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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir stellen eine Methode zur Isolierung von Endothelzellen und -kernen aus dem Lumen von Maus-Halsschlagadern vor, die stabilen oder gestörten Strömungsbedingungen ausgesetzt sind, um Einzelzell-Omics-Experimente durchzuführen.

Zusammenfassung

Atherosklerose ist eine entzündliche Erkrankung der arteriellen Regionen, die einem gestörten Blutfluss (D-Flow) ausgesetzt sind. D-flow reguliert die Expression von Genen im Endothel auf transkriptomischer und epigenomischer Ebene, was zu proatherogenen Reaktionen führt. Vor kurzem wurden Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNAseq) und Einzelzell-Assay für Transposase Accessible Chromatin Sequencing (scATACseq) Studien durchgeführt, um die transkriptomischen und chromatin-Zugänglichkeitsänderungen bei einer Einzelzellauflösung unter Verwendung des Maus-PCL-Modells (Partial Carotisligation) zu bestimmen. Da Endothelzellen (ECs) nur einen geringen Teil der gesamten Zellpopulationen in der Arterienwand ausmachen, wurde eine luminale Verdauungsmethode verwendet, um EC-angereicherte Einzelzellpräparate zu erhalten. Für diese Studie wurden Mäuse einer PCL-Operation unterzogen, um einen d-Fluss in der linken Halsschlagader (LCA) zu induzieren, während die rechte Halsschlagader (RCA) als Kontrolle verwendet wurde. Die Halsschlagadern wurden zwei Tage oder zwei Wochen nach der PCL-Operation seziert. Das Lumen jeder Halsschlagader wurde einer Kollagenase-Verdauung unterzogen, und endothelial angereicherte Einzelzellen oder einzelne Kerne wurden erhalten. Diese Einzelzell- und Einzelkernpräparate wurden anschließend mit einem 10-fachen mikrofluidischen Aufbau von Genomics mit einem Barcode versehen. Die mit Barcodes versehenen Einzelzellen und Einzelkerne wurden dann für die RNA-Vorbereitung, Bibliotheksgenerierung und Sequenzierung auf einem Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierer verwendet. Nach der bioinformatischen Verarbeitung identifizierten die Datensätze scRNAseq und scATACseq verschiedene Zelltypen aus dem luminalen Aufschluss, die hauptsächlich aus ECs bestanden. Glatte Muskelzellen, Fibroblasten und Immunzellen waren ebenfalls vorhanden. Diese EC-Anreicherungsmethode half dabei, die Wirkung des Blutflusses auf das Endothel zu verstehen, was mit der Methode der Gesamtarterienverdauung schwierig gewesen sein könnte. Die EC-angereicherte Einzelzellpräparationsmethode kann verwendet werden, um Einzelzell-Omics-Studien an EC-Knockouts und transgenen Mäusen durchzuführen, bei denen die Wirkung des Blutflusses auf diese Gene nicht untersucht wurde. Wichtig ist, dass diese Technik angepasst werden kann, um EC-angereicherte Einzelzellen aus menschlichen Arterienexplantaten zu isolieren, um ähnliche mechanistische Studien durchzuführen.

Einleitung

Dieses Labor zeigte zuvor, dass die Induktion von d-flow zu einer schnellen und robusten Atheroskleroseentwicklung bei hyperlipidämischen Mäusen führt 1,2. Das neuartige Mausmodell der d-Flow-induzierten Atherosklerose wurde mittels partieller Carotisligatur (PCL) möglich 3. Die PCL-Chirurgie induziert einen niedrigen und oszillatorischen Blutfluss oder D-Fluss in der ligierten linken Halsschlagader (LCA). Im Gegensatz dazu ist die kontralaterale rechte Halsschlagader (RCA) weiterhin einer stabilen laminaren Strömung (s-flow) ausgesetzt. Um die Wirkung des d-Flusses auf Endothelzellen zu verstehen, wurden die Halsschlagadern nach einer partiellen Ligaturoperation seziert und mit einem auf Phenol- und Guanidinisothiocyanat basierenden Lysemittel (luminale RNA/DNA-Spülmethode)2,4 gespült, das endothelial angereicherte "gepoolte Bulk"-RNAs oder DNAs lieferte. Diese gepoolten Bulk-RNAs oder DNAs wurden dann für transkriptomische Studien oder epigenomische DNA-Methylom-Studien bzw. 4,5,6 verarbeitet. Diese Studien halfen, mehrere flussempfindliche Gene und microRNAs zu entdecken, deren Rolle in der Endothelbiologie und Atherosklerose umfassend untersucht wurde 4,6,7.

