Aislamiento de células endoteliales de la luz de arterias carótidas de ratón para experimentos multiómicos unicelulares

Resumen

Presentamos un método para aislar células endoteliales y núcleos de la luz de arterias carótidas de ratón expuestas a condiciones de flujo estables o alteradas para realizar experimentos ómicos unicelulares.

Resumen

La aterosclerosis es una enfermedad inflamatoria de las regiones arteriales expuestas a un flujo sanguíneo alterado (flujo d). El flujo D regula la expresión de genes en el endotelio a nivel transcriptómico y epigenómico, dando lugar a respuestas proaterogénicas. Recientemente, se realizaron estudios de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNAseq) y ensayo de células individuales para secuenciación de cromatina accesible por transposasa (scATACseq) para determinar los cambios transcriptómicos y de accesibilidad a la cromatina a una resolución de una sola célula utilizando el modelo de ligadura carotídea parcial (PCL) de ratón. Como las células endoteliales (CE) representan una fracción menor de las poblaciones celulares totales en la pared arterial, se utilizó un método de digestión luminal para obtener preparaciones unicelulares enriquecidas con EC. Para este estudio, los ratones fueron sometidos a cirugía de LCP para inducir el flujo d en la arteria carótida izquierda (LCA) mientras usaban la arteria carótida derecha (RCA) como control. Las arterias carótidas se diseccionaron dos días o dos semanas después de la cirugía de LCP. La luz de cada carótida se sometió a la digestión de colagenasa, y se obtuvieron células individuales enriquecidas endotelialmente o núcleos únicos. Estas preparaciones de una sola célula y de un solo núcleo se codificaron posteriormente utilizando una configuración microfluídica de Genomics 10x. Las células individuales y núcleos únicos con código de barras se utilizaron para la preparación de ARN, la generación de bibliotecas y la secuenciación en un secuenciador de ADN de alto rendimiento. Después del procesamiento bioinformático, los conjuntos de datos scRNAseq y scATACseq identificaron varios tipos de células de la digestión luminal, que consisten principalmente en CE. Las células musculares lisas, los fibroblastos y las células inmunes también estaban presentes. Este método de enriquecimiento de EC ayudó a comprender el efecto del flujo sanguíneo en el endotelio, lo que podría haber sido difícil con el método de digestión arterial total. El método de preparación de células individuales enriquecido con CE se puede utilizar para realizar estudios ómicos de células individuales en ratones EC-knockouts y transgénicos donde no se ha estudiado el efecto del flujo sanguíneo sobre estos genes. Es importante destacar que esta técnica se puede adaptar para aislar células individuales enriquecidas con CE de explantes de arterias humanas para realizar estudios mecanicistas similares.

Introducción

Este laboratorio demostró previamente que la inducción del flujo d conduce al desarrollo rápido y robusto de aterosclerosis en ratones hiperlipidémicos ^1,2. El nuevo modelo de ratón de aterosclerosis inducida por flujo D fue posible mediante cirugía de ligadura carotídea parcial (LCP) ³. La cirugía de LCP induce una condición de flujo sanguíneo bajo y oscilatorio o flujo D en la arteria carótida izquierda ligada (LCA). En contraste, la arteria carótida derecha contralateral (ACR) continúa enfrentando un flujo laminar estable (flujo s). Anteriormente, ....

Protocolo

Todos los procedimientos con animales descritos a continuación fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Emory. Se utilizaron ratones C57BL / 6 no hipercolesterolémicos, emparejados por edad y sexo para mitigar la variación dependiente del sexo y compensar cualquier complicación de las afecciones hipercolesterolémicas.

1. Cirugía de ligadura carotídea parcial (LCP)

NOTA: La ligadura parcial de la arteria carótida de LCA se llevó a cabo como se describió y demostró anteriormente³.

1. Anestesiar al ratón por inhalación de isoflurano....

Resultados

Se realizaron cirugías de ligadura carotídea parcial en 44 ratones, y el inicio del flujo d en el LCA se validó mediante la realización de ecografía un día después de la cirugía de ligadura parcial. La cirugía de ligadura parcial exitosa reduce la velocidad del flujo sanguíneo y revierte el flujo sanguíneo (flujo alterado) en el LCA³. Las arterias carótidas se diseccionaron a los dos días o a las dos semanas después de la ligadura. La luz de cada carótida se sometió a la d.......

Discusión

Este documento proporciona un protocolo detallado para aislar preparaciones unicelulares de las arterias carótidas del ratón. La influencia del flujo d en las células endoteliales se puede estudiar con precisión si la cirugía de LCP se realiza correctamente. Es crucial identificar correctamente las ramas de la carótida común, como la carótida externa, la carótida interna, la arteria occipital y la arteria tiroidea superior. La validación de los patrones de flujo por ecografía valida aún más el inici.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
1x PBS (Cell Culture Grade)	Corning	21040CMX12
1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes	Eppendorf	022-43-108-1
15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile	Fablab	FL4022
50 mL SuperClear Centrifuge Tubes	Labcon	3191-335-028
6-0 Silk Suture Sterile	Covidien	s-1172 c2
70 µm Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged	Thermo Fisher Scientic	08-771-2
Accutase solution,sterile-filtered	Sigma-Aldrich	A6964-100ML	or equivalent
ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix)	10x Genomics	2000122
ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix)	10x Genomics	2000123/ 2000138
Bovine Serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906-500G
Buprenorphine	Med-Vet International	RXBUPRENOR5-V
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit	10X Genomics	1000204
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1	10X Genomics	1000121
Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1	10X Genomics	1000175
Collagenase II	MP Biomedicals	2100502.5
Digitonin	Sigma-Aldrich	D141-100MG
Dissecting Forceps	Roboz Surgical Instruments Co	RS-5005
Dnase1	New England Biolabs Inc	M0303S
Centrifuge (Benchtop-Model # 5425)	Eppendorf	22620444230VR
Fetal Bovine Serum - Premium Select	R&D systems	S11550
Fixed Angle Rotor	Eppendorf	FA-45-24-11-Kit Rotor
HEPES buffered saline	Millipore Sigma	51558
Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe)	BD	305932
Isoflurane	Patterson vet	789 313 89
MACs Smart Strainers (30 µm)	Miltenyi Biotec	130-098-458
MACS SmartStrainers (100 µm)	Miltenyi Biotec	130-098-463
Normal Saline (0.9% sodium chloride)	Baxter International Inc	2B1323
Nuclei Buffer (20x)	10x Genomics	PN 2000153/2000207
PBS (10x), pH 7.4	Thermo Fisher Scientic	70011-044
Small scissors	Roboz Surgical Instruments Co	RS-5675
Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5480	or similar
Tissue Mend II	Webster Veteinanry	07-856-7946
Type II Collagenase	MP biomedicals	2100502.1
Deposited Data
scATACseq FastQ files	NCBI	www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233
scRNAseq FastQ files	NCBI	www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233
Software and Algorithms
Cell Ranger 3.1.0	10X Genomics	https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp
Cicero	Pliner et al., 2018	https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/
Ggplot2 v3.2.1	Hadley Wickham	https://cran.r-project.org
Harmony	Korsunsky et al., 2019	https://github.com/immunogenomics/harmony
ImageJ	Schneider et al., 2012	https://imagej.nih.gov
Monocle 2.8.0	Qiu et al., 2017	https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release
R version 3.6.2	R Foundation	https://www.r-project.org
Seurat 3.1.3	Stuart et al., 2019	https://github.com/satijalab/seurat
Signac 0.2.5	Stuart et al., 2019	https://github.com/timoast/signac