Isolement de cellules endothéliales de la lumière des artères carotides de souris pour des expériences multi-omiques unicellulaires

Résumé

Nous présentons une méthode pour isoler les cellules endothéliales et les noyaux de la lumière des artères carotides de souris exposées à des conditions d’écoulement stables ou perturbées pour effectuer des expériences omiques unicellulaires.

Résumé

L’athérosclérose est une maladie inflammatoire des régions artérielles exposées à un flux sanguin perturbé (d-flow). Le flux D régule l’expression des gènes dans l’endothélium aux niveaux transcriptomique et épigénomique, ce qui entraîne des réponses proathérogènes. Récemment, des études de séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNAseq) et de dosage unicellulaire pour le séquençage de la chromatine accessible par transposase (scATACseq) ont été réalisées pour déterminer les changements transcriptomiques et d’accessibilité de la chromatine à une résolution unicellulaire à l’aide du modèle de ligature partielle des carotides (LCP) chez la souris. Comme les cellules endothéliales (CE) représentent une fraction mineure des populations cellulaires totales dans la paroi artérielle, une méthode de digestion luminale a été utilisée pour obtenir des préparations unicellulaires enrichies en CE. Pour cette étude, des souris ont été soumises à une chirurgie PCL pour induire un flux d dans l’artère carotide gauche (ACL) tout en utilisant l’artère carotide droite (RCA) comme témoin. Les artères carotides ont été disséquées deux jours ou deux semaines après la chirurgie du LCP. La lumière de chaque carotide a été soumise à une digestion de collagénase et des cellules uniques enrichies en endothéliales ou des noyaux simples ont été obtenus. Ces préparations unicellulaires et mononucléiformes ont ensuite été codées à barres à l’aide d’une configuration microfluidique 10x Genomics. Les cellules uniques et les noyaux uniques codés à barres ont ensuite été utilisés pour la préparation de l’ARN, la génération de bibliothèques et le séquençage sur un séquenceur d’ADN à haut débit. Après le traitement bioinformatique, les ensembles de données scRNAseq et scATACseq ont identifié divers types de cellules à partir de la digestion luminale, principalement constituées de CE. Des cellules musculaires lisses, des fibroblastes et des cellules immunitaires étaient également présents. Cette méthode d’enrichissement de la CE a aidé à comprendre l’effet du flux sanguin sur l’endothélium, ce qui aurait pu être difficile avec la méthode de digestion de l’artère totale. La méthode de préparation unicellulaire enrichie en CE peut être utilisée pour effectuer des études omiques unicellulaires chez des souris knockouts EC et transgéniques lorsque l’effet du flux sanguin sur ces gènes n’a pas été étudié. Il est important de noter que cette technique peut être adaptée pour isoler des cellules uniques enrichies en CE à partir d’explants d’artères humaines afin d’effectuer des études mécanistiques similaires.

Introduction

Ce laboratoire a précédemment démontré que l’induction du flux d conduit à un développement rapide et robuste de l’athérosclérose chez les souris hyperlipidémiques ^1,2. Le nouveau modèle murin d’athérosclérose induite par le flux d a été possible en utilisant la chirurgie de ligature carotidienne partielle (LCP) ³. La chirurgie PCL induit un débit sanguin faible et oscillatoire ou un flux d dans l’artère carotide gauche ligaturée (ACL). En revanche, l’artère carotide droite controlatérale (ARC) continue de faire face à un flux laminaire stable (s-flux). Auparavant, pour comprendre l’effet du flux d sur les cellules endothéliales, les artères carotides étaient disséquées après une chirurgie de ligature partielle et rincées avec un agent de lyse à base de phénol et de guanidine isothiocyanate (méthode de rinçage de l’ARN luminal / ADN)^2,4, qui fournissait des ARN ou des ADN en vrac enrichis en endothéliales. Ces ARN ou ADN groupés en vrac ont ensuite été traités pour des études transcriptomiques ou des études de méthylome d’ADN épigénomique, respectivement ^4,5,6. Ces études ont permis de découvrir de multiples gènes et microARN sensibles aux flux dont les rôles dans la biologie endothéliale et l’athérosclérose ont été largement étudiés ^4,6,7.