Trotz der endothelialen Anreicherung konnten diese RNA/DNA-Massenstudien jedoch nicht die spezifische Rolle jedes Zelltyps in der Arterienwand bei d-flow-induzierter Atherosklerose unterscheiden. Umdiese Einschränkung zu überwinden, wurden endothelial angereicherte Einzelzellisolierungen (sc) sowie scRNA- und scATAC-Sequenzierungsstudien durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden C57Bl6-Mäuse der PCL-Operation unterzogen, um einen d-Flow in der LCA zu induzieren, während die s-flow-exponierte RCA als Kontrolle verwendet wurde. Zwei Tage oder zwei Wochen nach der PCL-Operation wurden die Mäuse geopfert und die Halsschlagader seziert und gereinigt. Das Lumen sowohl von LCAs als auch von RCAs wurde mit Kollagenase infundiert, und die luminalen Kollagenase-Verdauungen, die ECs als signifikante Fraktion enthielten, und andere arterielle Zellen wurden gesammelt. Die Einzelzellsuspension (scRNAseq) oder Einzelkernsuspension (scATACseq) wurde hergestellt und mit eindeutigen Identifikatoren für jede Zelle oder jeden Kern unter Verwendung eines 10-fachen Genomics-Setups versehen. Die RNAs wurden einer cDNA-Bibliotheksvorbereitung unterzogen und sequenziert.

Die Datensätze scRNAseq und scATACseq wurden mit der Cell Ranger Single-Cell Software verarbeitet und von den Seurat und Signac R Paketen 9,10 weiter analysiert. Jeder Zelle und jedem Zellkern wurde aus diesen Analysen ein Zelltyp zugeordnet und basierend auf den Markergenen und einzigartigen Genexpressionsmustern in den Zelltyp gruppiert. Die Ergebnisse der scRNAseq und scATACseq zeigten, dass diese Einzelzellpräparate mit ECs angereichert sind und auch glatte Muskelzellen (SMCs), Fibroblasten und Immunzellen enthalten.

Weitere Analysen ergaben, dass die EC-Population in der luminalen Verdauung sehr divergent und plastisch (8 verschiedene EC-Cluster) ist und auf den Blutfluss reagiert. Am wichtigsten ist, dass diese Ergebnisse zeigten, dass d-flow ECs von einem athero-geschützten entzündungshemmenden Phänotyp zu pro-atherogenen Phänotypen umprogrammiert, einschließlich entzündungsförderndem, endothelialem zu mesenchymalem Übergang, endothelialem Stamm / Vorläuferzellübergang und überraschenderweise endothelial-zu-immunzellähnlichem Übergang. Darüber hinaus zeigen scATACseq-Daten genomweit neuartige flussabhängige Chromatin-Zugänglichkeitsänderungen und Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen, die die Grundlage für mehrere neue Hypothesen bilden. Die Methodik und das Protokoll zur Vorbereitung einzelner Endothelzellen für Einzelzell-Multi-Omics-Studien aus den Halsschlagadern der Maus sind unten aufgeführt.

Protokoll

Alle unten beschriebenen Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Emory University genehmigt. Nicht-hypercholesterinämische, alters- und geschlechtsangepasste C57BL/6-Mäuse wurden verwendet, um geschlechtsabhängige Variationen zu mildern und Komplikationen hypercholesterinämischer Zustände auszugleichen.

