Выделение эндотелиальных клеток из просвета сонных артерий мыши для одноклеточных мультиомных экспериментов

Резюме

Представлен метод выделения эндотелиальных клеток и ядер из просвета сонных артерий мышей, подвергающихся воздействию стабильных или нарушенных условий течения для проведения экспериментов с одноклеточной омикой.

Аннотация

Атеросклероз – это воспалительное заболевание артериальных областей, подверженных нарушенному кровотоку (d-потоку). D-поток регулирует экспрессию генов в эндотелии на транскриптомном и эпигеномном уровнях, что приводит к проатерогенным реакциям. Недавно были проведены исследования секвенирования одноклеточной РНК (scRNAseq) и одноклеточного анализа для транспозазного секвенирования хроматина (scATACseq) для определения изменений доступности транскриптома и хроматина при одноклеточном разрешении с использованием модели частичного лигирования сонной артерии мыши (PCL). Поскольку эндотелиальные клетки (ЭК) представляют собой незначительную долю от общего количества клеточных популяций в стенке артерии, для получения одноклеточных препаратов, обогащенных ЭК, был использован метод люминального сбраживания. Для этого исследования мышей подвергали операции PCL, чтобы индуцировать d-поток в левой сонной артерии (LCA) при использовании правой сонной артерии (RCA) в качестве контроля. Сонные артерии были рассечены через два дня или две недели после операции PCL. Просвет каждой сонной артерии подвергали перевариванию коллагеназы, и получали обогащенные эндотелием одиночные клетки или одиночные ядра. Эти одноклеточные и одноядерные препараты были впоследствии штрих-кодированы с использованием 10-кратной микрофлюидной установки Genomics. Штрих-кодированные одиночные клетки и одноядерные ядра затем использовались для подготовки РНК, генерации библиотеки и секвенирования на высокопроизводительном секвенаторе ДНК. После обработки биоинформатики наборы данных scRNAseq и scATACseq идентифицировали различные типы клеток из просветного пищеварения, в основном состоящие из ЭК. Гладкомышечные клетки, фибробласты и иммунные клетки также присутствовали. Этот метод обогащения EC помог понять влияние кровотока на эндотелий, что могло быть затруднено при методе полного переваривания артерий. Метод одноклеточного препарата, обогащенный ЕС, может быть использован для проведения одноклеточных омических исследований у EC-нокаутов и трансгенных мышей, где влияние кровотока на эти гены не изучалось. Важно отметить, что этот метод может быть адаптирован для выделения обогащенных ЕС одиночных клеток из эксплантов артерий человека для выполнения аналогичных механистических исследований.

Введение

Эта лаборатория ранее продемонстрировала, что индукция d-потока приводит к быстрому и бурному развитию атеросклероза у гиперлипидемических мышей ^1,2. Новая мышиная модель d-потока-индуцированного атеросклероза была возможна с использованием операции частичного перевязки сонной артерии (PCL) ³. Хирургия PCL вызывает низкое и колебательное состояние кровотока или d-потока в перевязанной левой сонной артерии (LCA). Напротив, контралатеральная правая сонная артерия (RCA) продолжает сталкиваться со стабильным ламинарным потоком (s-flow). Ранее, чтобы понять влияние d-потока на эндотелиальные клетки, сонные артерии были рассечены после операции частичной перевязки и промыты фенолом и гуанидином изотиоцианатным агентом (метод промывки люминальной РНК / ДНК)^2,4, который обеспечивал обогащенные эндотелием «объединенные объемные» РНК или ДНК. Эти объединенные объемные РНК или ДНК затем обрабатывались для транскриптомных исследований или эпигеномных исследований метилома ДНК, соответственно ^4,5,6. Эти исследования помогли обнаружить множественные чувствительные к потоку гены и микроРНК, роль которых в эндотелиальной биологии и атеросклерозе была широко исследована ^4,6,7.

Однако, несмотря на обогащение эндотелия, эти объемные исследования РНК/ДНК не смогли различить конкретную роль каждого типа клеток в стенке артерии при d-поток-индуцированном атеросклерозе. Для преодоления этого^{ограничения были} проведены исследования обогащенной эндотелиалом одноклеточной (sc) изоляции и секвенирования scRNA и scATAC. Для этого мышей C57Bl6 подвергали операции PCL, чтобы индуцировать d-поток в LCA при использовании RCA, подвергающейся воздействию s-потока, в качестве контроля. Через два дня или две недели после операции PCL мышей приносили в жертву, а сонные артерии рассекали и очищали. Просвет как LCA, так и RCA был наполнен коллагеназой, а люминальные коллагеназы перевариваются, содержащие EC в виде значительной фракции и другие артериальные клетки. Одноклеточную суспензию (scRNAseq) или одноядерную суспензию (scATACseq) готовили и штрих-кодировали уникальными идентификаторами для каждой клетки или ядра с использованием 10-кратной установки геномики. РНК подвергали подготовке и секвенированию библиотеки кДНК.