Cependant, malgré l’enrichissement endothélial, ces études d’ARN / ADN en vrac n’ont pas pu distinguer le rôle spécifique de chaque type de cellule dans la paroi artérielle dans l’athérosclérose induite par le flux d. Des études d’isolement de cellules uniques enrichies en endothéliales (sc) et de séquençage scRNA et scATAC ont été réalisées pour surmonter cette limitation⁸. Pour cela, les souris C57Bl6 ont été soumises à la chirurgie PCL pour induire un flux d dans l’ACL tout en utilisant le RCA exposé au flux s comme témoin. Deux jours ou deux semaines après la chirurgie du LCP, les souris ont été sacrifiées et les carotides ont été disséquées et nettoyées. La lumière des ACL et des ARC a été perfusée avec de la collagénase, et les digestions de collagénase luminale contenant des CE comme une fraction significative et d’autres cellules artérielles ont été collectées. La suspension unicellulaire (scRNAseq) ou la suspension mononucléiforme (scATACseq) ont été préparées et codées à barres avec des identifiants uniques pour chaque cellule ou noyau à l’aide d’une configuration génomique 10x. Les ARN ont été soumis à la préparation d’une banque d’ADNc et séquencés.

Les ensembles de données scRNAseq et scATACseq ont été traités à l’aide du logiciel Cell Ranger Single-Cell Software et analysés plus en détail par les packages Seurat et Signac R ^9,10. Chaque cellule et noyau s’est vu attribuer un type de cellule à partir de ces analyses et a été regroupé dans le type cellulaire en fonction des gènes marqueurs et des profils d’expression génique uniques. Les résultats du scRNAseq et du scATACseq ont démontré que ces préparations unicellulaires sont enrichies en EC et contiennent également des cellules musculaires lisses (SMC), des fibroblastes et des cellules immunitaires.

Une analyse plus approfondie a révélé que la population EC dans la digestion luminale est très divergente et plastique (8 grappes EC différentes) et sensible au flux sanguin. Plus important encore, ces résultats ont démontré que le flux d reprogramme les CE d’un phénotype anti-inflammatoire protégé par l’athéros, à des phénotypes pro-athérogènes, y compris la transition pro-inflammatoire, endothéliale à mésenchymateuse, la transition endothéliale souche / cellule progénitrice, et plus surprenant, la transition endothéliale à cellule immunitaire. En outre, les données de scATACseq révèlent de nouveaux changements d’accessibilité de la chromatine dépendants du flux et des sites de liaison aux facteurs de transcription à l’échelle du génome, qui constituent la base de plusieurs nouvelles hypothèses. La méthodologie et le protocole de préparation de cellules endothéliales uniques pour les études multi-omiques unicellulaires des artères carotides de souris sont détaillés ci-dessous.

Protocole

Toutes les procédures relatives aux animaux décrites ci-dessous ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université Emory. Des souris C57BL/6 non hypercholestérolémiques, appariées selon l’âge et le sexe ont été utilisées pour atténuer la variation dépendante du sexe et compenser toute complication des conditions hypercholestérolémiques.

1. Chirurgie de ligature partielle de la carotide (LCP)

NOTE: La ligature partielle de l’artère carotide de l’ACL a été réalisée comme décrit précédemment et démontré³.

