Isolamento de células endoteliais do lúmen de artérias carótidas de camundongos para experimentos multi-ômicos unicelulares

Resumo

Apresentamos um método para isolar células e núcleos endoteliais do lúmen de artérias carótidas de camundongos expostas a condições de fluxo estáveis ou perturbadas para a realização de experimentos ômicos unicelulares.

Resumo

A aterosclerose é uma doença inflamatória das regiões arteriais expostas ao fluxo sanguíneo perturbado (fluxo d). O fluxo D regula a expressão de genes no endotélio nos níveis transcriptômico e epigenômico, resultando em respostas proaterogênicas. Recentemente, estudos de sequenciamento de RNA de célula única (scRNAseq) e ensaio de célula única para sequenciamento de cromatina acessível à transposase (scATACseq) foram realizados para determinar as alterações de acessibilidade transcriptômica e cromatina em uma resolução de célula única usando o modelo de ligadura parcial de carótida (PCL) de camundongo. Como as células endoteliais (CE) representam uma fração menor das populações celulares totais na parede da artéria, um método de digestão luminal foi usado para obter preparações unicelulares enriquecidas com CE. Para este estudo, camundongos foram submetidos à cirurgia de LCP para induzir o fluxo d na artéria carótida esquerda (ACV) enquanto usavam a artéria carótida direita (ACR) como controle. As artérias carótidas foram dissecadas dois dias ou duas semanas após a cirurgia de LCP. O lúmen de cada carótida foi submetido à digestão da colagenase, e células únicas enriquecidas com endotelial ou núcleos únicos foram obtidos. Essas preparações de célula única e núcleos únicos foram subsequentemente codificadas usando uma configuração microfluídica de 10x Genomics. As células únicas e os núcleos únicos com código de barras foram então utilizados para preparação de RNA, geração de biblioteca e sequenciamento em um sequenciador de DNA de alto rendimento. Após o processamento bioinformático, os conjuntos de dados scRNAseq e scATACseq identificaram vários tipos de células da digestão luminal, consistindo principalmente de CEs. Células musculares lisas, fibroblastos e células imunes também estavam presentes. Este método de enriquecimento CE ajudou a entender o efeito do fluxo sanguíneo no endotélio, o que poderia ter sido difícil com o método de digestão total da artéria. O método de preparação de célula única enriquecido com CE pode ser usado para realizar estudos de ômica de célula única em camundongos knockouts e transgênicos em que o efeito do fluxo sanguíneo sobre esses genes não foi estudado. É importante ressaltar que essa técnica pode ser adaptada para isolar células únicas enriquecidas com CE de explantes de artérias humanas para realizar estudos mecanicistas semelhantes.

Introdução

Este laboratório demonstrou anteriormente que a indução do fluxo d leva ao desenvolvimento rápido e robusto de aterosclerose em camundongos hiperlipidêmicos ^1,2. O novo modelo de aterosclerose induzida por fluxo d em camundongos foi possível usando a cirurgia de ligadura parcial da carótida (LCP) ³. A cirurgia de LCP induz a condição de fluxo sanguíneo baixo e oscilatório ou fluxo d na artéria carótida esquerda ligada (ACV). Em contraste, a artéria carótida direita (ACR) contralateral continua a enfrentar fluxo laminar estável (s-flow). Anteriormente, para entender o efeito do fluxo d nas células endoteliais, as artérias carótidas foram dissecadas após a cirurgia de ligadura parcial e lavadas com um agente lisador à base de isotiocianato de fenol e guanidina (método de liberação de RNA/DNA luminal)^2,4, que forneceu RNAs ou DNAs "a granel agrupados" enriquecidos com endotélio. Esses RNAs ou DNAs agrupados a granel foram então processados para estudos transcriptômicos ou estudos epigenômicos de metiloma de DNA, respectivamente ^4,5,6. Esses estudos ajudaram a descobrir múltiplos genes sensíveis ao fluxo e microRNAs cujos papéis na biologia endotelial e na aterosclerose foram extensivamente investigados ^4,6,7.