1. Partielle Karotisligatur (PCL)

HINWEIS: Die partielle Karotis-Ligatur der LCA wurde wie zuvor beschrieben und demonstriertdurchgeführt 3.

  1. Betäuben Sie die Maus durch Isofluran-Inhalation (5% Isofluoran in Sauerstoff für die Induktion und 1,5% danach für die Erhaltung) während des gesamten Verfahrens mit einem Anästhesie-Vaporizer. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf ein isothermes Deltaphase-Pad, um den Verlust von Körperwärme während der Operation zu verhindern.
  2. Tragen Sie eine Augensalbe auf, um eine Keratitis zu verhindern, und bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie durch das Fehlen einer Zehenklemmreaktion.
  3. Injizieren Sie Buprenorphin 0,05 mg/kg subkutan, um Schmerzen präventiv zu behandeln. Desinfizieren Sie den epilierten Bereich durch dreimaliges Auftragen und Reinigen mit Betadin und Isopropanollösung. Stellen Sie sicher, dass Betadin der letzte Schritt zur Sterilisation des Operationsbereichs ist, beginnend in der Mitte und endend an den Seiten.
  4. Machen Sie mit aseptischen Techniken einen ventralen Mittellinienschnitt (~ 1 cm) im Halsbereich und legen Sie den LCA-Zweigpunkt durch stumpfe Dissektion frei.
  5. Ligiert die linke innere Halsschlagader, die äußere Halsschlagader und die Hinterhauptsarterien mit 6-0 Seidennaht; Lassen Sie die Arteria schilddrüse superior unberührt.
  6. Nähern Sie sich der Haut an und schließen Sie den Schnitt mit Gewebekleber und / oder Nähten.
  7. Bringen Sie die Maus in einen vorgewärmten Erholungskäfig (bei 37 °C) und legen Sie sie bis zu 1 Stunde auf ein sauberes Handtuch, um eine postoperative Unterkühlung zu vermeiden.
    HINWEIS: Nach unserer Erfahrung ist eine präventive Einzeldosis von Buprenorphin (0,05 mg / kg) in der Regel ausreichend für die postoperative Schmerzbehandlung. Eine wiederholte Dosis von Buprenorphin kann verabreicht werden, wenn das Tier nach den ersten 24 Stunden in Not ist. Bei korrekter Durchführung ist mit diesem Verfahren keine Mortalität verbunden, und der postoperative Stress für die Maus ist minimal. Die Mäuse werden in ihre jeweiligen Käfige zurückgebracht und nach der Operation täglich überwacht.
  8. Bereiten Sie das Perfusions-Setup vor.
    1. Verwenden Sie 0,9% NaCl (normale Kochsalzlösung) mit 10 U / ml Heparin in einem IV-Beutel. Haken Sie den Infusionsbeutel 244-274 cm (8-9 Fuß) vom Boden oder etwa 122-152 cm (4-5 Fuß) höher als das Präparierbrett. Befestigen Sie die Schmetterlingsnadel am Ende der Kochsalzlösung und spülen Sie alle Luftblasen aus der IV-Leitung.