1. Anesthésier la souris par inhalation d’isoflurane (5% d’isofluorane dans l’oxygène pour l’induction et 1,5% après pour l’entretien) tout au long de la procédure à l’aide d’un vaporisateur anesthésique. Placez la souris en décubitus dorsal sur un tampon isotherme Deltaphase pour éviter la perte de chaleur corporelle pendant la chirurgie.
2. Appliquez une pommade oculaire pour prévenir la kératite d’exposition et confirmez la profondeur de l’anesthésie par l’absence de réponse de pincement des orteils.
3. Injecter 0,05 mg/kg de buprénorphine par voie sous-cutanée pour gérer la douleur de manière préventive. Désinfectez la zone épilée en appliquant et en nettoyant trois fois avec une solution de bétadine et d’isopropanol. Assurez-vous que la bétadine est la dernière étape pour stériliser la zone chirurgicale, en commençant par le centre et en terminant sur les côtés.
4. À l’aide de techniques aseptiques, faites une incision médiane ventrale (~ 1 cm) dans la région du cou et exposez le point de branche de l’ACL par dissection émoussée.
5. Liférer la carotide interne gauche, la carotide externe et les artères occipitales avec une suture de soie 6-0; Laissez intacte l’artère thyroïdienne supérieure.
6. Approchez la peau et fermez l’incision avec de la colle tissulaire et / ou des sutures.
7. Transférez la souris dans une cage de récupération préchauffée (maintenue à 37 °C) et placez-la sur une serviette propre jusqu’à 1 h pour éviter l’hypothermie post-chirurgicale.
   REMARQUE: D’après notre expérience, une dose unique préventive de buprénorphine (0,05 mg / kg) est généralement suffisante pour la gestion de la douleur post-chirurgicale. Une dose répétée de buprénorphine peut être administrée si l’animal est en détresse après les premières 24 heures. Si elle est effectuée correctement, il n’y a pas de mortalité associée à cette procédure et le stress postopératoire de la souris est minime. Les souris sont retournées dans leurs cages respectives et surveillées quotidiennement après la chirurgie.
8. Préparez la configuration de la perfusion.
   1. Utilisez du NaCl à 0,9 % (solution saline normale) contenant 10 U/mL d’héparine dans une poche intraveineuse. Accrochez la poche intraveineuse à 244-274 cm (8-9 pieds) du sol ou environ 122-152 cm (4-5 pieds) plus haut que la planche de dissection. Fixez l’aiguille papillon à l’extrémité de la ligne saline et rincez toutes les bulles d’air de la ligne IV.

2. Isolement des artères carotides après le sacrifice

1. Sacrifier les souris par inhalation de CO₂ en suivant le protocole institutionnel IACUC.
2. Vaporisez de l’éthanol à 70% sur la peau de la souris et placez-la en décubitus dorsal sur la planche de dissection contenant des serviettes en papier adsorbantes. Fixez les pattes de la souris aux serviettes adsorbantes sur la planche de dissection à l’aide de ruban adhésif ou d’une aiguille de 21 G.
3. À l’aide d’une paire de ciseaux stériles, retirez la peau de la souris en partant de l’abdomen et jusqu’au sommet du thorax.
4. Utilisez une paire de ciseaux pour ouvrir la paroi abdominale sous la cage thoracique par dissection contondante.
5. À l’aide des ciseaux, faites soigneusement une incision le long du diaphragme et continuez à travers les côtes des deux côtés du thorax jusqu’à ce que le sternum puisse être soulevé. Soulevez doucement le sternum avec une paire de pinces; Après cela, retirez la cage thoracique pour exposer le cœur.
6. Retirez soigneusement le thymus et tout tissu conjonctif sur le cœur pour visualiser les principaux vaisseaux.
7. Couper la veine cave avec des ciseaux pour permettre au sang de sortir de la circulation fermée.
8. Insérez une aiguille papillon de 21 G reliée à la ligne IV par l’apex du cœur dans le ventricule gauche et laissez perfusionner rétrograde pendant 2-3 minutes avec une solution saline normale à température ambiante. Assurez-vous qu’un débit constant de solution saline normale est maintenu en gardant le sac de solution saline à une hauteur de 8-9 pieds du sol.
   REMARQUE: Les poumons et le foie deviennent pâles, indiquant une perfusion optimale. Environ 20 mL de tampon de perfusion sont utilisés pour chaque souris.
9. Retirez la peau de la région du cou et retirez toute la graisse, les muscles et les tissus conjonctifs pour exposer les artères carotides (Figure 1A).
   REMARQUE: Le reste de la procédure est effectué au microscope à dissection.
10. Ajustez le champ de vision pour localiser les sites de ligature. À l’aide des ciseaux de microdissection de 10 mm, faites une petite incision sous le site de ligature dans l’ACL pour permettre la perfusion.
11. Perfuser à nouveau pendant 1 minute supplémentaire via le ventricule gauche et s’assurer que l’ACL est bien perfusée et exempte de toute trace visible de sang.
12. Utilisez des pinces à pointe fine et de petits ciseaux à ressort pour retirer soigneusement les tissus péri-adventices entourant les carotides pendant que la carotide est attachée au corps.
    REMARQUE: Soyez extrêmement prudent de ne pas presser ou étirer les artères carotides pendant cette étape de nettoyage, car cela peut augmenter le nombre de cellules non viables. Si elle est effectuée correctement, la viabilité cellulaire dans la suspension cellulaire finale est généralement de >93%.

3. Isolement unicellulaire enrichi en cellules endothéliales de carotides de souris

NOTA: Les réactifs décrits ci-dessous peuvent être préparés à l’avance et conservés à 4 °C jusqu’à utilisation: tampons de lyse mononucléi 1x et 0,1x avec les réactifs énumérés dans le tableau 1; tampon de lavage mononoyaux avec les réactifs énumérés au tableau 1; recette tampon de noyaux simples avec les réactifs énumérés dans le tableau 1. Les stocks de travail de ces tampons doivent être préparés conformément au protocole du fabricant. Composition tampon de digestion : Collagénase de type II 600 U/mL et DNase I 60 U/mL dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant du sérum fœtal bovin à 0,5 %.

1. Pendant que les carotides sont encore attachées, laver l’extérieur des artères carotides avec une solution saline normale pour éliminer toute trace de sang.
2. À l’aide d’une seringue à insuline munie d’une aiguille de 29 G, injecter ~ 50 μL du tampon digestif dans la lumière de l’extrémité distale de l’artère carotide gauche. Lorsque le tampon de digestion commence à remplir l’artère carotide, serrez l’extrémité proximale de la carotide avec un micro-clip (Figure 1B). Introduisez 15 à 20 μL supplémentaires de tampon de digestion dans la lumière et coupez l’extrémité distale pour éviter la libération du tampon de digestion.
3. Extplanter délicatement les artères carotides de la souris (Figure 1B,C) et les placer dans des boîtes de 35 mm contenant une solution saline chaude (à 37 °C) tamponnée à l’hepes.
   REMARQUE: Assurez-vous que les deux pinces sont bien placées. Si la pince se desserre, la solution de digestion peut s’échapper de la lumière et affecter le nombre de cellules obtenues. Si cela se produit, ajouter une solution enzymatique supplémentaire à l’aide d’une seringue à insuline munie d’une aiguille de 29 G à partir de l’extrémité ouverte de la carotide et fixer à nouveau la pince (Figure 1D). Si la solution tampon enzymatique fuit à nouveau, il est probable que la carotide soit sectionnée pendant le processus d’explantation. Dans ce cas, jetez la carotide et excluez l’échantillon de l’étude. Une manipulation brutale répétée de la carotide diminuera la viabilité cellulaire et la qualité de la préparation unicellulaire. Prenez soin d’identifier et d’étiqueter correctement les artères carotides gauche et droite.
4. Incuber les carotides explantées pendant 45 min à 37 °C avec un balancement intermittent.