No entanto, apesar do enriquecimento endotelial, esses estudos de RNA/DNA em massa não conseguiram distinguir o papel específico de cada tipo de célula na parede da artéria na aterosclerose induzida pelo fluxo d. Isolamento unicelular (sc) enriquecido com endotélio e estudos de sequenciamento de scRNA e scATAC foram realizados para superar essa limitação⁸. Para isso, camundongos C57Bl6 foram submetidos à cirurgia de LCP para induzir o fluxo d na ACV enquanto usavam o RCA exposto ao fluxo s como controle. Dois dias ou duas semanas após a cirurgia de LCP, os ratos foram sacrificados e as carótidas foram dissecadas e limpas. O lúmen de ambos os LCAs e RCAs foi infundido com colagenase, e os digestos de colagenase luminal contendo CEs como fração significativa e outras células arteriais foram coletadas. A suspensão de célula única (scRNAseq) ou a suspensão de núcleos únicos (scATACseq) foram preparadas e codificadas com identificadores únicos para cada célula ou núcleo usando uma configuração de Genômica 10x. Os RNAs foram submetidos à preparação da biblioteca de cDNA e sequenciados.

Os conjuntos de dados scRNAseq e scATACseq foram processados utilizando o Cell Ranger Single-Cell Software e posteriormente analisados pelos pacotes Seurat e Signac R ^9,10. A cada célula e núcleo foi atribuído um tipo de célula a partir dessas análises e agrupados no tipo de célula com base nos genes marcadores e padrões únicos de expressão gênica. Os resultados do scRNAseq e scATACseq demonstraram que essas preparações de célula única são enriquecidas com CEs e também contêm células musculares lisas (SMCs), fibroblastos e células imunes.

Uma análise mais aprofundada revelou que a população CE na digestão luminal é altamente divergente e plástica (8 clusters CE diferentes) e responsiva ao fluxo sanguíneo. Mais importante ainda, esses resultados demonstraram que o fluxo d reprograma as CEs de um fenótipo anti-inflamatório protegido por ateróbio para fenótipos pró-aterogênicos, incluindo transição pró-inflamatória, endotelial para mesenquimal, transição de células-tronco endoteliais / progenitoras e, mais surpreendentemente, transição endotelial para célula imune. Além disso, os dados scATACseq revelam novas alterações de acessibilidade à cromatina dependentes do fluxo e locais de ligação ao fator de transcrição de maneira genômica, que formam a base de várias novas hipóteses. A metodologia e o protocolo para a preparação de células endoteliais únicas para estudos multi-ômicos de célula única das artérias carótidas de camundongos são detalhados abaixo.

Protocolo

Todos os procedimentos animais descritos abaixo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Emory. Camundongos C57BL/6 não hipercolesterolêmicos, pareados por idade e sexo foram usados para mitigar a variação dependente do sexo e compensar qualquer complicação de condições hipercolesterolêmicas.

1. Cirurgia de ligadura parcial da carótida (LCP)

NOTA: A ligadura parcial da artéria carótida da ACL foi realizada conforme descrito e demonstrado anteriormente³.

