シングルセルマルチオミクス実験のためのマウス頸動脈内腔からの内皮細胞の単離

要約

我々は、1細胞オミクス実験を行うために、安定したまたは乱れた流動条件にさらされたマウス頸動脈の内腔から内皮細胞および核を単離する方法を提示する。

要約

アテローム性動脈硬化症は、血流障害(d-flow)にさらされる動脈領域の炎症性疾患です。 D-flow は、内皮における遺伝子の発現をトランスクリプトームおよびエピゲノムレベルで調節し、動脈硬化促進反応をもたらす。最近、マウス部分頸動脈結紮(PCL)モデルを使用して、トランスクリプトミクスおよびクロマチンアクセシビリティの変化を単一細胞分解能で決定するために、シングルセルRNAシーケンシング(scRNAseq)およびシングルセルアッセイフォートランスポザーゼアクセスクロマチンシーケンシング(scATACseq)研究が実施されました。内皮細胞(EC)は動脈壁の全細胞集団のごく一部であるため、管腔消化法を使用してEC濃縮シングルセル製剤を入手しました。この研究では、マウスは、右頸動脈(RCA)を対照として使用しながら、左頸動脈(LCA)に d-flow を誘導するPCL手術を受けました。頸動脈はPCL手術の2日後または2週間後に解剖されました。各頸動脈の内腔にコラゲナーゼ消化を行い、内皮濃縮単一細胞または単一核を得た。これらの単一細胞および単一核調製物は、続いて10倍ゲノミクスマイクロ流体セットアップを使用してバーコード化されました。次に、バーコード化された単一細胞と単一核を、ハイスループットDNAシーケンサーでのRNA調製、ライブラリ生成、およびシーケンシングに利用しました。バイオインフォマティクス処理後、scRNAseqおよびscATACseqデータセットは、主にECからなる管腔消化からさまざまな細胞タイプを同定しました。平滑筋細胞、線維芽細胞、および免疫細胞も存在した。このEC濃縮法は、全動脈消化法では困難であった内皮に対する血流の影響を理解するのに役立ちました。EC濃縮シングルセル調製法は、これらの遺伝子に対する血流の影響が研究されていないECノックアウトおよびトランスジェニックマウスにおけるシングルセルオミクス研究を行うために使用できます。重要なことに、この技術は、同様の機構研究を行うために、ヒト動脈外植片からEC濃縮単一細胞を単離するように適合させることができる。

概要

この研究室は以前、d-flowの誘導が高脂血症マウスの迅速かつ頑丈なアテローム性動脈硬化症の発症につながることを実証しました^1,2。dフロー誘発性アテローム性動脈硬化症の新しいマウスモデルは、部分頸動脈結紮(PCL)手術を使用して可能でした³。PCL手術は、結紮された左頸動脈(LCA)に低振動血流状態またはdフローを誘発します。対照的に、反対側の右頸動脈(RCA)は安定した層流(s流)に直面し続けています。以前は、内皮細胞に対するd-flowの影響を理解するために、部分結紮手術後に頸動脈を解剖し、フェノールおよびグアニジンイソチオシアネートベースの溶解剤(管腔RNA/DNAフラッシング法)^2,4で洗い流し、内皮に富む「プールバルク」RNAまたはDNAを提供しました。次に、これらのプールされたバルクRNAまたはDNAを、トランスクリプトーム研究またはエピゲノムDNAメチローム研究のためにそれぞれ処理した^4、5、6。これらの研究は、内皮生物学とアテローム性動脈硬化症における役割が広範囲に調査された複数の流れ感受性遺伝子とマイクロRNAを発見するのに役立ちました^4,6,7。

しかし、内皮濃縮にもかかわらず、これらのバルクRNA/DNA研究は、d-flow誘発性アテローム性動脈硬化症における動脈壁における各細胞タイプの特定の役割を区別することができなかった。この制限を克服するために、内皮濃縮単一細胞(sc)単離およびscRNAおよびscATACシーケンシング研究を実施しました⁸。このために、C57Bl6マウスは、コントロールとしてsフロー曝露RCAを使用しながら、LCAにdフローを誘導するためのPCL手術を受けました。PCL手術の2日または2週間後、マウスを屠殺し、頸動脈を解剖してクリーンアップしました。LCAとRCAの両方の内腔にコラゲナーゼを注入し、ECを有意な画分として含む管腔コラゲナーゼ消化物および他の動脈細胞を採取した。シングルセル懸濁液(scRNAseq)またはシングルヌクレイ懸濁液(scATACseq)を調製し、10倍ゲノミクスセットアップを使用して各細胞または核の一意の識別子でバーコード化しました。RNAをcDNAライブラリー調製に供し、配列決定した。

