 et 20 minutes), prélever 50 μL de chaque tube de réaction et de contrôle et placer immédiatement dans le bloc chauffant ou le bain-marie à 95 °C. Chauffer pendant 3 min.
16. Centrifuger à 15 000 x g pendant 2 min afin d’éliminer les protéines précipitées.
    Remarque : À ce stade, la procédure peut être arrêtée si nécessaire. Les échantillons chauffés peuvent être conservés congelés à -20 °C jusqu’à la mesure du glucose libéré (étape 17, ci-dessous).
17. Mesure du glucose libéré
    1. Transfèrent 40 μL du surnageant des échantillons chauffés dans des cuvettes de méthacrylate jetables et ajoutez 833 μL de tampon chlorhydrate de triéthanolamine/sulfate de magnésium, 67 μL de mélange NADP/ATP et 60 μL d’eau. Mélanger en pipitant doucement de haut en bas, en prenant soin de ne pas introduire de bulles d’air.
       NOTE: Pour faciliter la mise en place, un mélange maître peut être fait contenant suffisamment de chacun des réactifs énumérés ci-dessus pour compléter le nombre de dosages prévus.
    2. Préparer une réaction à blanc en combinant 100 μL de tampon maléate, 80 μL de phosphorylase limite la dextrine et 20 μL d’eau. Bien mélanger et transférer 40 μL dans une cuvette de méthacrylate jetable. Ajouter 833 μL de chlorhydrate de triéthanolamine/sulfate de magnésium, etc., comme décrit à l’étape 3.17.1.
    3. Réglez le zéro sur le spectrophotomètre à 340 nm en utilisant la réaction de blanc.
    4. Ajouter 0,5 μL de glucose-6-phosphate déshydrogénase à chaque cuvette. Mélanger doucement en pipitant lentement de haut en bas. Incuber à température ambiante pendant 10 min, puis enregistrer l’absorbance à 340 nm.
       NOTE: Les valeurs d’absorption doivent être faibles, ce qui signifie peu de contamination des échantillons par le glucose-6-phosphate.
    5. Ajouter 0,5 μL d’hexokinase à chaque cuvette. Mélanger doucement en pipitant lentement de haut en bas. Incuber à température ambiante pendant 15 min, puis enregistrer l’absorbance à 340 nm.
    6. Poursuivre l’incubation à température ambiante pendant 5 minutes supplémentaires. Enregistrez à nouveau l’absorbance à 340 nm. Si l’absorption a augmenté par rapport à celle enregistrée à 15 min, poursuivre l’incubation pendant encore 5 minutes et vérifier à nouveau l’absorption. Enregistrer l’absorption finale à 340 nm obtenue.
    7. Pour chaque échantillon, soustraire l’absorbance à 340 nm enregistrée après addition de glucose-6-phosphate déshydrogénase de l’absorbance finale obtenue après addition d’hexokinase. Tracer les valeurs obtenues en fonction de la durée pendant laquelle l’échantillon correspondant a été incubé avec l’enzyme débranchante.