1. Anestesiar o camundongo por inalação de isoflurano (5% de isofluorano em oxigênio para indução e 1,5% depois para manutenção) durante todo o procedimento utilizando um vaporizador anestésico. Coloque o rato em decúbito dorsal numa almofada isotérmica Deltaphase para evitar a perda de calor corporal durante a cirurgia.
2. Aplique uma pomada ocular para evitar a ceratite de exposição e confirme a profundidade da anestesia pela ausência de resposta de beliscão do dedo do pé.
3. Injete buprenorfina 0,05 mg/kg por via subcutânea para controlar a dor preventivamente. Desinfetar a área depilada aplicando e limpando com betadina e solução de isopropanol três vezes. Certifique-se de que a betadina é o último passo para esterilizar a área da cirurgia, começando pelo centro e terminando nas laterais.
4. Usando técnicas assépticas, faça uma incisão ventral na linha média (~ 1 cm) na região do pescoço e exponha o ponto de ramificação da ACV por dissecção contundente.
5. Lige as artérias carótida interna esquerda, carótida externa e occipital com sutura de seda 6-0; deixar a artéria tireoidiana superior intocada.
6. Aproxime a pele e feche a incisão com cola de tecido e/ou suturas.
7. Transfira o rato para uma gaiola de recuperação pré-aquecida (mantida a 37 °C) e coloque-o numa toalha limpa até 1 h para evitar hipotermia pós-cirúrgica.
   NOTA: Em nossa experiência, uma dose única preventiva de buprenorfina (0,05 mg/kg) geralmente é suficiente para o controle da dor pós-cirúrgica. Uma dose repetida de buprenorfina pode ser administrada se o animal estiver em perigo após as primeiras 24 horas. Se realizado corretamente, não há mortalidade associada a este procedimento, e o estresse pós-operatório para o camundongo é mínimo. Os ratos são devolvidos às suas respectivas gaiolas e monitorados diariamente após a cirurgia.
8. Prepare a configuração de perfusão.
   1. Use NaCl a 0,9% (solução salina normal) contendo 10 U/mL de heparina em um saco intravenoso. Gancho o saco IV 244-274 cm (8-9 pés) do chão ou aproximadamente 122-152 cm (4-5 pés) mais alto do que a placa de dissecção. Anexe a agulha da borboleta ao final da linha salina e libere todas as bolhas de ar para fora da linha IV.

2. Isolamento das artérias carótidas após o sacrifício

1. Sacrificar os camundongos por inalação de CO₂ seguindo o protocolo institucional da IACUC.
2. Pulverize etanol a 70% na pele do rato e coloque-o na posição supina sobre a placa de dissecação contendo toalhas de papel adsorventes. Prenda as patas do rato às toalhas adsorventes na placa de dissecação usando fita adesiva ou uma agulha 21 G.
3. Usando um par de tesouras estéreis, remova a pele do rato a partir do abdômen e até o topo do tórax.
4. Use um par de tesouras para abrir a parede abdominal abaixo da caixa torácica por dissecção contundente.
5. Usando a tesoura, faça cuidadosamente uma incisão ao longo do comprimento do diafragma e continue através das costelas em ambos os lados do tórax até que o esterno possa ser levantado. Levante suavemente o esterno com um par de pinças; depois disso, remova a caixa torácica para expor o coração.
6. Remova cuidadosamente o timo e qualquer tecido conjuntivo sobre o coração para visualizar os principais vasos.
7. Separe a veia cava com uma tesoura para permitir que o sangue saia da circulação fechada.
8. Insira uma agulha de borboleta 21 G conectada à linha IV através do ápice do coração no ventrículo esquerdo e permita a perfusão retrógrada por 2-3 min com solução salina normal à temperatura ambiente. Certifique-se de que uma taxa de fluxo constante de solução salina normal seja mantida, mantendo o saco salino na altura de 8-9 pés do solo.
   NOTA: Os pulmões e o fígado ficam pálidos, indicando perfusão ideal. Aproximadamente 20 mL de tampão de perfusão são usados para cada rato.
9. Remova a pele da região do pescoço e remova toda a gordura, músculos e tecidos conjuntivos para expor as artérias carótidas (Figura 1A).
   NOTA: O resto do procedimento é realizado sob o microscópio de dissecação.
10. Ajuste o campo de visão para localizar os locais de ligadura. Usando a tesoura de microdissecção de 10 mm, faça uma pequena incisão abaixo do local da ligadura na ACV para permitir a perfusão.
11. Perfunda novamente por mais 1 min através do ventrículo esquerdo e certifique-se de que a ACV está bem perfundida e livre de quaisquer vestígios visíveis de sangue.
12. Use pinças de ponta fina e pequenas tesouras de mola para remover cuidadosamente os tecidos peri-adventícios ao redor das carótidas enquanto a carótida está ligada ao corpo.
    NOTA: Tenha muito cuidado para não espremer ou esticar as artérias carótidas durante esta etapa de limpeza, pois isso pode aumentar o número de células inviáveis. Se realizada corretamente, a viabilidade celular na suspensão celular final é geralmente de >93%.