Наборы данных scRNAseq и scATACseq были обработаны с использованием программного обеспечения Cell Ranger Single-Cell и дополнительно проанализированы пакетами Seurat и Signac R ^9,10. Каждой клетке и ядру был присвоен тип клеток из этих анализов и сгруппирован в тип клеток на основе маркерных генов и уникальных паттернов экспрессии генов. Результаты scRNAseq и scATACseq показали, что эти одноклеточные препараты обогащены ЭК, а также содержат гладкомышечные клетки (SMC), фибробласты и иммунные клетки.

Дальнейший анализ показал, что популяция ЕС в просветном пищеварении сильно расходится и пластична (8 различных кластеров ЕС) и реагирует на кровоток. Самое главное, что эти результаты показали, что d-flow перепрограммирует EC от атеро-защищенного противовоспалительного фенотипа к проатерогенным фенотипам, включая провоспалительный, эндотелиальный переход в мезенхимальный переход, эндотелиальный стволовый / предшественник клеточный переход и, что самое удивительное, эндотелиальный клеточный переход. Кроме того, данные scATACseq показывают новые изменения доступности хроматина, зависящие от потока, и сайты связывания транскрипционного фактора в масштабах всего генома, которые составляют основу нескольких новых гипотез. Методология и протокол подготовки одиночных эндотелиальных клеток для одноклеточных мультиомических исследований из сонных артерий мышей подробно описаны ниже.

протокол

Все процедуры для животных, описанные ниже, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете Эмори. Негиперхолестеринемические, соответствующие возрасту и полу мыши C57BL/6 использовались для смягчения половых вариаций и компенсации любых осложнений гиперхолестеринемических состояний.

1. Частичная перевязка сонной артерии (PCL)

ПРИМЕЧАНИЕ: Частичное перевязывание Сонной артерии LCA проводили, как описано ранее и продемонстрировано³.

1. Обезболивать мышь путем вдыхания изофлурана (5% изофторана в кислороде для индукции и 1,5% после этого для поддержания) на протяжении всей процедуры с использованием анестетика испарителя. Поместите мышь лежа на изотермической прокладке Deltaphase, чтобы предотвратить потерю тепла тела во время операции.
2. Нанесите глазную мазь, чтобы предотвратить экспозиционный кератит, и подтвердите глубину анестезии отсутствием реакции на защемление пальцев ног.
3. Вводят бупренорфин 0,05 мг/кг подкожно для упреждающего лечения боли. Продезинфицируйте эпилированную область путем нанесения и очистки раствором бетадина и изопропанола три раза. Убедитесь, что бетадин является последним шагом для стерилизации области операции, начиная от центра и заканчивая по бокам.
4. Используя асептические методы, сделайте вентральный разрез средней линии (~ 1 см) в области шеи и обнажите точку ветви LCA тупым рассечением.
5. Облизывание левой внутренней сонной, наружной сонной и затылочной артерий 6-0 шелковым швом; оставьте верхнюю щитовидную артерию нетронутой.
6. Приблизитесь к коже и закройте разрез тканевым клеем и/или швами.
7. Перенесите мышь в предварительно нагретую восстановительную клетку (поддерживаемую при 37 °C) и поместите ее на чистое полотенце на срок до 1 ч, чтобы избежать послеоперационного переохлаждения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: По нашему опыту, упреждающей однократной дозы бупренорфина (0,05 мг/кг) обычно достаточно для лечения боли после операции. Повторная доза Бупренорфина может быть введена, если животное находится в бедственном положении после первых 24 часов. При правильном выполнении нет смертности, связанной с этой процедурой, а послеоперационный стресс для мыши минимален. Мышей возвращают в соответствующие клетки и ежедневно контролируют после операции.
8. Подготовьте установку перфузии.
   1. Используйте 0,9% NaCl (обычный физиологический раствор), содержащий 10 Ед/мл гепарина в внутривенном пакете. Зацепите iv мешок на 244-274 см (8-9 футов) от земли или примерно на 122-152 см (4-5 футов) выше, чем расслоение. Прикрепите иглу бабочки к концу солевой линии и смывайте любые пузырьки воздуха из линии IV.

2. Изоляция сонных артерий после жертвоприношения

1. Приносите в жертву мышей путем вдыхания_CO2 в соответствии с институциональным протоколом IACUC.
2. Распылите 70% этанола на кожу мыши и поместите его в лежачее положение на рассечении, содержащем адсорбирующие бумажные полотенца. Прикрепите лапы мыши к адсорбирующим полотенцам на рассеченной доске с помощью клейкой ленты или иглы 21 g.
3. Используя пару стерильных ножниц, удалите кожу мыши, начиная с живота и вплоть до верхней части грудной клетки.
4. Используйте ножницы, чтобы открыть брюшную стенку ниже грудной клетки тупым рассечением.
5. Используя ножницы, осторожно сделайте разрез по длине диафрагмы и продолжайте через ребра с обеих сторон грудной клетки до тех пор, пока грудина не будет поднята. Осторожно отнимите грудину парой щипцов; после этого снимите грудную клетку, чтобы обнажить сердце.
6. Осторожно удалите тимус и любую соединительную ткань над сердцем, чтобы визуализировать основные сосуды.
7. Разрежьте полую вену ножницами, чтобы кровь вышла из замкнутого кровообращения.
8. Вставьте иглу бабочки весом 21 г, соединенную с линией IV через верхушку сердца, в левый желудочек и допустите ретроградную перфузию в течение 2-3 мин с нормальным физиологическим раствором при комнатной температуре. Убедитесь, что постоянный расход нормального физиологического раствора поддерживается, сохраняя солевой мешок на высоте 8-9 футов от земли.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Легкие и печень становятся бледными, что указывает на оптимальную перфузию. Приблизительно 20 мл перфузионного буфера используется для каждой мыши.
9. Удалите кожу из области шеи и удалите весь жир, мышцы и соединительные ткани, чтобы обнажить сонные артерии (рисунок 1A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Остальная часть процедуры проводится под рассекающим микроскопом.
10. Настройте поле зрения, чтобы найти места перевязки. Используя 10-миллиметровые ножницы для микродиссекции, сделайте небольшой разрез ниже места перевязки в LCA, чтобы обеспечить перфузию.
11. Снова перфьюируйте в течение дополнительного 1 мина через левый желудочек и убедитесь, что LCA хорошо перфузирован и свободен от каких-либо видимых следов крови.
12. Используйте тонкие щипцы и небольшие пружинные ножницы, чтобы аккуратно удалить периадвенциальные ткани, окружающие сонные артерии, в то время как сонная артерия прикреплена к телу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте предельно осторожны, чтобы не сжимать и не растягивать сонные артерии во время этого этапа очистки, так как это может увеличить количество нежизнеспособных клеток. При правильном выполнении жизнеспособность клеток в конечной клеточной суспензии обычно составляет >93%.

3. Обогащенная эндотелиальными клетками одноклеточная изоляция из каротид мышей

ПРИМЕЧАНИЕ: Реагенты, описанные ниже, могут быть приготовлены заранее и храниться при 4°C до использования: 1x и 0,1x одноядерные лизисные буферы с реагентами, перечисленными в таблице 1; одноядерный промывочный буфер с реагентами, перечисленными в таблице 1; рецепт одноядерного буфера ядер с реагентами, перечисленными в таблице 1. Рабочие запасы этих буферов должны быть подготовлены в соответствии с протоколом завода-изготовителя. Буферный состав для пищеварения: коллагеназа типа II 600 Ед/мл и ДНКаза I 60 Ед/мл в 0,5% фетальной бычьей сыворотке (FBS), содержащей фосфат-буферный физиологический раствор (PBS).

1. В то время как сонные артерии все еще прикреплены, промывайте внешнюю часть сонных артерий нормальным физиологическим раствором, чтобы смыть любые следы крови.
2. Используя инсулиновый шприц, оснащенный иглой 29 г, введите ~ 50 мкл буфера пищеварения в просвет дистального конца левой сонной артерии. Когда буфер пищеварения начнет заполнять сонную артерию, зажмите проксимальный конец сонной артерии микрозажимом (рисунок 1B). Введите дополнительные 15-20 мкл буфера пищеварения в просвет и обрежьте дистальный конец, чтобы избежать высвобождения буфера пищеварения.
3. Осторожно эксплантируют сонные артерии у мыши (рисунок 1B,C) и помещают их в 35-миллиметровые чашки, содержащие теплый (при 37 °C) буферизованный солевым раствором.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что оба зажима надежно размещены. Если зажим становится рыхлым, раствор для пищеварения может вытекать из просвета и влиять на полученное количество клеток. Если это произойдет, добавьте дополнительный ферментативный раствор с помощью инсулинового шприца, снабженного иглой 29 Г от открытого конца сонной артерии, и снова закрепите зажим (рисунок 1D). Если ферментный буферный раствор снова протекает, вполне вероятно, что каротид разрывается во время процесса эксплантации. В этом случае отбросьте сонную артерию и исключите образец из исследования. Повторное грубое обращение с сонной артерией снизит жизнеспособность клеток и качество одноклеточной подготовки. Позаботьтесь о том, чтобы идентифицировать и правильно маркировать левую и правую сонные артерии.
4. Инкубировать эксплантированные сонные артерии в течение 45 мин при 37 °C с прерывистым раскачиванием.

