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要約

本稿では,男性減数分裂の貴重なモデルであるGSK923295の腹部手術と精巣注射によるCENP-Eの in vivo 阻害について報告する.免疫蛍光法、フローサイトメトリー法、透過型電子顕微鏡アッセイを用いて、CENP-E阻害がマウス精母細胞に染色体のミスアライメントとゲノム不安定性をもたらすことを示しています。

要約

真核生物では、減数分裂は有性生殖におけるゲノムの安定性と遺伝的多様性に不可欠です。精巣の精母細胞の実験的解析は、雄減数分裂における紡錘体集合と染色体分配の研究に重要です。マウス精母細胞は減数分裂の機構研究に理想的なモデルですが、精母細胞を分析するための効果的な方法が不足しています。本論文では、マウス精母細胞におけるキネシン-7 CENP-Eのin vivo阻害のための実用的かつ効率的な方法が報告されています。3週齢のマウスにおける腹部手術による特異的阻害剤の精巣注射GSK923295詳細な手順が提示される。さらに、ここでは、組織採取および固定、ヘマトキシリン-エオジン染色、免疫蛍光法、フローサイトメトリーおよび透過型電子顕微鏡法のための一連のプロトコルについて説明する。ここでは、男性の減数分裂を研究するための強力な手法となる可能性のある、腹部手術と精巣注射によるin vivo阻害モデルを紹介します。また、CENP-E阻害が減数分裂I期の初代精母細胞における染色体のずれと中期停止をもたらすことを実証します。私たちのin vivo阻害法は、減数分裂の機構研究を容易にし、雄生殖系列の遺伝子改変に有用な方法として役立ち、将来の臨床応用に光を当てます。

概要

減数分裂は、真核生物における最も重要で、非常に剛性が高く、進化的に保存されたイベントの1つであり、配偶子形成、有性生殖、ゲノムの完全性、および遺伝的多様性に不可欠です1,2,3。哺乳類では、生殖細胞は、DNA複製の1ラウンド後に、減数分裂IおよびIIの2つの連続した細胞分裂を受ける。有糸分裂の姉妹染色分体とは異なり、重複した相同染色体はペアになり、減数分裂Iの間に2つの娘細胞に分離します4,5。減数分裂IIでは、姉妹染色分体が引き離されて分離し、DNA複製のない一倍体配偶子を形成します6。紡錘体アセンブリの欠陥や染色体の誤分離など、2つの減数分裂のいずれかの間違いは、配偶子の喪失、不妊または異数性症候群を引き起こす可能性があります7,8,9。

蓄積された研究は、キネシンファミリーモーターが有糸分裂細胞と減数分裂細胞の両方で染色体の整列と分配、紡錘体集合、細胞質分裂、および細胞周期の進行の調節に重要な役割を果たすことを示しています10,11,12。キネシン-7 CENP-E(セントロメアプロテインE)は、染色体会議、染色体輸送と整列、および有糸分裂13,14,15,16,17,18における紡錘体集合チェックポイントの調節に必要なプラスエンド指向性動原体モーターです。減数分裂の間、特異的阻害剤によるCENP-E阻害GSK923295、精子形成細胞の細胞周期停止、染色体ミスアライメント、紡錘体解体、およびゲノム不安定性につながります19。分裂する精母細胞のセントロメアにおけるCENP-Eの局在パターンとダイナミクスは、CENP-Eが減数分裂中のセントロメアの連続的な集合のために動原体タンパク質と相互作用することを示していますI20,21。卵母細胞では、CENP-Eは染色体の整列と減数分裂Iの完了に必要です13、22、23。CENP-Eの抗体またはモルホリノ注射は、染色体の不整列、異常な動原体の配向、およびマウスおよびショウジョウバエ卵母細胞の両方における減数分裂I停止をもたらす23。有糸分裂におけるCENP-Eの本質的な役割と比較して、減数分裂におけるCENP-Eの機能とメカニズムはほとんど不明のままです。CENP-Eの染色体会議における詳細なメカニズムと雄減数分裂細胞におけるゲノム安定性は、まだ明らかにされていません。

