JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تزايد حدوث المبيضات البيضاء المقاومة للأدوية هو قضية صحية خطيرة في جميع أنحاء العالم. قد يوفر العلاج الضوئي الديناميكي المضاد للميكروبات (aPDT) استراتيجية لمكافحة الالتهابات الفطرية المقاومة للأدوية. يصف هذا البروتوكول فعالية aPDT بوساطة البنغال الوردية على سلالة C. albicans المقاومة للأدوية المتعددة في المختبر.

Abstract

عدوى المبيضات البيضاء الغازية هي عدوى فطرية انتهازية كبيرة في البشر لأنها واحدة من أكثر المستعمرين شيوعا للأمعاء والفم والمهبل والجلد. على الرغم من توافر الأدوية المضادة للفطريات ، إلا أن معدل وفيات داء المبيضات الغازي لا يزال ~ 50٪. لسوء الحظ ، فإن حدوث C. albicans المقاوم للأدوية يتزايد على مستوى العالم. قد يوفر العلاج الضوئي الديناميكي المضاد للميكروبات (aPDT) علاجا بديلا أو مساعدا لمنع تكوين الأغشية الحيوية C. albicans والتغلب على مقاومة الأدوية. أظهرت الورود البنغالية (RB) بوساطة aPDT قتل الخلايا الفعالة للبكتيريا و C. albicans. في هذه الدراسة ، يتم وصف فعالية RB-aPDT على C. albicans المقاومة للأدوية المتعددة. تم تصميم مصدر ضوء الصمام الثنائي الباعث للضوء الأخضر (LED) محلي الصنع ليتماشى مع مركز بئر صفيحة 96 بئرا. تم احتضان الخمائر في الآبار بتركيزات مختلفة من RB وأضاءت بتدفقات متفاوتة من الضوء الأخضر. تم تحليل آثار القتل بواسطة طريقة تخفيف اللوحة. مع مزيج مثالي من الضوء و RB ، تم تحقيق تثبيط النمو 3-log. وخلص إلى أن RB-aPDT قد يثبط بكتيريا C. albicans المقاومة للأدوية.

Introduction

C. يستعمر البيض في الجهاز الهضمي والجهاز البولي التناسلي للأفراد الأصحاء ويمكن اكتشافه كميكروبات طبيعية في حوالي 50 في المائة من الأفراد1. إذا تم إنشاء خلل بين المضيف والممرض ، فإن C. albicans قادر على غزو المرض والتسبب فيه. يمكن أن تتراوح العدوى من التهابات الأغشية المخاطية المحلية إلى فشل الأعضاء المتعددة2. في دراسة مراقبة متعددة المراكز في الولايات المتحدة ، حوالي نصف العزلات من المرضى الذين يعانون من داء المبيضات الغازية بين عامي 2009 و 2017 هي C. albicans3. يمكن أن يرتبط المبيضات بارتفاع معدلات المراضة والوفيات والإقامة المطولة في المستشفى4. ذكرت المراكز الأمريكية لمكافحة الأمراض والوقاية منها أن حوالي 7٪ من جميع عينات دم المبيضات التي تم اختبارها مقاومة للدواء المضاد للفطريات فلوكونازول5. يثير ظهور أنواع المبيضات المقاومة للأدوية القلق من تطوير علاج بديل أو مساعد للعوامل المضادة للفطريات.

يتضمن العلاج الضوئي الديناميكي المضاد للميكروبات (aPDT) تنشيط محسس ضوئي معين (PS) بالضوء عند ذروة الامتصاص للطول الموجي ل PS6. بعد الإثارة ، ينقل PS المثير طاقته أو إلكتروناته إلى جزيئات الأكسجين القريبة ويعود إلى الحالة الأرضية. خلال هذه العملية ، يتم تشكيل أنواع الأكسجين التفاعلية والأكسجين الفردي وتسبب تلف الخلايا. وقد استخدمت aPDT على نطاق واسع لقتل الكائنات الحية الدقيقة منذ 1990s7. واحدة من فوائد aPDT هي أن عضيات متعددة تتلف في الخلية بسبب الأكسجين الفردي و / أو أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) أثناء التشعيع. وبالتالي ، لم يتم العثور على مقاومة ل aPDT حتى اليوم. علاوة على ذلك ، ذكرت دراسة حديثة أن البكتيريا التي نجت بعد aPDT أصبحت أكثر حساسية للمضادات الحيوية8.