4. Промывка сонных артерий

1. После завершения просветного ферментативного пищеварения удалите сонную артерию вместе с зажимами из 35-миллиметровой чашки. Осторожно снимите каждый зажим, следя за тем, чтобы буфер пищеварения не протекал.
2. Осторожно удерживайте один конец сонной артерии тонкими щипцами поверх трубки микроцентрифуги объемом 1,5 мл. Другой рукой вставьте в просвет иглу весом 29 г, оснащенную инсулиновым шприцем, содержащим 100 мкл теплого буфера пищеварения (37 °C) (рисунок 1D).
3. Быстро смывают просвет сонной артерии в трубку микроцентрифуги. Блокируют ферментативную реакцию, добавляя 0,3 мл FBS в пробирку объемом 1,5 мл. Поместите трубку на лед.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Промывка содержит клетки из просветного ферментативного пищеварения. Добавление FBS и снижение температуры останавливает процесс ферментативного пищеварения. Если количество клеток в препарате велико и содержит мусор или жировую ткань, настоятельно рекомендуется использовать клеточный сетчатый фильтр 50 или 70 мкм для фильтрации нежелательного мусора тканей. Чтобы увеличить количество одноклеточных клеток, рекомендуется промывка нескольких сонных артерий. Здесь, чтобы получить по меньшей мере 5000 клеток, 10-12 сонных артерий были промыты и объединены в один образец.
4. Центрифугирование ячеек при 500 × g в течение 5 мин при 4 °C с помощью центрифуги, оснащенной ротором с фиксированным углом наклона (см. Таблицу материалов).
5. Откажитесь от надосадочного вещества и повторно суспендируйте клеточную гранулу в буфере пищеварения, содержащем клеточный диссоциационный реагент (см. Таблицу материалов) в течение 5 мин при 37 °C для разделения всех клеток на отдельные клетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если количество клеток в препарате низкое, увеличьте скорость центрифуги до 2000-3000 × г для вращения клеток. Кроме того, использование 0,5 мл центрифужных трубок облегчает лучшую визуализацию ячейки гранулы в нижней части трубки.
6. Блокируют ферментативную реакцию, добавляя 0,15 мл FBS в пробирку объемом 0,5 мл.
7. Центрифуга одноэлементной суспензии при 500 × g в течение 5 мин при 4 °C используется центрифуга, оснащенная ротором с фиксированным углом наклона, как на этапе 4.4.
8. Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте клетки в 100 мкл ледяного 1% раствора бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS в микроцентрифужной пробирке объемом 0,2 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование центрифужных трубок объемом 0,2 мл улучшает визуализацию одноэлементной гранулы в нижней части трубки.

