食道腺癌オルガノイドの継代培養と凍結保存:単一細胞消化の長所と短所

要約

このプロトコルは、単一細胞消化の有無にかかわらず食道腺癌オルガノイドの継代培養および凍結保存の方法を記述し、研究者が実験計画に基づいて適切な戦略を選択できるようにする。

要約

腫瘍形成および治療戦略を探求するための原疾患を反映する適切なトランスレーショナルリサーチモデルの欠如は、食道腺癌(EAC)における大きな障害である。患者由来のオルガノイド(PDO)は、最近、様々な癌における顕著な前臨床モデルとして浮上している。ただし、EAC PDO の開発に使用できるプロトコルはまだ限られています。PDO が確立されると、伝播と凍結保存は、さらに下流の解析に不可欠です。ここでは、EAC PDOの継代培養および凍結保存のために、すなわち、単一細胞消化の有無にかかわらず、2つの異なる方法が標準化されている。どちらの方法も、適切な細胞生存率を確実に得ることができ、多様な実験セットアップに適用可能である。現在の研究は、単一細胞消化によるEAC PDOの継代培養が、細胞数制御、均一な密度、およびサイズ追跡を容易にする中空構造を必要とするほとんどの実験に適していることを実証した。しかしながら、単一細胞ベースの方法は、培養中および凍結ストックからの再培養後に遅い成長を示す。また、単一細胞消化による継代培養は、中空コアで中空構造を形成することを特徴とする。対照的に、単一細胞消化なしでEAC PDOを処理することは、凍結保存、拡張、および組織学的特徴付けに有利である。このプロトコルでは、単一細胞消化の有無にかかわらずEAC PDOの継代培養および凍結保存の長所と短所が説明されており、研究者はオルガノイドを処理および調査するための適切な方法を選択できます。

概要

食道がん(EC)は、世界のがんによる死亡原因の第10位および第6位^{の死因1位です}。食道腺癌(EAC)は、ECの主要な組織学的サブタイプの1つであり、主に西洋諸国で発生する²。ここ10年間で、EACの発生率はドイツを含む多くの先進国で大幅に増加しています³。がんの攻撃性および腫瘍発生の初期段階における症状の欠如のために、EAC患者の全体的な予後は悪く、約20%の5年生存率を示す²、^4、5。

20世紀後半以来、EACの生物医学研究のためにいくつかのモデルが確立されてきました。1990年代に確立された古典的なヒトEAC細胞株⁶は、EAC腫瘍生物学、腫瘍遺伝学、抗腫瘍戦略に関する知識を拡張し、EAC研究で一般的に使用されています。その上、いくつかの研究グループは、外科的または炎症的アプローチを介して胃食道逆流などの既知の危険因子に動物を曝露することによって、EACまたはバレット食道の動物モデルの開発に成功している^7,8,9。加えて、EAC原発性癌組織を皮下または同所性に免疫不全マウスに生着させる患者由来異種移植片(PDX)モデルが、ヒトEAC腫瘍の生物学的挙動および腫瘍環境をシミュレートするために開発された¹⁰、^11、12。しかし、これらのモデルが臨床応用を改善し、EACの腫瘍形成と進行の背後にある分子メカニズムの理解を向上させているにもかかわらず、これらの研究モデルからヒトに結果を推定することは依然として大きな課題があります。

患者由来の腫瘍オルガノイド(PDO)は、インビトロでヒトの発達および臓器再生を模倣する3D培養系で増殖される。患者の原発組織から生成されるPDOは、ヒト腫瘍の分子的および表現型的特徴を再現し、医薬品開発および個別化がん治療における有望な用途を示している^13,14。EAC PDOの10例を対になった腫瘍組織と比較することにより、EAC PDOは原発腫瘍と同様の組織病理学的特徴およびゲノムランドスケープを共有し、腫瘍内の不均一性を保持し、インビトロでの効率的な薬物スクリーニングを促進することが報告されている¹⁵。EAC PDOは、EAC腫瘍細胞と患者由来の癌関連線維芽細胞(CAF)との相互作用の研究にも使用され、腫瘍微小環境研究の分野における強力な応用を示している¹⁶。残念ながら、EAC PDO の開発と伝達に使用できるプロトコルは限られていました。ここでは、EAC PDOの継代培養と保存について、単一細胞消化の有無にかかわらず、2つの異なる方法を詳細に説明します。EAC PDOとそのアプリケーションのメンテナンスのための標準化された方法は、研究者がEAC PDO研究におけるさまざまな目的に適した方法を選択するのを支援することができます。