精子形成は複雑で長期にわたる生理機能プロセスであり、連続的な精原細胞の増殖、減数分裂、精子形成が含まれます。したがって、プロセス全体を哺乳動物および他の種においてインビトロで再現することは極めて困難である24、25。インビトロでパキテン期以降の精母細胞分化を誘導することは不可能である。雄減数分裂に関する研究は、一般に、初期減数分裂前期の実験的解析に限定されてきた25,26。精母細胞の短期培養27,28や臓器培養法25など、多くの技術的努力にもかかわらず、男性の減数分裂を研究するための効果的な方法はほとんどありません。さらに、必須遺伝子の遺伝的欠失は、通常、発生停止と胚致死をもたらします。例えば、CENP-Eを欠くマウス胚は着床に失敗し、過去の着床を発達させることができず29、これは減数分裂におけるCENP-Eの機構的研究における障害となっている。まとめると、男性減数分裂を研究するための実用的で実行可能なシステムを確立することは、減数分裂の研究分野を大いに促進することができます。

小細胞透過性阻害剤は、細胞分裂および発生過程におけるキネシンモーターを研究するための強力なツールです。アロステリック阻害剤であるGSK923295は、CENP-Eモータードメインに特異的に結合し、ADP(アデノシン二リン酸)の放出をブロックし、最終的にCENP-Eと微小管との間の相互作用を安定化させる30。この研究では、 in vivo 阻害マウスモデルが、腹部手術と精巣注射によって提示されます GSK923295。CENP-E阻害は、初代精母細胞の中期Iにおいて染色体のミスアライメントをもたらす。さらに、CENP-E阻害は、精母細胞の減数分裂停止および精子形成の破壊をもたらす。精母細胞の分析には一連のプロトコルが記載されており、精母細胞における減数分裂紡錘体微小管、相同染色体、および細胞内小器官の観察に適用できます。私たちの in vivo 阻害法は、減数分裂と精子形成の研究に効果的な方法です。

プロトコル

すべての動物実験は、福建医科大学の動物管理および使用委員会によってレビューおよび承認されました(プロトコル番号SYXK 2016-0007)。すべてのマウス実験は、国立衛生研究所の実験動物のケアと使用の関連ガイドライン(NIH出版物番号8023、改訂1978)に従って実施されました。

1. GSK923295を介したCENP-E阻害マウスモデルの構築

  1. 手術器具を121°Cで30分間滅菌します。外科用ウルトラクリーンワークベンチに紫外線C(UVC)を2時間照射します。実験に用いた3週齢の雄性ICR(がん研究所)マウスの体重を測定し、必要な麻酔薬の投与量を計算します。
  2. ケタミン(100 mg / kg)とキシラジン(10 mg / kg)の組み合わせを腹腔内注射で投与することにより、マウスに麻酔をかけます。マウスの角膜反射、侵害受容反射、呼吸、および筋緊張の組み合わせを通じて、マウスの麻酔の深さを確認します。マウスが深く麻酔されていることを確認します。
    注意: 動物を加熱パッドの上に置いて、手術中に熱サポートを提供します。
  3. マウスの手足を縛り、ワックストレイに固定します。麻酔下での乾燥を防ぐために、マウスの目に獣医軟膏を一滴置きます。マウスの腹毛を下腹部から陰嚢にかけて実験動物のカミソリを用いて剃る。滅菌ドレープで手術部位を固定します。
  4. 腹側の腹部をベタジンスクラブで消毒し、続いて75%エタノールを3回消毒します。滅菌メスを使用して腹腔を開き、<5 mmの開口部を作ります。
  5. 滅菌外科用クランプで皮膚をクランプし、滅菌解剖鉗子で精巣上体脂肪パッドを引っ張って、滅菌ピンセットを使用して精巣を見つけます。ステレオスコープ下で滅菌鉗子で精巣を固定し、10 μLのレオダイン30を使用して、10 μLのGSK923295を精細管に最終濃度10 μMでゆっくりと注入します。対照群の構築のために、10 μLの1%DMSO(ジメチルスルホキシド)/ PBS(リン酸緩衝生理食塩水)溶液を注入します。
    注意: GSK923295溶液は-80°Cで10mMの濃度で保管してください。 0.1 μLの10 mM GSK923295を100 μLのPBS溶液に溶解し、10 μMのGSK923295溶液を調製します。
  6. 滅菌手術用鉗子で精巣を腹腔内にそっと押し戻します。直径0.1 mmの縫合線を使用して、腹膜と皮膚を2〜4針で別々に縫合します。
  7. 腹部手術後、動物の背中にある3 x 3 mmの場所に永久マーカーを付け、マウスを給餌ケージに戻し、十分な食物と水で清潔で病原体のない環境を確保します。
  8. ろ過された空気、滅菌された食品、および水を通して環境を無菌状態に保ちます。胸骨横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、動物の世話をします。術後鎮痛のために、ブプレノルフィン(0.1 mg / kg)の用量を12時間ごとに3日間皮下投与します。.完全に回復するまで、マウスが他の動物の会社に戻されないようにします。
    注:マウスは術後ケアを受け、必要に応じて術後の痛みを軽減するために0.5%リドカインを使用して創傷局所麻酔を適切に行います。