تشمل مصادر الضوء المستخدمة في aPDT أشعة الليزر ومصابيح الهالوجين المعدنية مع المرشحات والضوء القريب من الأشعة تحت الحمراء والصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) 9،10،11،12. يوفر الليزر طاقة ضوئية عالية ، عادة ما تكون أكبر من 0.5 واط / سم2 ، مما يسمح بتوصيل جرعة خفيفة عالية في وقت قصير جدا. وقد تم استخدامه على نطاق واسع في الحالات التي يكون فيها وقت العلاج الأطول غير مريح مثل aPDT لالتهابات الفم. عيب الليزر هو أن حجم الإضاءة الموضعية صغير ، يتراوح من بضع مئات من الميكرومترات إلى 10 مم مع ناشر. علاوة على ذلك ، فإن معدات الليزر باهظة الثمن وتحتاج إلى تدريب محدد للعمل. من ناحية أخرى ، فإن منطقة التشعيع لمصباح الهالوجين المعدني مع المرشحات أكبر نسبيا13. ومع ذلك ، فإن المصباح ضخم جدا ومكلف. أصبحت مصادر ضوء LED سائدة في aPDT في مجال الأمراض الجلدية لأنها صغيرة وأقل تكلفة. يمكن أن تكون منطقة التشعيع كبيرة نسبيا مع ترتيب مصفوفة من مصباح LED الكهربائي. يمكن إضاءة الوجه بأكمله في نفس الوقت9. ومع ذلك ، فإن معظم ، إن لم يكن كل ، مصادر ضوء LED المتاحة اليوم مصممة للاستخدام السريري. قد لا تكون مناسبة للتجارب في المختبر لأنها تشغل مساحة ومكلفة. قمنا بتطوير مجموعة LED غير مكلفة صغيرة جدا ويمكن قطعها وتجميعها من شريط LED. يمكن تركيب مصابيح LED في ترتيبات مختلفة لتصميمات تجريبية مختلفة. يمكن إكمال ظروف مختلفة من aPDT في لوحة 96 بئر أو حتى لوحة 384 بئر في تجربة واحدة.

روز البنغال (RB) هي صبغة ملونة تستخدم على نطاق واسع لتعزيز تصور أضرار القرنية في عيون الإنسان14. أظهر aPDT بوساطة RB تأثيرات قاتلة على المكورات العنقودية الذهبية والإشريكية القولونية و C. albicans بكفاءة مماثلة تقريبا لتلك الموجودة في Toluidine Blue O15. توضح هذه الدراسة طريقة للتحقق من صحة تأثير RB-aPDT على C. albicans المقاومة للأدوية المتعددة.

Protocol

1. إعداد نظام aPDT

  1. قم بقطع أربعة صمامات ثنائية باعثة للضوء الأخضر (LEDs) من شريط LED (انظر جدول المواد) ومحاذاتها مع أربعة آبار من صفيحة 96 بئرا (الشكل 1).
    ملاحظة: تم ترتيب مصابيح LED في صفيف 4 × 3. تم لصق الجزء الخلفي من LED بالمشتت حراري لتفريق الحرارة أثناء التشعيع.
  2. قم بقياس معدل الطلاقة11 من LED عند 540 نانومتر باستخدام مقياس طاقة الضوء (انظر جدول المواد). انظر الشكل التكميلي 1 للتأكد من أن معدل طلاقة LED يتراوح بين 510-560 نانومتر.
  3. ضع مروحة كهربائية بجانب اللوحة أثناء التشعيع للحفاظ على درجة حرارة ثابتة (25 ± 1 درجة مئوية)11. انظر الشكل التكميلي 2 لضمان الحفاظ على درجة الحرارة الثابتة للوسط أثناء التشعيع.

2. زراعة شكل الخميرة من C. albicans

ملاحظة: يستخدم C. albicans المقاوم للأدوية المتعددة (BCRC 21538 / ATCC 10231) ، المقاوم لمعظم مضادات الفطريات ، بما في ذلك الفلوكونازول ، للتجارب16.