プロトコル

確立され、よく成長しているPDO培養は、このプロトコルに記載されている継代培養と凍結保存を成功させるための基礎を表しています。ここで、EAC PDOは、Karakasheva T. A. et al¹⁷によって記載されたプロトコールを用いて、EAC患者の原発性腫瘍組織から生成された。EAC組織は、BioMaSOTA(ケルン大学倫理委員会、ID:13-091によって承認)の承認の下でバイオバンクから収集された。

注:EAC PDOは、PDO培養培地を用いて37°Cおよび5%_CO2の加湿インキュベーター内で培養された(表1)。以下の工程では、継代培養の2つの方法が詳細に説明される。12ウェルプレートは、各ウェルの柔軟な使用と異なる目的のために適切な量のPDOを可能にするため、ウェルあたり3つの細胞外マトリックス(ECM)ゲルドームの播種密度でPDOを再培養するために推奨されます。PDOを取り扱う間は、無菌技術が必須です。

1. 事前の準備

1. 継代培養前に一晩37°CのCO2インキュベーターに入れて₁₂穴プレートを予備加温し、プレートの完全な加温を確実にした。利用可能な場合は、現在のPDO培養物を含むプレートの空のウェルを使用します。
   注:柔軟な継代培養計画には、37°Cで1〜2枚の新鮮なプレートを連続保存することをお勧めします。
2. 1,000 μL および 200 μL チップを -20 °C で広いオリフィスで予冷します (連続保存を推奨)。4°Cで予冷遠心分離機。
3. 回転インキュベーターの温度を37°Cに設定します(単一細胞消化が行われる場合)。
4. 適量のECMゲルを氷上で1時間インキュベートして液化させる。細胞回収溶液を氷の上に置きます。

2. オルガノイドの収穫

1. 成長中のPDOを含むプレートを_CO2インキュベーターから取り外します。
2. 真空ポンプを用いて古い媒体を吸引する。
   メモ: ドームには触れないでください。
3. 適切な量の氷冷細胞回収溶液(500 μL/ドーム)をウェルに加えます。
4. ECMゲルを数回上下にピペッティングして崩壊させ、広いオリフィスを備えた1,000 μLの先端を使用してECMゲルドームを小片に断片化します。
5. 最大2つのウェル(6つのドーム)からPDO、ECMゲル、および細胞回収溶液の混合物を結合し、それを5mLの低結合チューブに移す(継代培養により多くのウェルを使用する場合は、2番目のチューブを使用する)。
   注: オプションで、ECM ゲルが完全に溶解していない場合は、PDO、ECM ゲル、および細胞回収溶液の混合物にさらに 1.5 mL の細胞回収溶液を追加します。
6. ステップ2.5で混合物を含むチューブを氷上で20分間インキュベートし、チューブを5回反転させて5分ごとに混合し、ECMゲルの液化を確実にした。
7. 500 x g で4°Cで4分間遠心分離する。
8. 遠心分離後に目に見える安定したペレットがある場合は、ステップ2.10に進みます。それ以外の場合は、ステップ 2.9 に進みます。
9. 目に見えるペレットがなく、PDOがまだゲル相に詰まっているように見える場合は、ECMゲル-PDO-溶液を含む相に達するまで真空ポンプで上清を慎重に除去し、3mLの氷冷細胞回収溶液を加える。
   1. チューブを数回反転させ、さらに10分間氷上でインキュベートする。チューブを時々反転させて混ぜる。
   2. 500 x g で 4 °C で 4 分間遠心分離し、ステップ 2.10 に進みます。
10. 上清は真空ポンプまたは1,000 μLのピペットを使用して慎重に廃棄してください。上澄み液はできるだけ取り除くようにしてください。
    注:チューブの結合面が低いため、ペレットは通常ほど安定しません。
11. PDOペレットを氷上に保管し、目的に応じてステップ3(消化なし)またはステップ4(単一細胞消化)に進みます。

3. 消化せずに継代培養する

注: この方法は、PDO のサイズと密度を高めることを目的としています。より大きなサイズとより高い密度は、埋め込みプロセス、組織学的特徴付け、およびPDO拡張を容易にする。PDO分割比(PDOの密度に基づいて、1:3〜1:6の比が推奨されます)に応じて、ステップ2.8からのペレットを適切な量の液体ECMゲルに再懸濁する。