5. Одноклеточный и одноядерный анализы

1. Повторно суспендировать и представить одноклеточный препарат для scRNAseq.
   1. Повторно суспендировать одноэлементную гранулу со 100 мкл ледяного 1% BSA в PBS в пробирке объемом 0,2 мл.
   2. После повторного использования клеток для одноклеточной инкапсуляции немедленно приступайте к одноклеточной инкапсуляции и штрих-кодированию с использованием одноклеточной системы секционирования и штрихкодирования на основе микрофлюидики (см. Таблицу материалов).
   3. Перед отправкой образцов в Genomics Core подсчитайте и осмотрите одноклеточные препараты; обеспечить отсутствие клеточных агрегатов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Агрегация отдельных ячеек может быть дополнительно сведена к минимуму путем увеличения количества BSA до 2%.
2. Повторно суспендировать и представить одноклеточный препарат для scATACseq.
   1. Повторно суспендируют ячейку гранулы в 100 мкл 0,04% BSA в ледяном 1x PBS и центрифугируют одноэлементную суспензию при 500 × г при 4 °C.
   2. Слизируйте одноклеточную суспензию с ледяным 0,1-кратным лизизным буфером (табл. 1) и инкубируйте в течение 5 мин на льду.
   3. Смешайте лизат 10 раз с пипеткой P-20 и инкубируйте в течение дополнительных 10 минут.
   4. Добавьте 500 мкл охлажденного промывочного буфера (таблица 1) к лизированным ячейкам и перемешайте 5 раз с помощью пипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте клеточный сетчатый фильтр 70 мкм для фильтрации любого мусора из клеточной суспензии и переноса их в трубку объемом 2 мл.
   5. Центрифугируют лизат при 500 × г в течение 5 мин при 4 °C. Откажитесь от супернатанта и повторно суспендируйте ядра-гранулы в разбавленном буфере ядер (150 мкл) (см. Таблицу материалов и Таблицу 1). Подсчитайте и осмотрите одноядерные препараты с помощью гемоцитометра¹¹.
   6. Отправьте образец одноядерного ядра в Genomics Core для транспозиции одноядер, секционирования ядер, подготовки библиотеки и секвенирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если начальное число клеток низкое, обычно наблюдаются обломки вдоль ядер. Поэтому рекомендуется начинать с высокого номера ячейки.

Результаты

Операции частичной перевязки сонной артерии были выполнены на 44 мышах, и начало d-потока в LCA было подтверждено путем выполнения ультрасонографии через один день после операции частичной перевязки. Успешная операция частичной перевязки вызывает снижение скорости кровотока и обра...

Обсуждение

В этой статье представлен подробный протокол выделения одноклеточных препаратов из сонных артерий мыши. Влияние d-потока на эндотелиальные клетки может быть точно изучено, если операция PCL выполнена правильно. Крайне важно правильно идентифицировать ветви общей сонной артерии, т?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
1x PBS (Cell Culture Grade)	Corning	21040CMX12
1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes	Eppendorf	022-43-108-1
15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile	Fablab	FL4022
50 mL SuperClear Centrifuge Tubes	Labcon	3191-335-028
6-0 Silk Suture Sterile	Covidien	s-1172 c2
70 µm Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged	Thermo Fisher Scientic	08-771-2
Accutase solution,sterile-filtered	Sigma-Aldrich	A6964-100ML	or equivalent
ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix)	10x Genomics	2000122
ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix)	10x Genomics	2000123/ 2000138
Bovine Serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906-500G
Buprenorphine	Med-Vet International	RXBUPRENOR5-V
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit	10X Genomics	1000204
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1	10X Genomics	1000121
Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1	10X Genomics	1000175
Collagenase II	MP Biomedicals	2100502.5
Digitonin	Sigma-Aldrich	D141-100MG
Dissecting Forceps	Roboz Surgical Instruments Co	RS-5005
Dnase1	New England Biolabs Inc	M0303S
Centrifuge (Benchtop-Model # 5425)	Eppendorf	22620444230VR
Fetal Bovine Serum - Premium Select	R&D systems	S11550
Fixed Angle Rotor	Eppendorf	FA-45-24-11-Kit Rotor
HEPES buffered saline	Millipore Sigma	51558
Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe)	BD	305932
Isoflurane	Patterson vet	789 313 89
MACs Smart Strainers (30 µm)	Miltenyi Biotec	130-098-458
MACS SmartStrainers (100 µm)	Miltenyi Biotec	130-098-463
Normal Saline (0.9% sodium chloride)	Baxter International Inc	2B1323
Nuclei Buffer (20x)	10x Genomics	PN 2000153/2000207
PBS (10x), pH 7.4	Thermo Fisher Scientic	70011-044
Small scissors	Roboz Surgical Instruments Co	RS-5675
Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5480	or similar
Tissue Mend II	Webster Veteinanry	07-856-7946
Type II Collagenase	MP biomedicals	2100502.1
Deposited Data
scATACseq FastQ files	NCBI	www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233
scRNAseq FastQ files	NCBI	www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233
Software and Algorithms
Cell Ranger 3.1.0	10X Genomics	https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp
Cicero	Pliner et al., 2018	https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/
Ggplot2 v3.2.1	Hadley Wickham	https://cran.r-project.org
Harmony	Korsunsky et al., 2019	https://github.com/immunogenomics/harmony
ImageJ	Schneider et al., 2012	https://imagej.nih.gov
Monocle 2.8.0	Qiu et al., 2017	https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release
R version 3.6.2	R Foundation	https://www.r-project.org
Seurat 3.1.3	Stuart et al., 2019	https://github.com/satijalab/seurat
Signac 0.2.5	Stuart et al., 2019	https://github.com/timoast/signac