4. Détermination de l’activité de l’enzyme ramifiée du glycogène

1. Avant la journée expérimentale, préparer la solution d’iode/KI en dissolvant d’abord 2,6 g de KI dans 10 mL d’eau. Dans une hotte, peser 0,26 g d’iode et ajouter à la solution de KI.
   ATTENTION : L’iode est nocif au contact de la peau ou en cas d’inhalation. Mélanger pour dissoudre l’iode et conserver à 4 °C, à l’abri de la lumière. Préparez également un tampon PIPES de 125 mM, pH 6,8 (voir tableau 3).
2. Lorsque vous commencez les expériences, constituez un stock de travail de réactif d’iode acidifié.
   1. Prélever 45,7 mL d’eau dans un tube de 50 mL et ajouter 150 μL de solution d’iode/KI suivi de 150 μL de HCl 1 M
   2. Bien mélanger et conserver à 4 °C, à l’abri de la lumière. La solution est stable pendant au moins 3 jours dans ces conditions.
3. Le jour de l’expérience, préparez une solution fraîche d’amylose à 10 mg/mL.
   1. Peser 50 mg d’amylose et transférer dans un tube de 15 mL.
   2. Ajouter 200 μL d’éthanol absolu et agiter doucement.
   3. Ajouter 500 μL de 2 M KOH et agiter doucement.
      ATTENTION : KOH provoque de graves brûlures cutanées et des lésions oculaires. Utiliser un équipement de protection individuelle approprié.
   4. Ajouter 0,5 mL d’eau en secouant doucement. Si l’amylose ne se dissout pas complètement, ajoutez 0,5 mL d’eau supplémentaire.
   5. Ajuster le pH à ~6,5 à 7,0 avec 1 M HCl.
      ATTENTION : HCl peut provoquer une irritation des yeux, de la peau et des voies respiratoires. Utiliser un équipement de protection individuelle approprié.
   6. Ajouter de l’eau pour atteindre un volume final de 5 mL.
   7. Stériliser par passage à travers un filtre d’extrémité de seringue de 0,2 μm et conserver à température ambiante. Ne pas refroidir et congeler.
4. Préchauffer un bain-marie à 30 °C.
5. Préparer douze tubes de 1,5 mL, chacun contenant 1 mL de réactif d’iode acidifié. Réserver sur le banc. Ceux-ci seront utilisés pour arrêter la réaction enzymatique ramifiée.
6. Préparer quatre tubes de 1,5 mL contenant chacun 150 μL d’amylose, 150 μL de tampon PIPES et 45 μL d’eau. Ces tubes seront utilisés pour effectuer le dosage enzymatique ramifié. Étiqueter deux des tubes Réaction et les deux autres tubes Contrôle.
7. À intervalles réguliers, ajouter 5 μL d’échantillon d’enzyme ramifiée dans les tubes de réaction et 5 μL de tampon qui a été utilisé pour préparer l’échantillon d’enzyme ramifiée dans les tubes témoins. Incuber à 30 °C.
8. À des moments définis (p. ex. 5, 10 et 15 minutes d’incubation), prélever 10 μL de chaque tube de réaction et de contrôle et ajouter aux tubes de 1,5 mL qui contiennent 1 mL de réactif d’iode acidifié. Ajouter 140 μL d’eau supplémentaires et bien mélanger. Transférer dans des cuvettes jetables.
   NOTE: Les échantillons doivent être de couleur bleue et la solution doit être exempte de précipité. La couleur formée est stable pendant au moins 2 h à température ambiante.
9. Préparer un échantillon contenant 1 mL de réactif d’iode acidifié et 150 μL d’eau. Bien mélanger et transférer dans une cuvette. Utilisez cette cuvette pour régler le zéro du spectrophotomètre à 660 nm.
10. Lire l’absorbance de chacun des douze échantillons à 660 nm. Déterminer la vitesse de la réaction enzymatique ramifiée en soustrayant l’absorbance obtenue en présence d’enzyme ramifiée (réaction) de l’absorbance lorsqu’aucune enzyme ramifiée n’est présente (témoin) à chaque point temporel. Voir Résultats représentatifs pour plus de détails.