4. Rinçage des artères carotides

1. Après avoir terminé la digestion enzymatique luminale, retirez l’artère carotide avec les pinces de la capsule de 35 mm. Retirez soigneusement chaque pince, en veillant à ce que le tampon de digestion ne fuie pas.
2. Tenez doucement une extrémité de l’artère carotide à l’aide d’une pince fine sur un tube microcentrifuge de 1,5 mL. Insérez une aiguille de 29 G munie d’une seringue à insuline contenant 100 μL de tampon de digestion chaude (37 °C) dans la lumière de l’autre main (figure 1D).
3. Rincer rapidement la lumière de la carotide dans le tube microcentrifugeux. Bloquer la réaction enzymatique en ajoutant 0,3 mL de FBS dans le tube de 1,5 mL. Placez le tube sur de la glace.
   REMARQUE: Le rinçage contient les cellules de la digestion enzymatique luminale. L’ajout de FBS et la réduction de la température arrêtent le processus de digestion enzymatique. Si le nombre de cellules dans la préparation est élevé et contient des débris ou du tissu adipeux, l’utilisation d’une passoire cellulaire de 50 ou 70 μm est fortement recommandée pour filtrer les débris de tissus indésirables. Pour augmenter le nombre de cellules uniques, il est recommandé de rincer plusieurs carotides. Ici, pour obtenir au moins 5 000 cellules, 10 à 12 carotides ont été rincées et regroupées en un seul échantillon.
4. Centrifuger les cellules à 500 × g pendant 5 min à 4 °C à l’aide d’une centrifugeuse équipée d’un rotor à angle fixe (voir le tableau des matériaux).
5. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans un tampon de digestion contenant un réactif de dissociation cellulaire (voir le tableau des matières) pendant 5 min à 37 °C pour séparer toutes les cellules en cellules individuelles.
   REMARQUE: Si le nombre de cellules dans la préparation est faible, augmenter la vitesse de la centrifugeuse jusqu’à 2 000-3 000 × g pour faire tourner les cellules. De plus, l’utilisation de tubes centrifuges de 0,5 mL facilite une meilleure visualisation de la pastille de cellule au fond du tube.
6. Bloquer la réaction enzymatique en ajoutant 0,15 mL de FBS dans le tube de 0,5 mL.
7. Centrifuger la suspension unicellulaire à 500 × g pendant 5 min à 4 °C à l’aide d’une centrifugeuse équipée d’un rotor à angle fixe, comme à l’étape 4.4.
8. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 100 μL de solution glacée d’albumine sérique bovine (BSA) glacée à 1 % dans du PBS dans un tube microcentrifuge de 0,2 mL.
   REMARQUE: L’utilisation de tubes centrifugés de 0,2 mL améliore la visualisation de la pastille unicellulaire au fond du tube.

5. Analyses unicellulaires et mononucléales

1. Resuspendre et soumettre la préparation unicellulaire pour scRNAseq.
   1. Remettez en suspension la pastille unicellulaire avec 100 μL de BSA glacé à 1% dans du PBS dans un tube de 0,2 mL.
   2. Après avoir remis en suspension les cellules pour l’encapsulation d’une seule cellule, procéder immédiatement à l’encapsulation d’une seule cellule et au codage à barres à l’aide d’un système de partitionnement et de codage à barres monocellulaire basé sur la microfluidique (voir le tableau des matériaux).
   3. Avant de soumettre les échantillons au noyau génomique, compter et inspecter les préparations unicellulaires; s’assurer de l’absence d’agrégats cellulaires.
      REMARQUE: L’agrégation de cellules individuelles peut être minimisée davantage en augmentant la quantité de BSA jusqu’à 2%.
2. Resuspendez et soumettez la préparation unicellulaire pour scATACseq.
   1. Resuspendre la pastille de cellule dans 100 μL de BSA à 0,04 % dans 1x PBS glacé et centrifuger la suspension unicellulaire à 500 × g à 4 °C.
   2. Lyser la suspension unicellulaire avec un tampon de lyse glacé 0,1x (tableau 1) et incuber pendant 5 minutes sur de la glace.
   3. Mélanger le lysat 10 fois avec une pipette P-20 et incuber pendant 10 minutes supplémentaires.
   4. Ajouter 500 μL de tampon de lavage réfrigéré (tableau 1) aux cellules lysées et mélanger 5 fois à l’aide d’une pipette.
      REMARQUE : Utilisez une crépine cellulaire de 70 μm pour filtrer les débris de la suspension cellulaire et transférez-les dans un tube de 2 mL.
   5. Centrifuger le lysat à 500 × g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant et remettre en suspension le noyau et la pastille dans le tampon de noyaux dilués (150 μL) (voir le tableau des matériaux et le tableau 1). Compter et inspecter les préparations mononucléiformes à l’aide d’un hémocytomètre¹¹.
   6. Soumettez l’échantillon de noyaux uniques au cœur de génomique pour la transposition à noyau unique, le partitionnement des noyaux, la préparation de la bibliothèque et le séquençage.
      REMARQUE: Si le nombre initial de cellules est faible, il est courant d’observer des débris le long des noyaux. Par conséquent, il est recommandé de commencer avec un nombre de cellules élevé.