scRNAseqおよびscATACseqデータセットは、Cell Ranger Single-Cell Softwareを使用して処理され、SeuratおよびSignac Rパッケージ^9,10によってさらに分析された。各細胞と核には、これらの分析から細胞タイプが割り当てられ、マーカー遺伝子と固有の遺伝子発現パターンに基づいて細胞タイプにクラスター化されました。scRNAseqおよびscATACseqの結果は、これらの単一細胞調製物がECで濃縮され、平滑筋細胞(SMC)、線維芽細胞、および免疫細胞も含むことを示しました。

さらなる分析により、管腔消化におけるEC集団は非常に発散的で可塑性(8つの異なるECクラスター)であり、血流に反応することが明らかになりました。最も重要なことは、これらの結果は、 d-flow がECをアテロームで保護された抗炎症表現型から、炎症誘発性、内皮から間葉系への移行、内皮幹/前駆細胞への移行、そして最も驚くべきことに内皮から免疫細胞への移行を含むアテローム誘発性表現型に再プログラムすることを示しました。さらに、scATACseqデータは、新しいフロー依存性のクロマチンアクセシビリティの変化と転写因子結合部位をゲノムワイドに明らかにし、いくつかの新しい仮説の基礎を形成します。マウス頸動脈から単一細胞マルチオミクス研究のための単一内皮細胞を調製するための方法論とプロトコルを以下に詳述します。

プロトコル

以下に説明するすべての動物の手順は、エモリー大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。非高コレステロール血症、年齢および性別が一致したC57BL / 6マウスを使用して、性依存的な変動を軽減し、高コレステロール血症状態の合併症を相殺しました。

1.部分頸動脈結紮術(PCL)手術

注:LCAの部分頸動脈結紮は前述のように実施され、実証されました³。

1. 麻酔気化器を使用した手順全体を通して、イソフルラン吸入(誘導のために酸素中に5%イソフルオラン、その後維持のために1.5%)によってマウスを麻酔します。マウスをデルタ相等温パッドに置き、手術中の体温の損失を防ぎます。
2. 露出角膜炎を防ぐために眼軟膏を塗布し、つま先のピンチ反応がないことで麻酔の深さを確認します。
3. ブプレノルフィン0.05 mg / kgを皮下注射して、痛みを先制的に管理します。.ベタジンとイソプロパノール溶液を3回塗布して洗浄することにより、脱毛領域を消毒します。ベタジンが手術領域を滅菌するための最後のステップであり、中央から始めて側面で終わることを確認してください。
4. 無菌技術を使用して、頸部領域に腹側の正中線切開(~1 cm)を行い、鈍的解剖によってLCA分岐点を露出させます。
5. 左内頸動脈、外頸動脈、および後頭動脈を6-0絹縫合糸で結睭化する。上甲状腺動脈はそのままにしておきます。
6. 皮膚を近似し、組織接着剤および/または縫合糸で切開を閉じます。
7. マウスを事前に温めた回復ケージ(37°Cに維持)に移し、手術後の低体温を避けるために清潔なタオルの上に最大1時間置きます。
   注:私たちの経験では、術後の痛みの管理には通常、ブプレノルフィン(0.05 mg / kg)の先制単回投与で十分です。動物が最初の24時間後に苦しんでいる場合は、ブプレノルフィンの反復投与を行うことができます。.正しく実施されれば、この手順に関連する死亡率はなく、マウスへの術後ストレスは最小限である。マウスはそれぞれのケージに戻され、手術後に毎日監視されます。
8. 灌流セットアップを準備します。
   1. IVバッグに10 U / mLのヘパリンを含む0.9%NaCl(生理食塩水)を使用してください。IVバッグを地面から244〜274 cm(8〜9フィート)、または解剖板より約122〜152 cm(4〜5フィート)高く引っ掛けます。バタフライニードルを生理食塩水ラインの端に取り付け、IVラインから気泡を洗い流します。

2.犠牲後の頸動脈の分離

1. 施設IACUCプロトコルに従った_CO2 吸入によってマウスを屠殺する。
2. マウスの皮膚に70%エタノールをスプレーし、吸着剤ペーパータオルを含む解剖ボード上の仰臥位に置きます。粘着テープまたは21 G針を使用して、マウスの足を解剖板上の吸着剤タオルに固定します。
3. 滅菌ハサミを使用して、腹部から胸部の上部までマウスの皮膚を取り除きます。
4. はさみを使用して、鈍的解剖によって胸郭の下の腹壁を開きます。
5. はさみを使用して、横隔膜の長さに沿って慎重に切開を行い、胸骨が持ち上げられるまで胸郭の両側の肋骨を通り抜け続けます。鉗子で胸骨をそっと持ち上げます。その後、胸郭を外して心臓を露出させます。
6. 胸腺と心臓の結合組織を慎重に取り除き、主要な血管を視覚化します。
7. 大静脈をハサミで切断して、血液が閉鎖循環から出るようにします。
8. 心臓の頂点を通ってIVラインに接続された21 Gのバタフライ針を左心室に挿入し、室温の生理食塩水で2〜3分間逆行性灌流させます。生理食塩水バッグを地面から8〜9フィートの高さに保つことにより、通常の生理食塩水の一定の流量が維持されていることを確認します。
   注意: 肺と肝臓は青白くなり、最適な灌流を示します。各マウスに約20 mLの灌流バッファーを使用します。
9. 首の領域から皮膚を取り除き、すべての脂肪、筋肉、結合組織を取り除き、頸動脈を露出させます(図1A)。
   注:残りの手順は、解剖顕微鏡下で行われます。
10. 視野を調整して、ライゲーション部位を特定します。10mmのマイクロ解剖ハサミを使用して、LCAの結紮部位の下に小さな切開を行い、灌流を可能にします。
11. 左心室を介してさらに1分間再度灌流し、LCAが十分に灌流され、目に見える血液の痕跡がないことを確認します。
12. 細い先端の鉗子と小さなスプリングはさみを使用して、頸動脈が体に付着した状態で頸動脈周囲の外膜組織を慎重に除去します。
    注意: この洗浄ステップでは、生存不能細胞の数が増える可能性があるため、頸動脈を圧迫したり伸ばしたりしないように細心の注意を払ってください。正しく実施された場合、最終細胞懸濁液中の細胞生存率は通常>93%である。

3. マウス頸動脈からの内皮細胞高濃縮単一細胞単離

注:下記の試薬は、事前に調製し、使用するまで4°Cで保存することができます:表 1にリストされている試薬を含む1xおよび0.1x単核溶解バッファー。 表1に列挙された試薬を含む単核洗浄バッファー; 表1にリストされている試薬を使用した単一核核バッファーレシピ。これらのバッファーの作業在庫は、メーカーのプロトコルに従って準備する必要があります。 消化バッファー組成:0.5%ウシ胎児血清(FBS)含有リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中のコラゲナーゼII型600 U / mLおよびDNase I 60 U / mL。

1. 頸動脈がまだ付着している間に、頸動脈の外側を通常の生理食塩水で洗い、微量の血液を洗い流します。
2. 29G針を装着したインスリン注射器を用いて、左頸動脈遠位端の内腔に~50μLの消化バッファーを注入する。消化バッファーが頸動脈を満たし始めたら、頸動脈の近位端をマイクロクリップでクランプします(図1B)。さらに15〜20 μLの消化バッファーを内腔に導入し、消化バッファーの放出を避けるために遠位端をクリップします。
3. マウスから頸動脈を注意深く移植し(図1B、C)、温かい(37°C)Hepes緩衝生理食塩水を含む35 mmディッシュに入れます。
   注意: 両方のclを確認してくださいampsがしっかりと配置されています。クランプが緩むと、消化溶液が内腔から漏れ出し、得られる細胞数に影響を与える可能性があります。これが発生した場合は、頸動脈の開放端から29 Gの針を取り付けたインスリン注射器を使用して酵素溶液を追加し、クランプを再度固定します(図1D)。酵素緩衝液が再び漏れた場合は、外植プロセス中に頸動脈が切断される可能性があります。この場合、頸動脈を破棄し、サンプルを研究から除外します。頸動脈の乱暴な取り扱いを繰り返すと、細胞の生存率と単一細胞調製の品質が低下します。 左右の頸動脈を識別し、正しくラベルを付けるように注意してください。
4. 外植した頸動脈を断続的に揺動させながら37°Cで45分間インキュベートします。