2. Isolierung der Halsschlagadern nach dem Opfer

  1. Opfern Sie die Mäuse durch CO2 -Inhalation gemäß dem institutionellen IACUC-Protokoll.
  2. Sprühen Sie 70% Ethanol auf die Haut der Maus und legen Sie es in Rückenlage auf die Sezierplatte, die Adsorptionspapiertücher enthält. Befestigen Sie die Pfoten der Maus mit Klebeband oder einer 21 G Nadel an den Adsorptionstüchern auf der Präparierplatte.
  3. Entfernen Sie mit einer sterilen Schere die Haut der Maus vom Bauch bis zur Spitze des Thorax.
  4. Verwenden Sie eine Schere, um die Bauchdecke unterhalb des Brustkorbs durch stumpfe Dissektion zu öffnen.
  5. Machen Sie mit der Schere vorsichtig einen Einschnitt entlang der Länge des Zwerchfells und fahren Sie durch die Rippen auf beiden Seiten des Thorax, bis das Brustbein abgehoben werden kann. Heben Sie das Brustbein vorsichtig mit einer Pinzette ab; Danach entfernen Sie den Brustkorb, um das Herz freizulegen.
  6. Entfernen Sie vorsichtig den Thymus und das Bindegewebe über dem Herzen, um die Hauptgefäße sichtbar zu machen.
  7. Durchtrennen Sie die Hohlvene mit einer Schere, damit Blut aus dem geschlossenen Kreislauf austreten kann.
  8. Führen Sie eine 21 G Schmetterlingsnadel, die mit der IV-Leitung verbunden ist, durch die Spitze des Herzens in den linken Ventrikel ein und lassen Sie eine retrograde Perfusion für 2-3 min mit normaler Kochsalzlösung bei Raumtemperatur zu. Stellen Sie sicher, dass eine konstante Durchflussrate der normalen Kochsalzlösung aufrechterhalten wird, indem Sie den Kochsalzbeutel in der Höhe von 8-9 Fuß über dem Boden halten.
    HINWEIS: Die Lunge und die Leber werden blass, was auf eine optimale Durchblutung hinweist. Für jede Maus werden ca. 20 ml Perfusionspuffer verwendet.
  9. Entfernen Sie die Haut aus der Halsregion und entfernen Sie das gesamte Fett, die Muskeln und das Bindegewebe, um die Halsschlagadern freizulegen (Abbildung 1A).
    HINWEIS: Der Rest des Verfahrens wird unter dem Seziermikroskop durchgeführt.
  10. Passen Sie das Sichtfeld an, um die Ligationsstellen zu lokalisieren. Machen Sie mit der 10-mm-Mikrodissektionsschere einen kleinen Schnitt unterhalb der Ligaturstelle in der LCA, um die Durchblutung zu ermöglichen.
  11. Durchbluten Sie erneut für weitere 1 min über den linken Ventrikel und stellen Sie sicher, dass die LCA gut durchblutet und frei von sichtbaren Blutspuren ist.
  12. Verwenden Sie eine feine Pinzette und eine kleine Federschere, um das periadventitiale Gewebe, das die Halsschlagader umgibt, vorsichtig zu entfernen, während die Halsschlagader am Körper befestigt ist.
    HINWEIS: Achten Sie sehr darauf, die Halsschlagadern während dieses Reinigungsschritts nicht zu quetschen oder zu dehnen, da dies die Anzahl der nicht lebensfähigen Zellen erhöhen kann. Bei korrekter Durchführung beträgt die Zelllebensfähigkeit in der endgültigen Zellsuspension in der Regel >93%.

3. Endothelzell-angereicherte Einzelzellisolierung aus der Carotis-Schicht von Mäusen

ANMERKUNG: Die nachstehend beschriebenen Reagenzien können im Voraus hergestellt und bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert werden: 1x und 0,1x Einzelkernlysepuffer mit den in Tabelle 1 aufgeführten Reagenzien; Einkern-Waschpuffer mit den in Tabelle 1 aufgeführten Reagenzien; Einzelkern Nuclei Buffer Rezeptur mit den in Tabelle 1 aufgeführten Reagenzien. Die Arbeitsbestände dieser Puffer sind nach dem Protokoll des Herstellers vorzubereiten. Zusammensetzung des Verdauungspuffers: Kollagenase Typ II 600 U/ml und DNase I 60 U/ml in 0,5% fetalem Rinderserum (FBS)-haltiger phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).