Résultats

Des chirurgies partielles de ligature carotidienne ont été effectuées sur 44 souris, et le début du flux d dans l’ACL a été validé en effectuant une échographie un jour après la chirurgie de ligature partielle. Une chirurgie de ligature partielle réussie entraîne une réduction de la vitesse du flux sanguin et inverse le flux sanguin (flux perturbé) dans l’ACL³. Les artères carotides ont été disséquées soit deux jours, soit deux semaines après la ligature. La lumièr...

Discussion

Cet article fournit un protocole détaillé pour isoler les préparations unicellulaires des artères carotides de souris. L’influence du flux d sur les cellules endothéliales peut être étudiée avec précision si la chirurgie PCL est effectuée correctement. Il est crucial d’identifier correctement les branches de la carotide commune, telles que la carotide externe, la carotide interne, l’artère occipitale et l’artère thyroïdienne supérieure. La validation des schémas d’écoulement par échogr...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
1x PBS (Cell Culture Grade)	Corning	21040CMX12
1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes	Eppendorf	022-43-108-1
15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile	Fablab	FL4022
50 mL SuperClear Centrifuge Tubes	Labcon	3191-335-028
6-0 Silk Suture Sterile	Covidien	s-1172 c2
70 µm Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged	Thermo Fisher Scientic	08-771-2
Accutase solution,sterile-filtered	Sigma-Aldrich	A6964-100ML	or equivalent
ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix)	10x Genomics	2000122
ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix)	10x Genomics	2000123/ 2000138
Bovine Serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906-500G
Buprenorphine	Med-Vet International	RXBUPRENOR5-V
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit	10X Genomics	1000204
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1	10X Genomics	1000121
Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1	10X Genomics	1000175
Collagenase II	MP Biomedicals	2100502.5
Digitonin	Sigma-Aldrich	D141-100MG
Dissecting Forceps	Roboz Surgical Instruments Co	RS-5005
Dnase1	New England Biolabs Inc	M0303S
Centrifuge (Benchtop-Model # 5425)	Eppendorf	22620444230VR
Fetal Bovine Serum - Premium Select	R&D systems	S11550
Fixed Angle Rotor	Eppendorf	FA-45-24-11-Kit Rotor
HEPES buffered saline	Millipore Sigma	51558
Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe)	BD	305932
Isoflurane	Patterson vet	789 313 89
MACs Smart Strainers (30 µm)	Miltenyi Biotec	130-098-458
MACS SmartStrainers (100 µm)	Miltenyi Biotec	130-098-463
Normal Saline (0.9% sodium chloride)	Baxter International Inc	2B1323
Nuclei Buffer (20x)	10x Genomics	PN 2000153/2000207
PBS (10x), pH 7.4	Thermo Fisher Scientic	70011-044
Small scissors	Roboz Surgical Instruments Co	RS-5675
Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5480	or similar
Tissue Mend II	Webster Veteinanry	07-856-7946
Type II Collagenase	MP biomedicals	2100502.1
Deposited Data
scATACseq FastQ files	NCBI	www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233
scRNAseq FastQ files	NCBI	www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233
Software and Algorithms
Cell Ranger 3.1.0	10X Genomics	https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp
Cicero	Pliner et al., 2018	https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/
Ggplot2 v3.2.1	Hadley Wickham	https://cran.r-project.org
Harmony	Korsunsky et al., 2019	https://github.com/immunogenomics/harmony
ImageJ	Schneider et al., 2012	https://imagej.nih.gov
Monocle 2.8.0	Qiu et al., 2017	https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release
R version 3.6.2	R Foundation	https://www.r-project.org
Seurat 3.1.3	Stuart et al., 2019	https://github.com/satijalab/seurat
Signac 0.2.5	Stuart et al., 2019	https://github.com/timoast/signac