  1. تحديد حساسية الدواء المضاد للفطريات باستخدام طريقة نشر القرص بعد التقرير17 المنشور سابقا.
  2. تنمو C. albicans في أشكال الخميرة ، hyphae ، و pseudohyphae اعتمادا على البيئات البيئية الدقيقة18.
    ملاحظة: من الصعب إجراء حساب دقيق لأشكال hyphae و pseudohyphae. يمكن حساب شكل الخميرة بدقة تحت المجهر أو باستخدام قياس التدفق الخلوي. تحدد درجة الحرارة أثناء نمو الخلية مورفولوجيتها المورفولوجية. في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) ، تكون جميع الخلايا تقريبا على شكل خميرة. لم تؤثر حضانة قصيرة لمدة 4 ساعات من C. albicans عند 30 درجة مئوية على مورفولوجيا الخميرة.

3. aPDT على العوالق C. البيض

  1. اعزل مستعمرة واحدة من C. albicans من صفيحة أجار ذات حلقة معقمة وأضفها إلى وسط مستخلص الخميرة 3 مل من سكر العنب الببتون (YPD) (انظر جدول المواد) في أنبوب زجاجي معقم.
    1. احتضان الأنبوب عند 25 ± 1 درجة مئوية بين عشية وضحاها (14-16 ساعة) في حاضنة بسرعة دوران تبلغ 155 دورة في الدقيقة لتوسيع C. albicans والحفاظ على الفطريات في شكل خميرة لتحديد كمي دقيق.
  2. قم بتخفيف الثقافة بين عشية وضحاها بقيمة متوسطة إلى OD600 تبلغ حوالي 0.5 عند 30 درجة مئوية وتدور بسرعة 155 دورة في الدقيقة لمدة 4 ساعات لتحقيق مرحلة نمو سجل C. albicans.
  3. قم بتخفيف ثقافة مرحلة السجل مرة أخرى باستخدام وسيط YPD الطازج إلى قيمة OD600 البالغة 0.65 (حوالي 1 × 107 وحدات تشكيل مستعمرة ، CFU / mL). تأكد من التركيز النهائي عن طريق طريقة التخفيف التسلسلي على لوحة أجار8.
  4. تحضير محلول مخزون (4٪) من البنغال الوردي (RB) عن طريق إذابة المسحوق في 1x PBS. قم بتصفيته وتعقيمه بفلتر 0.22 ميكرومتر وتخزينه عند 4 درجات مئوية في الظلام. تركيز العمل النهائي ل RB هو 0.2٪.
  5. أضف 111 ميكرولتر من 2٪ RB إلى 1 مل من الطور المنطقي C. albicans في أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 مل والاستزراع المشترك في نقاط زمنية مختلفة (0 و 15 و 30 دقيقة) في درجة حرارة الغرفة لفهم امتصاص RB في الخلايا (الشكل 2).
  6. اغسل الثقافة المشتركة ثلاث مرات باستخدام 1 مل من 1x PBS مع الطرد المركزي عند 16,100 × g لمدة 2.5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يحتوي aPDT على أربعة شروط مختلفة: التحكم المطلق (لا يوجد تعرض للضوء ، لا RB) ، التحكم في الظلام (لا يوجد ضوء ولكن يحتضن مع RB) ، التحكم في الضوء (يتعرض للضوء بدون RB) ، aPDT (يعرض للضوء في وجود RB).
  7. إعادة تعليق C. albicans في 1 مل من 1x PBS وتخصيصها في ثلاثة آبار مختلفة في لوحة بئر 96 لكل حالة. قم بمحاذاة الآبار مع صفيف LED بعد الغسيل.
  8. في المجموعات المكشوفة للضوء، قم بتشغيل المروحة الكهربائية والضوء.
    ملاحظة: يمكن تحقيق طلاقة مختلفة (J / cm2) عن طريق تعريض الآبار لفترات زمنية مختلفة. على سبيل المثال ، يصل التعرض للضوء لمدة 16.7 دقيقة إلى 10 J / cm 2 مع مصباح LED 10 mW / cm2.
  9. بعد التشعيع ، أضف 20 ميكرولتر من محلول الاستزراع المشترك من بئر واحد إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل يحتوي على 180 ميكرولتر من 1x PBS لإعداد تخفيف 10x. علاوة على ذلك ، تمييع عشر مرات ، في وقت لاحق باتباع نفس الطريقة.
  10. أسقط ثلاث قطرات من 20 ميكرولتر من كل تخفيف تسلسلي على ربع واحد من صفيحة أجار YPD لتحقيق مستعمرات قابلة للعد في اللوحة. احسب CFU/mL عن طريق ضرب المستعمرات بعوامل التخفيف3.