  1. Während die Halsschlagader noch befestigt sind, waschen Sie die Außenseite der Halsschlagadern mit normaler Kochsalzlösung, um Blutspuren wegzuspülen.
  2. Mit einer Insulinspritze, die mit einer 29-G-Nadel ausgestattet ist, injizieren Sie ~ 50 μL des Verdauungspuffers in das Lumen des distalen Endes der linken Halsschlagader. Wenn der Verdauungspuffer beginnt, die Halsschlagader zu füllen, klemmen Sie das proximale Ende der Halsschlagader mit einem Mikroclip fest (Abbildung 1B). Führen Sie zusätzliche 15-20 μL Verdauungspuffer in das Lumen ein und schneiden Sie das distale Ende ab, um die Freisetzung des Verdauungspuffers zu vermeiden.
  3. Die Halsschlagadern der Maus vorsichtig explantationieren (Abbildung 1B,C) und in 35-mm-Schalen geben, die warme (bei 37 °C) Hepes-gepufferte Kochsalzlösung enthalten.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass beide Klemmen sicher platziert sind. Wenn sich die Klemme löst, kann die Verdauungslösung aus dem Lumen austreten und die erhaltene Zellzahl beeinflussen. In diesem Fall fügen Sie zusätzliche enzymatische Lösung mit einer Insulinspritze mit einer 29-G-Nadel vom offenen Ende der Halsschlagader hinzu und sichern Sie die Klemme erneut (Abbildung 1D). Wenn die Enzympufferlösung erneut ausläuft, ist es wahrscheinlich, dass die Halsschlagader während des Explantationsprozesses durchtrennt wird. Verwerfen Sie in diesem Fall die Halsschlagader und schließen Sie die Probe von der Studie aus. Eine wiederholte grobe Handhabung der Halsschlagader verringert die Zelllebensfähigkeit und die Qualität der Einzelzellpräparation. Achten Sie darauf, die linke und rechte Halsschlagadern zu identifizieren und korrekt zu kennzeichnen.
  4. Inkubieren Sie die explantierten Carotiden für 45 min bei 37 °C mit intermittierendem Schaukeln.

4. Spülung der Halsschlagadern

  1. Nach Abschluss der luminalen enzymatischen Verdauung entfernen Sie die Halsschlagader zusammen mit den Klemmen aus der 35 mm Schüssel. Entfernen Sie vorsichtig jede Klemme und achten Sie darauf, dass der Verdauungspuffer nicht ausläuft.
  2. Halten Sie vorsichtig ein Ende der Halsschlagader mit einer feinen Pinzette auf einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Führen Sie mit der anderen Hand eine 29-G-Nadel mit einer Insulinspritze mit 100 μl warmem Verdauungspuffer (37 °C) in das Lumen ein (Abbildung 1D).
  3. Spülen Sie das Lumen der Halsschlagader schnell in das Mikrozentrifugenröhrchen. Blockieren Sie die enzymatische Reaktion, indem Sie 0,3 ml FBS in das 1,5-ml-Röhrchen geben. Legen Sie die Röhre auf Eis.
    HINWEIS: Die Spülung enthält die Zellen aus der luminalen enzymatischen Verdauung. Die Zugabe von FBS und die Senkung der Temperatur stoppt den enzymatischen Verdauungsprozess. Wenn die Anzahl der Zellen in der Zubereitung hoch ist und Ablagerungen oder Fettgewebe enthält, wird die Verwendung eines 50 oder 70 μm großen Zellsiebs dringend empfohlen, um unerwünschte Gewebeablagerungen herauszufiltern. Um die Einzelzellzahl zu erhöhen, wird empfohlen, mehrere Halsschlagader zu spülen. Um hier mindestens 5.000 Zellen zu erhalten, wurden 10-12 Carotiden gespült und als eine Probe gepoolt.
  4. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 × g für 5 min bei 4 °C mit einer Zentrifuge mit einem Festwinkelrotor (siehe Materialtabelle).
  5. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Verdauungspuffer, der das Zelldissoziationsreagenz enthält (siehe Materialtabelle), für 5 min bei 37 °C, um alle Zellen in einzelne Zellen zu trennen.
    HINWEIS: Wenn die Anzahl der Zellen in der Zubereitung gering ist, erhöhen Sie die Zentrifugengeschwindigkeit auf 2.000-3.000 × g , um die Zellen herunterzudrehen. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von 0,5-ml-Zentrifugenröhrchen eine bessere Visualisierung des Zellpellets am Boden des Röhrchens.
  6. Blockieren Sie die enzymatische Reaktion, indem Sie 0,15 ml FBS in das 0,5-ml-Röhrchen geben.
  7. Zentrifugieren Sie die einzellige Suspension bei 500 × g für 5 min bei 4 °C mit einer Zentrifuge mit einem Festwinkelrotor, wie in Schritt 4.4.
  8. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 100 μL eiskalter 1% Rinderserumalbumin (BSA)-Lösung in PBS in einem 0,2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
    HINWEIS: Die Verwendung von 0,2 ml Zentrifugenröhrchen verbessert die Visualisierung des einzelligen Pellets am Boden des Röhrchens.