1. -20°Cの冷凍庫から、事前に冷却した200 μLと1,000 μLの先端を幅の広いオリフィスで取り出し、クリーンベンチに置きます。
2. ステップ 2.11 のペレットを、予冷した 1,000 μL チップを使用して ECM ゲルに再懸濁します。PDOが凝集しておらず、ECMゲル中に均等に分布していることを確認するために、約10回上下にピペッティングして混合します。
   注: 50 μL の ECM ゲル/ドームを使用してください。常に必要以上に1つのドーム(例えば、9つのドーム(すなわち、3つのウェル)について計算し、ペレットを500μLの液体ECMゲル(450 + 50μL余分な)に再懸濁する。再懸濁中に泡が発生しないようにしてください!
3. ドームを播種する直前に、予め温めた12ウェルプレートをインキュベーターから取り出します。
4. 50μL ECMゲルを含むシードドームを温かいプレート(3つのドーム/ウェル)に入れる。気泡をECMゲルドームにピペッティングしないでください。
5. プレートを37°Cおよび5%_CO2インキュベーターに戻し、ECMゲルを固化させるために20〜30分間インキュベートする。
6. 予め加温したPDO培地(表1)をドームを乱さずに慎重に加える。
7. 必要な密度および形態が生じるまでPDOを7〜14日間培養する。

4. 単一細胞消化による継代培養

注: 次の手順は、ドームあたりの PDO の数を増やすことを目的としています。単一細胞消化は、細胞数制御およびPDO拡大を容易にする。

1. 2 mLの0.25%トリプシン-EDTAと20 μL DNase I(3つのドームの消化用)を混合して消化培地を調製する。
2. ステップ2.11のペレットを、予め加温した0.25%トリプシン-EDTA+DNase Iの適量で再懸濁し、1,000 μLピペット(通常の1,000 μLチップを使用)を使用して上下にピペッティングして約10回混合する。
3. 最低28rpmの回転速度を有する回転インキュベーター中で37°Cで10分間インキュベートする。
4. 6 mLの大豆トリプシン阻害剤(STI、表2)溶液( 0.25%トリプシン-EDTAの2 mLあたり)を含む15 mLチューブを調製する。
5. 消化後、消化したPDOを1,000μLのピペットで数回十分に混合してPDOを破砕します。
6. 消化されたPDOをSTI溶液を含む15mLチューブに移し、消化プロセスを停止する。
7. 500 x g で4°Cで4分間遠心分離する。 上清は真空ポンプまたは1,000 μLのピペットを使用して慎重に廃棄してください。ペレットを1mLの基礎培地に再懸濁する(表3)。
8. 自動細胞カウンターまたは血球計数器を使用して細胞濃度と生存率を決定します。
9. 種子はPDOを1ドームあたり2 x¹⁰⁴ 細胞を有する12ウェルプレートに消化した。
   1. 播種用に計画されたドームに従って細胞数を計算し、それらを新鮮な1.5mL低結合チューブに移す。
      注:さらに1つのドームを計算します(+ 2 x 10⁴セル追加)。たとえば、3つのドームを1つのウェルに播種するには、8 x 104(2 x 10⁴ * 3 + 2 x¹⁰⁴ 余分な)細胞を取ります。
   2. 500 x g で4°Cで4分間遠心分離する。
   3. 目に見えるペレットがない場合は、遠心分離機内のチューブの向きを覚えて、ペレットがどこにあるかを確認してください。
   4. 上清を1,000 μLのピペットを使用して慎重に廃棄します。ペレットを乱すことなく上澄み液をできるだけ取り除く。
   5. 予備冷却された1,000 μL幅のオリフィスチップ(50 μL/ドーム+ 50 μL追加)を備えた1,000 μLピペットを使用して、適切な量のECMゲルをペレットに加えます。
   6. 手順 3.3-3.7 に従います。

5. 消化されたPDOと未消化のPDOの凍結保存

注: 単一細胞消化および未消化の PDO は、凍結バックアップストックの調製に適しています。単一細胞凍結ストックから再培養されたPDOは、回復し、一定のサイズに達するまでに長い時間を必要とすることに注意してください。

1. 未消化のPDOの凍結保存。
   1. ステップ2.8からペレットで凍結保存プロセスを開始します。500 μLの低温凍結培地を使用してペレットを再懸濁し、極低温バイアルに移します。
      注:バイアルごとに2つのドームを保管してください。
   2. 適切な細胞凍結容器を用いてPDOを-80°Cの冷凍庫で一晩凍結する。
2. 単一細胞消化PDOの凍結保存
   1. PDO を収穫して消化した後、ステップ 4.8 から凍結保存を開始します。
   2. 1つの極低温バイアルを保存するために、4〜5 x¹⁰⁵ 個の細胞を新鮮な1.5mL低結合チューブに移す。
      注:3つのドーム/バイアルを保管してください。
   3. 500 x g で4°Cで4分間遠心分離する。 上清を1,000 μLのピペットを用いて慎重に廃棄する。ペレットを乱すことなく上澄み液をできるだけ取り除く。
   4. ペレットを適量の凍結培地(500μL/バイアル)に再懸濁し、極低温バイアルに移す。
   5. 適切な細胞凍結容器を使用してPDOを-80°Cの冷凍庫で一晩凍結し、-150°Cの冷凍庫または液体窒素に移して長期保存する。