4. التحليل الإحصائي

  1. تحليل البيانات التي تم جمعها باستخدام برنامج الرسوم البيانية والإحصاءات (انظر جدول المواد).
  2. تصوير البيانات بمتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط. قم بإجراء تحليل ANOVA ثنائي الاتجاه للتباين8 لتقييم الفروق المعنوية بين ظروف الاختبار المختلفة.
  3. قم بإجراء اختبارات المقارنة المتعددة في Tukey للمقارنات الزوجية8. لكل علاج مختلف، قم بإجراء ثلاث تجارب مستقلة على الأقل. ضع في اعتبارك قيمة p < 0.05 ذات دلالة إحصائية.

النتائج

ويبين الشكل 1 نظام aPDT المستخدم في هذه الدراسة. نظرا لأن درجات الحرارة المرتفعة قد تسبب موتا كبيرا للخلايا ، يتم تبريد مصفوفة LED بواسطة مروحة كهربائية ، ويتم استخدام مشتت حراري أثناء التشعيع للحفاظ على درجة حرارة ثابتة عند 25 ± 1 درجة مئوية. يمكن خصم تأثير الحرارة. وجود توزيع م...

Discussion

تم الإبلاغ عن نتائج مشجعة للتطبيقات السريرية ل RB-PDT لالتهاب القرنية الفطري مؤخرا19. ذروة امتصاص RB هي 450-650 نانومتر. من الضروري تحديد معدل طلاقة مصدر الضوء لنجاح aPDT. مطلوب طلاقة عالية (عادة >100 J / cm2) لعلاج الخلايا السرطانية ، في حين من المتوقع أن يعالج طلاقة أقل الآفات المصابة<...

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تلقى هذا العمل تمويلا من مركز الطب النانوي التطبيقي بجامعة تشنغ كونغ الوطنية من برنامج مركز أبحاث المناطق المميزة في إطار مشروع براعم التعليم العالي من قبل وزارة التربية والتعليم (MOE) ، ووزارة العلوم والتكنولوجيا ، تايوان [MOST 109-2327-B-006-005] إلى TW Wong. يعترف J.H. Hung بالتمويل المقدم من مستشفى جامعة تشنغ كونغ الوطني ، تايوان [NCKUH-11006018] ، و [MOST 110-2314-B-006-086-MY3].

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microfuge tubeNeptune, San Diego, USA#3745.x
5 mL round-bottom tube with cell strainer capFalcon, USA#352235
96-well plateAlpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan#16196
Aluminum foilsunmei, Tainan, Taiwan
Aluminum heat sinkNanyi electronics Co., Ltd., Tainan, TaiwanBK-T220-0051-01Disperses heat from the LED array.
CentrifugeEppendorf, UK5415R
Graph pad prism softwareGraphPad 8.0, San Diego, California, USAgraphing and statistics software
Green light emitting diode (LED) stripNanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan2835Emission peak wavelength: 525 nm, Viewing angle: 150°; originated from https://www.aliva.com.tw/product.php?id=63
IncubatorYihder, Taipei, TaiwanLM-570D (R)
Light power meterOphir, Jerusalem, IsraelPD300-3W-V1-SENSOR,
Millex 0.22 μm filterMerck, NJ, USASLGVR33RS
Multidrug-resistant Candida albicansBioresource Collection and Research CenterBioresource, Hsinchu, TaiwanBCRC 21538/ATCC 10231http://catalog.bcrc.firdi.org.tw/BcrcContent?bid=21538
OD600 spectrophotometerBiochrom, London, UKUltrospec 10
Rose BengalSigma-Aldrich, MO, USA330000stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C
Sterilized glass tubeSunmei Co., Ltd., Tainan, TaiwanAK45048-16100
Yeast Extract Peptone Dextrose MediumHIMEDIA, IndiaM1363