2.ヘマトキシリン-エオジン(HE)染色と組織病理学

  1. 腹部手術の4日後、CO2チャンバー内で2L/minの流速でCO2でマウスを安楽死させる。安楽死の確認方法としての子宮頸部脱臼による死亡の確認。外科用ハサミを使用して陰嚢を開き、鉗子で精巣を取り除きます。注射の4日後にマウスの精巣を採取しGSK923295 30 mLの10%ホルムアルデヒド溶液に室温で12時間固定します。
  2. グラジエント脱水のために、サンプルを40 mLの70%エタノール中で1時間、40 mLの85%エタノール中で1時間、40 mLの95%エタノール中で1時間、および40 mLの100%エタノール中で1時間順次インキュベートします。
  3. サンプルを40 mLのキシレン中で40分間インキュベートした後、40 mLのパラフィン中で65°Cで1時間インキュベートします。 埋め込みボックスの底にティッシュを置きます。溶かしたパラフィンを埋め込みボックスに入れます。組織を冷却して、4°Cで6時間完全に固化させます。
  4. サンプルをウルトラミクロトームのホルダーに固定し、サンプルとナイフ表面の間の角度を5〜10°に保ち、スライスの厚さを5μmに調整します。ウルトラミクロトームを用いて厚さ5μmの切片を調製し、40°Cの水浴中でスライドを広げ、スライド乾燥機で切片を37°Cで12時間乾燥させた。
  5. スライドを200 mLのキシレン中で40分間、200 mLの100%エタノール中で6分間、200 mLの95%エタノール中で2分間、200 mLの90%エタノール中で2分間、200 mLの80%エタノール中で2分間、および200 mLの70%エタノール中で2分間インキュベートします。 それぞれ。
  6. スライドを蒸留水で5分間すすぎ、メイヤーのヘマトキシリン溶液で室温で6分間染色します。
    注:メイヤーのヘマトキシリン溶液:0.011 mol / Lヘマトキシリン、6.7%無水エタノール、0.646 mol / L硫酸アルミニウムカリウム、および0.003 mol / Lヨウ素酸ナトリウム。
  7. スライドを流水で5分間すすぎ、蒸留水で2分間インキュベートします。
  8. スライドを1%塩酸エタノール中で3秒間インキュベートし、流水で2分間すすぎます。
  9. サンプルを1%エオジンで15秒間染色し、95%エタノールで5秒間、100%エタノールで2分間、キシレンで40分間インキュベートします。
  10. 15 μLの中性ガムと24 x 50 mmのカバーガラスを使用してスライドを密封します。

3. 免疫蛍光顕微鏡および共焦点顕微鏡

  1. 免疫蛍光のためにマウス精巣の厚さ5 μmのパラフィン切片を収集します。スライドをキシレン中で40分間、100%エタノール中で6分間、95%エタノール中で2分間、90%エタノール中で2分間、80%エタノール中で2分間、および70%エタノール中で2分間インキュベートする。スライドを蒸留水で5分間すすぎ、スライドを0.01 M PBSで5分間すすぎます。
  2. スライドを抗原賦活化溶液(0.01 Mクエン酸緩衝液)に入れ、圧力鍋を使用して高圧下で4分間煮沸して抗原賦活化を行います。スライドを室温まで自然に冷却します。蒸留水で5分間2回、PBSで5分間すすぎます。
    注:0.01 Mクエン酸緩衝液(pH 6.0):2.1 mmol / Lクエン酸、11.6 mmol / Lクエン酸三ナトリウム二水和物。
  3. スライドを500 μLの0.25%TritonX-100/PBS中で10分間インキュベートすることにより、細胞を透過させます。スライドをPBSで5分間3回すすぎます。
  4. 抗原ブロッキングのために、サンプルを300 μLの3%ウシ血清アルブミン(BSA)/PBST(PBS中の0.1%Tween-20)で1時間インキュベートします。一次抗体を含むサンプルを3%BSA/PBST中、4°Cで16時間インキュベートします。 スライドを加湿した箱に入れて、組織が乾かないようにします。スライドを室温まで30分間自然に温め直します。
  5. 一次抗体を廃棄し、スライドをPBSTで5分間3回すすぎます。二次抗体を3%BSA/PBSTで希釈します。サンプルを二次抗体とともに37°Cで1〜2時間インキュベートします。 サンプルをPBSTで5分間5回すすぎます。
  6. 核を50 μLの4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)で室温で5分間染色します。カバーガラスをフェード防止封入剤で取り付け、カバーガラスをマニキュアでシールします。
  7. NA 40x/ 0.75対物レンズを備えた蛍光顕微鏡を使用して、スライド内の蛍光シグナルを観察および記録します。

4. フローサイトメトリー

  1. マウスの精巣を6cmのシャーレに集め、外科用ハサミで精巣を1mm3 個に切断する。
  2. 1 mLの1%コラゲナーゼ1 mLを1.5 mLの遠沈管で37°Cで10分間消化した後、サンプルを1,000 x g で5分間遠心分離して精子形成細胞を沈殿させます。
  3. 上清を捨て、0.25%トリプシン-EDTA(エチレンジアミン四酢酸)溶液1 mLを37°Cで20分間加えた後、サンプルを1,000 x g で5分間遠心分離します。
  4. 上清を捨て、沈殿した細胞を1 mLの70%冷エタノールで4°Cで8時間以上インキュベートします。
  5. サンプルを1,000 x g で5分間遠心分離し、細胞沈渣を収集します。精子形成細胞を500 μLのヨウ化プロピジウム(PI)染色溶液(50 μg/mL PI、100 μg/mL RNase A、0.2% Triton X-100 PBS溶液)で37°Cで30分間染色します。
    注意: 細胞凝集を避けるために、5分ごとに遠沈管を静かに振ってください。
  6. 300メッシュスクリーンを使用してサンプルをろ過し、細胞の破片を取り除きます。細胞をフローチューブに集め、4°Cで保存します。
  7. フローサイトメーターを用いて励起波長488 nmの蛍光シグナルと光散乱を検出します。モッドフィットMFLT32ソフトウェアを使用してDNA含有量と光散乱を分析します。

5. 透過型電子顕微鏡

  1. 鋭利なメスを使用して精巣を1 mm 3個に切断し、微細構造の変化を避けるために、サンプルを0.1 M PBS(pH 7.2)中の3 %グルタルアルデヒド-1.5%パラホルムアルデヒド溶液で4°Cで4時間インキュベートします。サンプルを0.1 M PBSで5分間3回すすぎます。
    注意: メスとはさみは鋭利である必要があり、人工的な圧迫や引っ張りを避けるようにしてください。サンプルの処理は固定液中で行わなければならない。
  2. サンプルを1%オスミン酸-1.5%フェロシアン化カリウム溶液に4°Cで1.5時間固定します。ろ紙で水を乾燥させ、サンプルを0.1 M PBSで5分間3回すすぎます。
  3. サンプルを40 mLの50%エタノール中で4°Cで10分間脱水します。 サンプルを40 mLの70%エタノール飽和酢酸ウラン色素中で4°Cで12時間、40 mLの90%エタノール中で4°Cで10分間、40 mLの90%エタノールアセトン中で室温で10分間、および40 mLの無水アセトン中で室温で10分間3回インキュベートします。
  4. サンプルを無水アセトン-エポキシ樹脂618包埋剤(v / v = 1:1)混合物中で1.5時間インキュベートし、次にサンプルをエポキシ樹脂618包埋剤に35°Cで3時間包埋しました。
  5. 樹脂重合の場合は、サンプルをエポキシ樹脂618包埋剤中で35°Cで12時間、45°Cで12時間、次に60°Cで24時間インキュベートします。
  6. サンプルとガラスナイフを取り付けてから、サンプルとナイフの間の距離を調整します。極薄ミクロトームを用いて厚さ90 nmの超薄切片を作製します。サンプルを一定の速度でスライスし、スライドをニッケルメッシュ上に置きます。スライドを室温のペトリ皿に入れる。
  7. スライドを2%酢酸ウラニルで10分間染色した後、サンプルを2%クエン酸鉛で10分間染色します。スライドを蒸留水ですすいでください。スライドを室温で24時間乾燥させる。
  8. スライドを観察し、透過型電子顕微鏡を用いて70-100kVで電子像を記録します。

結果

我々は、GSK92329519の腹部手術と精巣注射によるマウス精巣のin vivo CENP-E阻害モデルの構築に成功しました。この方法の主要な技術的ステップを図1に示します。GSK923295の精巣注射を4日間行った後、さらなる分析のために精巣を採取した。対照群では、精細管における精子形成波は規則的で組織化されていた(図2A)。しかし、GSK...