結果

このプロトコルは、単一細胞消化の有無にかかわらず、EAC PDOの継代培養および凍結保存を含む手順を提示する。

図1は 、2つの異なる継代培養戦略の代表的な位相差写真を示す。EAC PDOは継代培養に適した密度に達しました(図1、左)。単一細胞消化なしで継代培養すると、同等の密度に達するまでの時間が短縮され、主にコンパ...

ディスカッション

このプロトコルでは、EAC PDOの2つの異なる継代培養および凍結保存方法、すなわち単一細胞消化の有無にかかわらず記載されている。いくつかの研究では、単一細胞消化^15,17によるEAC PDOの継代を推奨しており、これは細胞数制御、均一な密度、およびサイズ追跡を容易にする中空構造を必要とするほとんどの実験にとって有益である。しかしながら...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
-20°C Freezer	Bosch		Economic
-80°C Freezer	Panasonic		MDF DU500VH-PE
Automated Cell counter	Thermo Fisher	AMQAX1000	Countess II
Biological Safety Cabinet Class II	Thermo Scientific	51022482	Herasafe KS12
Centrifuge	Heraeus	75003060	Megafuge 1.0R
CO2 Incubator	Thermo Scientific	50116048	Heracell 150i
Inverted automated fluorescence microscope	Olympus		IX83
Inverted light microscope	Leica		DMIL LED Fluo
Pipette 1000 µL	Eppendorf	3123000063	Research Plus
Pipette 200 µL	Eppendorf	3123000039	Research Plus
Rotating Incubator	Scientific Industries, sc.	SI-1200	Enviro-genie
Shaker	Eppendorf	5355 000.011	Thermomixer Comfort
Vacuum pump	Vacuubrand	20727200	BVC control
Waterbath	Medingen	p2725	W22
Material
15 mL tube	Sarstedt	62.554.502	Inc Screw cap tube PP 15 mL
Cryo vial 2 mL	Sarstedt	72.379	CryoPure 2.0 mL tube
Low bind tube 1.5 mL	Sarstedt	72.706.600	Micro tube 1.5 mL protein LB
Low bind tube 5 mL	Eppendorf	0030 108.302	Protein LoBind Tube 5.0 mL
Pipette tip 200 µL	Starlab	E1011-8000	200 µL Graduated tip, wide orifice
Pipette tip 1000 µL	Starlab	E1011-9000	1000 µL Graduated tip, wide orifice
Pipette tip 1000 µL	Sarstedt	70.3050	Pipette tip 1000 µL
Sterile filter 0.2 µm	Sarstedt	83.1826.001	Filtropur 0.2 µm sterile filter
Tissue culture plate	Sarstedt	83.3921	12 well-plate
Reagent/Chemical
A83-01	Tocris	2939
Advanced DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12634010
Amphotericin B	Thermo Fisher Scientific	15290026
B-27	Thermo Fisher Scientific	17504001
Cell Recovery Solution	Corning	354253
CHIR-99021	MedChemExpress	HY-10182/CS-0181
DNase I grade II, from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	10104159001
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Thermo Fisher Scientific	14190094
Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix	Corning	356231
FGF-10a	Peprotech	100-26-100
Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium	Thermo Fisher Scientific	12648010
Gastrin	Sigma	G9020
Gentamicin-25 (25 mg/ 500 µL)	PromoCell	C-36030
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	15630080
L-Glutamine 200 mM (100X)	Thermo Fisher Scientific	25030024
N-2	Thermo Fisher Scientific	17502-048
N-Acetylcysteine	Sigma	A9165
Nicotinamide	Sigma	N0636-100
Noggin	Peprotech	120-10C-50
Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Recombinant human epidermal growth factor (EGF)	Peprotech	AF-100-15
R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells	Biotechne	3710-001-01
SB202190	MedChemExpress	152121-30-7
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)	Sigma-Aldrich	93620-1G
Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200056
Wnt-3A conditioned medium	Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers' group
Y-27632	Sigma	Y0503