4.頸動脈を洗い流す

1. 管腔酵素消化が完了したら、35 mm皿からクランプと一緒に頸動脈を取り外します。消化バッファーが漏れないように注意しながら、各クランプを慎重に取り外します。
2. 頸動脈の一端を細い鉗子で1.5mLの微量遠心チューブの上にそっと持ちます。もう一方の手で、100 μLの温かい消化バッファー(37°C)を含むインスリン注射器を取り付けた29 Gの針を内腔に挿入します(図1D)。
3. 頸動脈の内腔を微小遠心チューブにすばやく洗い流します。0.3 mLのFBSを1.5 mLチューブに加えて酵素反応をブロックします。チューブを氷の上に置きます。
   注:フラッシングには、管腔酵素消化からの細胞が含まれています。FBSを添加して温度を下げると、酵素消化プロセスが停止します。調製物中の細胞数が多く、破片や脂肪組織が含まれている場合は、不要な組織の破片を除去するために、50または70μmの細胞ストレーナーの使用を強くお勧めします。単一細胞数を増やすには、複数の頸動脈を洗い流すことをお勧めします。ここでは、少なくとも5,000個の細胞を得るために、10〜12個の頸動脈を洗い流し、1つのサンプルとしてプールした。
4. 固定角度ローターを備えた遠心分離機を使用して、細胞を500 × g で4°Cで5分間遠心分離します( 材料の表を参照)。
5. 上清を廃棄し、細胞解離試薬( 材料表を参照)を含む消化バッファーに細胞ペレットを37°Cで5分間再懸濁して、すべての細胞を単一細胞に分離します。
   注:調製物中の細胞数が少ない場合は、遠心分離機の速度を最大2,000〜3,000 × g まで上げて、細胞をスピンダウンします。さらに、0.5 mLの遠沈管を使用すると、チューブの底部にある細胞ペレットをよりよく視覚化できます。
6. 0.15 mLのFBSを0.5 mLチューブに加え、酵素反応をブロックします。
7. ステップ4.4と同様に、固定角度ローターを備えた遠心分離機を使用して、単一細胞懸濁液を500 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
8. 上清を廃棄し、0.2 mLマイクロ遠心チューブ内のPBS中の100 μLの氷冷1%ウシ血清アルブミン(BSA)溶液に細胞を再懸濁します。
   注:0.2 mLの遠心分離チューブを使用すると、チューブの底にある単一細胞ペレットの視覚化が向上します。

5. 単細胞・単核解析

1. scRNAseqのシングルセル調製物を再懸濁して提出します。
   1. 100 μLの氷冷1%BSAを含むシングルセルペレットをPBS溶液に0.2 mLチューブに再懸濁します。
   2. シングルセルカプセル化のために細胞を再懸濁した後、マイクロフルイディクスベースのシングルセル分割およびバーコードシステムを使用して、すぐにシングルセルカプセル化およびバーコード化に進みます( 材料表を参照)。
   3. サンプルをゲノミクスコアに送信する前に、シングルセル調製物を数えて検査します。細胞凝集体がないことを確認してください。
      注:BSA量を最大2%まで増やすことで、単一細胞の凝集をさらに最小限に抑えることができます。
2. scATACseqの単一細胞調製物を再懸濁して提出します。
   1. 細胞ペレットを氷冷した1x PBS中の0.04%BSAの100 μLに再懸濁し、単一細胞懸濁液を4°Cで500 × g で遠心分離します。
   2. 単一細胞懸濁液を氷冷した0.1倍溶解バッファー(表1)で溶解し、氷上で5分間インキュベートします。
   3. ライセートをP-20ピペットで10回混合し、さらに10分間インキュベートします。
   4. 500 μLのチルド洗浄バッファー(表1)を溶解細胞に加え、ピペットを使用して5回混合します。
      注:70 μmのセルストレーナーを使用して、細胞懸濁液から破片をろ過し、2 mLチューブに移します。
   5. ライセートを500 × g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を廃棄し、核ペレットを希釈した核バッファー(150 μL)に再懸濁します( 材料の 表および 表1を参照)。血球計算^盤11を用いて単核標品をカウントして検査する。
   6. 単一核サンプルをゲノミクスコアに提出して、単一核転位、核分割、ライブラリ調製、およびシーケンシングを行います。
      注:初期細胞数が少ない場合は、核に沿って破片を観察するのが一般的です。したがって、高いセル数から始めることをお勧めします。