5. Einzelzell- und Einzelkernanalysen

  1. Resuspendieren und reichen Sie das Einzelzellpräparat für scRNAseq ein.
    1. Resuspendieren Sie das einzellige Pellet mit 100 μL eiskaltem 1% BSA in PBS in einem 0,2 ml Röhrchen.
    2. Nach der Resuspendierung der Zellen für die Einzelzellverkapselung fahren Sie sofort mit der Einzelzellverkapselung und Barcodierung unter Verwendung eines mikrofluidikbasierten Einzelzellpartitionierungs- und Barcodesystems fort (siehe Materialtabelle).
    3. Bevor Sie die Proben an den Genomics Core senden, zählen und inspizieren Sie die Einzelzellpräparate. Stellen Sie sicher, dass keine Zellaggregate vorhanden sind.
      HINWEIS: Die Aggregation einzelner Zellen kann weiter minimiert werden, indem die BSA-Menge auf bis zu 2% erhöht wird.
  2. Resuspendieren und reichen Sie das Einzelzellpräparat für scATACseq ein.
    1. Das Zellpellet wird in 100 μL 0,04% BSA in eiskaltem 1x PBS resuspendiert und die Einzelzellsuspension bei 500 × g bei 4 °C zentrifugiert.
    2. Die Einzelzellsuspension mit eiskaltem 0,1-fach-Lysepuffer lysieren (Tabelle 1) und 5 min auf Eis inkubieren.
    3. Mischen Sie das Lysat 10 mal mit einer P-20 Pipette und inkubieren Sie für weitere 10 min.
    4. 500 μL gekühlten Waschpuffer (Tabelle 1) zu den lysierten Zellen geben und 5-mal mit einer Pipette mischen.
      HINWEIS: Verwenden Sie ein 70-μm-Zellsieb, um Ablagerungen aus der Zellsuspension zu filtern und in ein 2-ml-Röhrchen zu überführen.
    5. Das Lysat wird bei 500 × g 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Kernpellet im verdünnten Kernpuffer (150 μL) resuspendiert (siehe Materialtabelle und Tabelle 1). Zählen und untersuchen Sie die Einzelkernpräparate mit einem Hämozytometer11.
    6. Senden Sie die Einzelkernprobe an den Genomics-Kern zur Transposition, Kernpartitionierung, Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung.
      HINWEIS: Wenn die anfängliche Zellzahl niedrig ist, ist es üblich, Trümmer entlang der Kerne zu beobachten. Daher wird empfohlen, mit einer hohen Zellzahl zu beginnen.

Ergebnisse

Partielle Carotis-Ligaturoperationen wurden an 44 Mäusen durchgeführt, und der Beginn des d-Flows in der LCA wurde durch Ultraschall einen Tag nach der partiellen Ligatur validiert. Eine erfolgreiche partielle Ligatur bewirkt eine verminderte Durchblutungsgeschwindigkeit und kehrt den Blutfluss (gestörter Fluss) in der LCA3 um. Die Halsschlagadern wurden entweder zwei Tage oder zwei Wochen nach der Ligatur präpariert. Das Lumen jeder Halsschlagader wurde einer Kollagenase-Verdauung un...