3. Isolamento unicelular enriquecido com células endoteliais de carótidas de camundongos

NOTA: Os reagentes a seguir descritos podem ser preparados com antecedência e armazenados a 4 °C até a utilização: tamponadores de lise de núcleos únicos de 1x e 0,1x com os reagentes listados na Tabela 1; tampão de lavagem de núcleos únicos com os reagentes listados na Tabela 1; receita de tampão de núcleos únicos com os reagentes listados na Tabela 1. As existências de trabalho destes reservatórios devem ser preparadas de acordo com o protocolo do fabricante. Composição do tampão de digestão: Colgenase Tipo II 600 U/mL e DNase I 60 U/mL em soro fetal bovino (FBS) contendo solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 0,5%.

1. Enquanto as carótidas ainda estão ligadas, lave o exterior das artérias carótidas com solução salina normal para eliminar quaisquer vestígios de sangue.
2. Usando uma seringa de insulina equipada com uma agulha de 29 G, injete ~ 50 μL do tampão de digestão no lúmen da extremidade distal da artéria carótida esquerda. À medida que o tampão de digestão começa a preencher a artéria carótida, prenda a extremidade proximal da carótida com um microclipe (Figura 1B). Introduza um adicional de 15-20 μL de tampão de digestão no lúmen e prenda a extremidade distal para evitar a liberação do tampão de digestão.
3. Explantar cuidadosamente as artérias carótidas do rato (Figura 1B,C) e colocá-las em placas de 35 mm contendo solução salina quente (a 37 °C) tamponada com hepes.
   NOTA: Certifique-se de que ambas as braçadeiras estão colocadas de forma segura. Se o grampo se soltar, a solução de digestão pode vazar para fora do lúmen e afetar a contagem de células obtida. Se isso acontecer, adicione solução enzimática adicional usando uma seringa de insulina equipada com uma agulha de 29 G da extremidade aberta da carótida e prenda a braçadeira novamente (Figura 1D). Se a solução tampão enzimática vazar novamente, é provável que a carótida seja cortada durante o processo de explante. Neste caso, descarte a carótida e exclua a amostra do estudo. O manuseio áspero repetido da carótida diminuirá a viabilidade celular e a qualidade da preparação de uma única célula. Tome cuidado para identificar e rotular corretamente as artérias carótidas esquerda e direita.
4. Incubar as carótidas explantadas durante 45 min a 37 °C com balanço intermitente.