5. Évaluation qualitative de la ramification du glycogène

1. Préparer la solution saturée de chlorure de calcium en ajoutant 74,5 g de chlorure de calcium anhydre à ~40 mL d’eau et en agitant. Ajouter un peu plus d’eau et continuer à remuer. Porter le volume à 100 mL avec de l’eau et continuer à agiter jusqu’à ce que le CaCl₂ soit complètement dissous.
2. Préparer un stock de travail de réactif colorant iode/CaCl 2 en mélangeant 50 μL de solution mère de KI/iode (voir étape 4.1 ci-dessus) avec 13 mL de solution saturée de CaCl₂ dans un tube de 15 mL. Bien mélanger et conserver à 4 °C, à l’abri de la lumière. La solution est stable pendant au moins 1 semaine dans ces conditions.
3. Détermination de la ramification
   1. Dans un tube de 1,5 mL, mélanger 650 μL de bouillon de réactif coloré iode/CaCl₂ avec 100 μL d’eau et bien mélanger. Transférer la solution dans une cuvette de méthacrylate jetable.
      REMARQUE: La solution dans la cuvette doit être claire et de couleur jaune pâle.
   2. Placer dans le spectrophotomètre et, en mode de balayage de longueur d’onde, collecter un spectre de fond de 330 nm à 800 nm.
   3. Dans un tube de 1,5 mL, combiner 650 μL de réactif colorimétrique iode/CaCl₂ avec 50 μg de glycogène d’huître. Porter le volume final à 750 μL avec de l’eau et bien mélanger. Transférer la solution dans une cuvette de méthacrylate jetable.
      REMARQUE: La solution dans la cuvette doit être claire et d’une couleur orange / brun foncé.
   4. Placer dans le spectrophotomètre et recueillir un spectre d’absorption de 330 nm à 800 nm.
   5. Répétez les étapes 4.4.3 à 4.4.4 avec 50 μg d’amylopectine et 30 μg d’amylose.
      NOTE: L’échantillon d’amylopectine doit être jaune/vert et l’échantillon d’amylose doit être vert/bleu. Les deux échantillons doivent être clairs. Les complexes colorés formés sont stables, sans changement de spectre d’absorption, pendant au moins 1 h à température ambiante.
   6. Pour obtenir une indication de la structure ramifiée d’un échantillon de glycogène non caractérisé, combiner 25 μg à 50 μg de glycogène avec 650 μL de réactif colorimétrique iode/CaCl₂ . Procéder comme ci-dessus, en portant le volume à 750 μL avec de l’eau, en mélangeant bien et en transférant dans une cuvette de méthacrylate.
      NOTE: L’échantillon de glycogène doit donner une couleur jaune/orange à orange/brun en fonction du degré de ramification (longueur des chaînes externes) du glycogène présent. Encore une fois, l’échantillon doit être clair. Voir Résultats représentatifs pour plus de détails.
   7. Recueillir le spectre d’absorption.

Résultats

Détermination de l’activité de la glycogène synthase
La figure 1 montre des résultats représentatifs d’essais de glycogène synthase utilisant des enzymes purifiées. Dans le panneau A, après un léger décalage, on a observé une diminution linéaire de l’absorption à 340 nm au fil du temps pendant une période d’environ 12 min. Le taux de variation de l’absorption sur la figure 1A était de ~0,12 unité d’absorbance/min. ...

Discussion

En général, les principaux avantages de toutes les méthodes présentées sont leur faible coût, leur facilité, leur rapidité et leur manque de dépendance à l’égard d’équipements spécialisés. Le principal inconvénient qu’ils partagent tous est la sensibilité par rapport aux autres méthodes disponibles. La sensibilité des procédures impliquant la production ou la consommation de NADH/NADPH est facile à estimer. Étant donné que le coefficient d’extinction du NADH/NADPH est de 6,22 M-1 cm-1, une s...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amylopectin (amylose free) from waxy corn	Fisher Scientific	A0456
Amylose	Biosynth Carbosynth	YA10257
ATP, disodium salt	MilliporeSigma	A3377
D-Glucose-1,6-bisphosphate, potassium salt	MilliporeSigma	G6893
D-glucose-6-phosphate, sodium salt	MilliporeSigma	G7879
Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Grade I, from yeast	MilliporeSigma	10127655001
Glycogen, Type II from oyster	MilliporeSigma	G8751
Hexokinase	MilliporeSigma	11426362001
Methacrylate cuvettes, 1.5 mL	Fisher Scientific	14-955-128	Methacrylate is required since some procedures are conducted at 340 nm or below
β-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium salt	MilliporeSigma	N0505
β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt	MilliporeSigma	43420
Nucleoside 5'-diphosphate kinase	MilliporeSigma	N0379
Phosphoenolpyruvate, monopotassium salt	MilliporeSigma	P7127
Phosphoglucomutase from rabbit muscle	MilliporeSigma	P3397
Phosphorylase A from rabbit muscle	MilliporeSigma	P1261
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle	MilliporeSigma	P0294
UDP-glucose, disodium salt	MilliporeSigma	U4625