Diskussion

Dieses Papier enthält ein detailliertes Protokoll zur Isolierung von Einzelzellpräparaten aus den Halsschlagadern der Maus. Der Einfluss von d-flow auf die Endothelzellen kann genau untersucht werden, wenn die PCL-Operation korrekt durchgeführt wird. Es ist wichtig, die Äste der gewöhnlichen Halsschlagader, wie die äußere Halsschlagader, die innere Halsschlagader, die Okzipitalarterie und die Arteria thyroidea superior, korrekt zu identifizieren. Die Validierung von Strömungsmustern durch Ultraschall val...

Offenlegungen

HJ ist der Gründer von FloKines Pharma. Andere Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Mittel der National Institutes of Health-Zuschüsse HL119798, HL095070 und HL139757 an HJ unterstützt. HJ wird auch von der Wallace H. Coulter Distinguished Faculty Chair Professorship unterstützt. Die Dienstleistungen des Emory Integrated Genomics Core (EIGC) wurden von der Emory University School of Medicine subventioniert und teilweise auch von der Georgia Clinical and Translational Science Alliance der National Institutes of Health unter der Award-Nr. UL1TR002378. Der oben bereitgestellte Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und spiegelt nicht die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health wider.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
1x PBS (Cell Culture Grade)Corning21040CMX12
1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge TubesEppendorf022-43-108-1
15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, SterileFablabFL4022
50 mL SuperClear Centrifuge TubesLabcon3191-335-028
6-0 Silk Suture SterileCovidiens-1172 c2
70 µm Cell Strainer, White, Sterile, Individually PackagedThermo Fisher Scientic08-771-2
Accutase solution,sterile-filteredSigma-AldrichA6964-100MLor equivalent
ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix)10x Genomics2000122
ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix)10x Genomics2000123/ 2000138
Bovine Serum albuminSigma-AldrichA7906-500G
BuprenorphineMed-Vet InternationalRXBUPRENOR5-V
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit10X Genomics1000204
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.110X Genomics1000121
Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.110X Genomics1000175
Collagenase IIMP Biomedicals2100502.5
DigitoninSigma-AldrichD141-100MG
Dissecting ForcepsRoboz Surgical Instruments CoRS-5005
Dnase1New England Biolabs IncM0303S
Centrifuge (Benchtop-Model # 5425)Eppendorf22620444230VR
Fetal Bovine Serum - Premium SelectR&D systemsS11550
Fixed Angle RotorEppendorfFA-45-24-11-Kit Rotor
HEPES buffered salineMillipore Sigma51558
Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe)BD305932
IsofluranePatterson vet789 313 89
MACs Smart Strainers (30 µm)Miltenyi Biotec130-098-458
MACS SmartStrainers (100 µm) Miltenyi Biotec130-098-463
Normal Saline (0.9% sodium chloride)Baxter International Inc2B1323
Nuclei Buffer (20x)10x GenomicsPN 2000153/2000207
PBS (10x), pH 7.4Thermo Fisher Scientic70011-044
Small scissorsRoboz Surgical Instruments CoRS-5675
Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With LockRoboz Surgical Instruments Co.RS-5480or similar
Tissue Mend IIWebster Veteinanry07-856-7946
Type II CollagenaseMP biomedicals2100502.1
Deposited Data
scATACseq FastQ filesNCBIwww.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233
scRNAseq FastQ filesNCBIwww.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233
Software and Algorithms
Cell Ranger 3.1.010X Genomicshttps://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp
CiceroPliner et al., 2018https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/
Ggplot2 v3.2.1Hadley Wickhamhttps://cran.r-project.org
HarmonyKorsunsky et al., 2019https://github.com/immunogenomics/harmony
ImageJSchneider et al., 2012https://imagej.nih.gov
Monocle 2.8.0Qiu et al., 2017https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release
R version 3.6.2R Foundationhttps://www.r-project.org
Seurat 3.1.3Stuart et al., 2019https://github.com/satijalab/seurat
Signac 0.2.5Stuart et al., 2019https://github.com/timoast/signac

Referenzen

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