4. Rubor das artérias carótidas

1. Depois de completar a digestão enzimática luminal, remova a artéria carótida juntamente com os grampos do prato de 35 mm. Remova cuidadosamente cada braçadeira, tomando cuidado para que o tampão de digestão não vaze.
2. Segure suavemente uma extremidade da artéria carótida com pinça fina em cima de um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Inserir uma agulha de 29 G equipada com uma seringa de insulina contendo 100 μL de tampão de digestão quente (37 °C) no lúmen com a outra mão (figura 1D).
3. Lave rapidamente o lúmen da carótida no tubo de microcentrífuga. Bloquear a reação enzimática adicionando 0,3 mL de FBS no tubo de 1,5 mL. Coloque o tubo no gelo.
   NOTA: A lavagem contém as células da digestão enzimática luminal. A adição de FBS e a redução da temperatura interrompem o processo de digestão enzimática. Se o número de células na preparação for alto e contiver detritos ou tecido adiposo, o uso de um filtro celular de 50 ou 70 μm é altamente recomendado para filtrar detritos de tecidos indesejados. Para aumentar a contagem de células únicas, recomenda-se a lavagem de várias carótidas. Aqui, para obter pelo menos 5.000 células, 10-12 carótidas foram lavadas e agrupadas como uma amostra.
4. Centrifugar as células a 500 × g durante 5 min a 4 °C utilizando uma centrífuga equipada com um rotor de ângulo fixo (ver Tabela de Materiais).
5. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em tampão de digestão contendo reagente de dissociação celular (ver Tabela de Materiais) durante 5 min a 37 °C para separar todas as células em células únicas.
   NOTA: Se o número de células na preparação for baixo, aumente a velocidade da centrífuga até 2.000-3.000 × g para girar as células. Além disso, o uso de tubos de centrífuga de 0,5 mL facilita uma melhor visualização da pastilha celular na parte inferior do tubo.
6. Bloqueie a reação enzimática adicionando 0,15 mL de FBS ao tubo de 0,5 mL.
7. Centrifugar a suspensão de célula única a 500 × g durante 5 minutos a 4 °C utilizando uma centrífuga equipada com um rotor de ângulo fixo, como na etapa 4.4.
8. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células em 100 μL de solução gelada de albumina sérica bovina a 1% (BSA) em PBS em um tubo de microcentrífuga de 0,2 mL.
   NOTA: O uso de tubos de centrífuga de 0,2 mL melhora a visualização do pellet de célula única na parte inferior do tubo.

5. Análises unicelulares e unicelulares

1. Ressuspeite e submeta a preparação de célula única para scRNAseq.
   1. Ressuspender o pellet unicelular com 100 μL de BSA gelado a 1% em PBS em um tubo de 0,2 mL.
   2. Depois de ressuspender as células para encapsulamento de célula única, prossiga imediatamente para encapsulamento de célula única e codificação de barras usando um sistema de particionamento e código de barras de célula única baseado em microfluídica (consulte a Tabela de Materiais).
   3. Antes de submeter as amostras ao Núcleo Genómico, contar e inspeccionar as preparações unicelulares; assegurar a ausência de agregados celulares.
      NOTA: A agregação de células individuais pode ser ainda mais minimizada aumentando a quantidade de BSA em até 2%.
2. Suspenda novamente e envie a preparação de célula única para scATACseq.
   1. Ressuspender o pellet celular em 100 μL de BSA a 0,04% em PBS gelado a 1x e centrifugar a suspensão de célula única a 500 × g a 4 °C.
   2. Lisar a suspensão unicelular com tampão de lise gelado 0,1x (Tabela 1) e incubar por 5 min no gelo.
   3. Misture o lisado 10 vezes com uma pipeta P-20 e incube por mais 10 minutos.
   4. Adicionar 500 μL de tampão de lavagem refrigerado (Tabela 1) às células lisadas e misturar 5 vezes utilizando uma pipeta.
      NOTA: Use um filtro de células de 70 μm para filtrar quaisquer detritos da suspensão celular e transferi-los para um tubo de 2 mL.
   5. Centrifugar o lisado a 500 × g durante 5 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o pellet de núcleos no tampão de núcleos diluídos (150 μL) (ver Tabela de Materiais e Tabela 1). Contar e inspecionar as preparações de núcleos únicos utilizando um hemocitômetro¹¹.
   6. Envie a amostra de núcleos únicos para o Núcleo Genômico para transposição de núcleos únicos, particionamento de núcleos, preparação de biblioteca e sequenciamento.
      NOTA: Se o número inicial de células for baixo, é comum observar detritos ao longo dos núcleos. Portanto, recomenda-se começar com um número de células alto.