ディスカッション

本研究では、腹部手術とGSK923295のマイクロインジェクションを用いて、マウス精巣の in vivoCENP-E阻害モデルを確立しました。本研究で用いた腹部手術と精巣注射法には、以下のような利点があります。第一に、マウスの年齢に限定されない。実験者は、早期に、例えば3週齢以下のマウスで精巣注射を行うことができる。第二に、GSK923295はCENP-Eに対して特異的かつ優れた阻害効果を有す?...

開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

有益な議論をしてくれた福建医科大学の細胞骨格研究室のすべてのメンバーに感謝します。フローサイトメトリーの技術支援をしてくださった福建医科大学公共技術サービスセンターのJun-Jin Linに感謝します。福建医科大学公共技術サービスセンターの電子顕微鏡研究所のMing-XiaWu氏とLin-Ying Zhou氏に、電子顕微鏡の技術支援に感謝します。福建医科大学基礎医学実験教育センターのSi-Yi Zheng、Ying Lin、Qi Ke、Jun Songの支援に感謝します。この研究は、中国国家自然科学財団(助成金番号82001608)、中国福建省自然科学財団(助成金番号2019J05071)、福建省健康技術プロジェクト(助成金番号2018-1-69)、福建医科大学科学研究スタートアップ基金(助成金番号2017XQ1001)、福建医科大学高レベル人材科学研究スタートアップ資金プロジェクト(助成金番号XRCZX2017025)、研究プロジェクト漢方薬大学院生のオンライン教育と教育(助成金番号B-YXC20200202-06)。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTAGibco25200056
1 ml SyringeSeveral commercial brands availableSterile.
1.5 mL Centrifuge tubeAxygenMCT-150-C
50 mL Centrifuge TubeCorning430828
6 cm Petri dishCorning430166
95% EthanolSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10009164
tubulin rabbit polyclonal antibodyBeyotimeAF0001For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
rabbit anti-Histone H3 (phospho S10) monoclonal antibodyAbcamab267372For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
rabbit anti-TUBA4A polyclonal antibodySangon BiotechD110022For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
Anti-SYCP3 rabbit monoclonal antibodyAbcamab175191For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
Adhesion microscope slidesCITOTEST188105
Alexa fluor 488-labeled goat anti-rabbit antibodyBeyotimeA0423Sencodary antibody. Use at 1:500.
Aluminium potassium sulphateSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10001060
Anhydrous ethanolSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd100092690
Anti-fade mounting mediumBeyotimeP0131Prevent photobleching of flourescent signals.
BD FACS Canto IIBD BiosciencesFACS Canto II
Bovine Serum AlbuminSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd69003435
CentrifugeEppendorf5424BK745380
Chloral hydrateSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd80037516
Citric acidShanghai Experiment Reagent Co., Ltd122670
CollagenaseSangon BiotechA004194-0100
CoverslipsCITOTEST10212020C20 × 20 mm. Thickness 0.13-0.16 mm.
DAPIBeyotimeC1006
Dye vatSeveral commercial brands available91347802
Eosin Y, alcohol solubleSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd71014460
EtherSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10009318
Formaldehyde - aqueous solutionSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10010018
GSK923295MedChemExpressHY-10299
Hematoxylin, anhydrousSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd71020784
ICR mouseShanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd
Image J softwareNational Institutes of Healthhttps://imagej.nih.gov/ij/Fluorescent image analysis.
Leica ultramicrotomeLeica
Leica EM UC-7 ultramicrotomeLeicaEM UC7
Modfit MFLT32Verity Software HouseFor analysis of flow cytometry results.
Nail polishSeveral commercial brands available
Neutral gumSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10004160
Nikon Ti-S2 microscopeNikonTi-S2
Picric acidSinopharm Chemical Reagent Co.,LtdJ60807
RheodyneSangon BiotechF519160-000110 μl rheodyne
Sliced paraffinSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd69019461
Sodium iodateSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd80117214
Surgical instrumentsSeveral commercial brands availableFor abdominal surgery. Sterilize at 121 °C, 20 min.
Transmission electron microscopeFEITecnai G2
Trisodium citrate dihydrateShanghai Experiment Reagent Co., Ltd173970
Triton X-100Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd30188928Dilute in sterile PBS to make a 0.25% working solution.
Tween 20Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd30189328Dilute in sterile PBS to make a 0.1% working solution.
ParaformaldehydeSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd80096618
XyleneSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10023418

参考文献

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