結果

44匹のマウスで部分頸動脈結紮手術を行い、部分結紮手術の1日後に超音波検査を行うことでLCAの d-flow の発症を検証しました。部分結紮手術が成功すると、血流速度が低下し、^LCA3の血流が逆転(流れが乱れる)します。頸動脈は結紮後2日または2週間で解剖した.各頸動脈の内腔にコラゲナーゼ消化を行い、内皮濃縮単細胞または単核懸濁液を調製した。細胞収率を高め?...

ディスカッション

この論文は、マウス頸動脈から単一細胞製剤を単離するための詳細なプロトコルを提供します。PCL手術が正しく行われれば、内皮細胞に対する d-flow の影響を正確に研究することができます。外頸動脈、内頸動脈、後頭動脈、上甲状腺動脈など、一般的な頸動脈の枝を正しく識別することが重要です。超音波検査によるフローパターンの検証は、 dフロー 条件の正常な発症をさ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
1x PBS (Cell Culture Grade)	Corning	21040CMX12
1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes	Eppendorf	022-43-108-1
15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile	Fablab	FL4022
50 mL SuperClear Centrifuge Tubes	Labcon	3191-335-028
6-0 Silk Suture Sterile	Covidien	s-1172 c2
70 µm Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged	Thermo Fisher Scientic	08-771-2
Accutase solution,sterile-filtered	Sigma-Aldrich	A6964-100ML	or equivalent
ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix)	10x Genomics	2000122
ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix)	10x Genomics	2000123/ 2000138
Bovine Serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906-500G
Buprenorphine	Med-Vet International	RXBUPRENOR5-V
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit	10X Genomics	1000204
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1	10X Genomics	1000121
Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1	10X Genomics	1000175
Collagenase II	MP Biomedicals	2100502.5
Digitonin	Sigma-Aldrich	D141-100MG
Dissecting Forceps	Roboz Surgical Instruments Co	RS-5005
Dnase1	New England Biolabs Inc	M0303S
Centrifuge (Benchtop-Model # 5425)	Eppendorf	22620444230VR
Fetal Bovine Serum - Premium Select	R&D systems	S11550
Fixed Angle Rotor	Eppendorf	FA-45-24-11-Kit Rotor
HEPES buffered saline	Millipore Sigma	51558
Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe)	BD	305932
Isoflurane	Patterson vet	789 313 89
MACs Smart Strainers (30 µm)	Miltenyi Biotec	130-098-458
MACS SmartStrainers (100 µm)	Miltenyi Biotec	130-098-463
Normal Saline (0.9% sodium chloride)	Baxter International Inc	2B1323
Nuclei Buffer (20x)	10x Genomics	PN 2000153/2000207
PBS (10x), pH 7.4	Thermo Fisher Scientic	70011-044
Small scissors	Roboz Surgical Instruments Co	RS-5675
Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5480	or similar
Tissue Mend II	Webster Veteinanry	07-856-7946
Type II Collagenase	MP biomedicals	2100502.1
Deposited Data
scATACseq FastQ files	NCBI	www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233
scRNAseq FastQ files	NCBI	www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233
Software and Algorithms
Cell Ranger 3.1.0	10X Genomics	https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp
Cicero	Pliner et al., 2018	https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/
Ggplot2 v3.2.1	Hadley Wickham	https://cran.r-project.org
Harmony	Korsunsky et al., 2019	https://github.com/immunogenomics/harmony
ImageJ	Schneider et al., 2012	https://imagej.nih.gov
Monocle 2.8.0	Qiu et al., 2017	https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release
R version 3.6.2	R Foundation	https://www.r-project.org
Seurat 3.1.3	Stuart et al., 2019	https://github.com/satijalab/seurat
Signac 0.2.5	Stuart et al., 2019	https://github.com/timoast/signac