Resultados

Cirurgias de ligadura parcial da carótida foram realizadas em 44 camundongos, e o início do fluxo d na ACV foi validado pela realização de ultrassonografia um dia após a cirurgia de ligadura parcial. A cirurgia de ligadura parcial bem-sucedida causa redução da velocidade do fluxo sanguíneo e reverte o fluxo sanguíneo (fluxo perturbado) na ACV³. As artérias carótidas foram dissecadas aos dois dias ou duas semanas após a ligadura. O lúmen de cada carótida foi submetido à dige...

Discussão

Este artigo fornece um protocolo detalhado para isolar preparações unicelulares das artérias carótidas de camundongos. A influência do fluxo d nas células endoteliais pode ser estudada com precisão se a cirurgia de LCP for realizada corretamente. É crucial identificar corretamente os ramos da carótida comum, como a carótida externa, a carótida interna, a artéria occipital e a artéria tireoidiana superior. A validação dos padrões de fluxo por ultrassonografia valida ainda mais o início bem-su...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
1x PBS (Cell Culture Grade)	Corning	21040CMX12
1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes	Eppendorf	022-43-108-1
15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile	Fablab	FL4022
50 mL SuperClear Centrifuge Tubes	Labcon	3191-335-028
6-0 Silk Suture Sterile	Covidien	s-1172 c2
70 µm Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged	Thermo Fisher Scientic	08-771-2
Accutase solution,sterile-filtered	Sigma-Aldrich	A6964-100ML	or equivalent
ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix)	10x Genomics	2000122
ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix)	10x Genomics	2000123/ 2000138
Bovine Serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906-500G
Buprenorphine	Med-Vet International	RXBUPRENOR5-V
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit	10X Genomics	1000204
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1	10X Genomics	1000121
Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1	10X Genomics	1000175
Collagenase II	MP Biomedicals	2100502.5
Digitonin	Sigma-Aldrich	D141-100MG
Dissecting Forceps	Roboz Surgical Instruments Co	RS-5005
Dnase1	New England Biolabs Inc	M0303S
Centrifuge (Benchtop-Model # 5425)	Eppendorf	22620444230VR
Fetal Bovine Serum - Premium Select	R&D systems	S11550
Fixed Angle Rotor	Eppendorf	FA-45-24-11-Kit Rotor
HEPES buffered saline	Millipore Sigma	51558
Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe)	BD	305932
Isoflurane	Patterson vet	789 313 89
MACs Smart Strainers (30 µm)	Miltenyi Biotec	130-098-458
MACS SmartStrainers (100 µm)	Miltenyi Biotec	130-098-463
Normal Saline (0.9% sodium chloride)	Baxter International Inc	2B1323
Nuclei Buffer (20x)	10x Genomics	PN 2000153/2000207
PBS (10x), pH 7.4	Thermo Fisher Scientic	70011-044
Small scissors	Roboz Surgical Instruments Co	RS-5675
Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5480	or similar
Tissue Mend II	Webster Veteinanry	07-856-7946
Type II Collagenase	MP biomedicals	2100502.1
Deposited Data
scATACseq FastQ files	NCBI	www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233
scRNAseq FastQ files	NCBI	www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233
Software and Algorithms
Cell Ranger 3.1.0	10X Genomics	https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp
Cicero	Pliner et al., 2018	https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/
Ggplot2 v3.2.1	Hadley Wickham	https://cran.r-project.org
Harmony	Korsunsky et al., 2019	https://github.com/immunogenomics/harmony
ImageJ	Schneider et al., 2012	https://imagej.nih.gov
Monocle 2.8.0	Qiu et al., 2017	https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release
R version 3.6.2	R Foundation	https://www.r-project.org
Seurat 3.1.3	Stuart et al., 2019	https://github.com/satijalab/seurat
Signac 0.2.5	Stuart et al., 2019	https://github.com/timoast/signac