References

  1. Naglik, J. R., Challacombe, S. J., Hube, B. Candida albicans secreted aspartyl proteinases in virulence and pathogenesis. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (3), 400-428 (2003).
  2. Pappas, P. G., et al. Clinical practice guideline for the management of candidiasis: 2016 update by the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases. 62 (4), 1-50 (2016).
  3. Ricotta, E. E., et al. Invasive candidiasis species distribution and trends, United States, 2009-2017. Journal of Infectious Diseases. 223 (7), 1295-1302 (2021).
  4. Koehler, P., et al. Morbidity and mortality of candidaemia in Europe: an epidemiologic meta-analysis. Clinical Microbiology and Infection. 25 (10), 1200-1212 (2019).
  5. Toda, M., et al. Population-based active surveillance for culture-confirmed candidemia - four sites, United States, 2012-2016. Morbidity and Mortality Weekly Report Surveillance Summaries. 68 (8), 1-15 (2019).
  6. Lee, C. N., Hsu, R., Chen, H., Wong, T. W. Daylight photodynamic therapy: an update. Molecules. 25 (21), 5195 (2020).
  7. Wainwright, M. Photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT). Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 42 (1), 13-28 (1998).
  8. Wong, T. W., et al. Indocyanine green-mediated photodynamic therapy reduces methicillin-resistant staphylococcus aureus drug resistance. Journal of Clinical Medicine. 8 (3), 411 (2019).
  9. Kim, M. M., Darafsheh, A. Light sources and dosimetry techniques for photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 96 (2), 280-294 (2020).
  10. Wong, T. W., Sheu, H. M., Lee, J. Y., Fletcher, R. J. Photodynamic therapy for Bowen's disease (squamous cell carcinoma in situ) of the digit. Dermatologic Surgery. 27 (5), 452-456 (2001).
  11. Wong, T. W., et al. Photodynamic inactivation of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by indocyanine green and near infrared light. Dermatologica Sinica. 36 (1), 8-15 (2018).
  12. Stasko, N., et al. Visible blue light inhibits infection and replication of SARS-CoV-2 at doses that are well-tolerated by human respiratory tissue. Scientific Reports. 11 (1), 20595 (2021).
  13. Crosbie, J., Winser, K., Collins, P. Mapping the light field of the Waldmann PDT 1200 lamp: potential for wide-field low light irradiance aminolevulinic acid photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 76 (2), 204-207 (2002).
  14. Feenstra, R. P., Tseng, S. C. Comparison of fluorescein and rose bengal staining. Ophthalmology. 99 (4), 605-617 (1992).
  15. Demidova, T. N., Hamblin, M. R. Effect of cell-photosensitizer binding and cell density on microbial photoinactivation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (6), 2329-2335 (2005).
  16. Shahid, H., et al. Duclauxin derivatives from fungi and their biological activities. Frontiers in Microbiology. 12, 766440 (2021).
  17. Arendrup, M. C., Park, S., Brown, S., Pfaller, M., Perlin, D. S. Evaluation of CLSI M44-A2 disk diffusion and associated breakpoint testing of caspofungin and micafungin using a well-characterized panel of wild-type and fks hot spot mutant Candida isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (5), 1891-1895 (2011).
  18. Mukaremera, L., Lee, K. K., Mora-Montes, H. M., Gow, N. A. R. Candida albicans yeast, pseudohyphal, and hyphal morphogenesis differentially affects immune recognition. Frontiers in Immunology. 8, 629 (2017).
  19. Hung, J. H., et al. Recent advances in photodynamic therapy against fungal keratitis. Pharmaceutics. 13 (12), 2011 (2021).
  20. Martinez, J. D., et al. Rose Bengal photodynamic antimicrobial therapy: a pilot safety study. Cornea. 40 (8), 1036-1043 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

181

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved