Candida albicans'ı İnhibe Etmek için Gül Bengal Aracılı Fotodinamik Terapi

Özet

İlaca dirençli Candida albicans'ın artan insidansı dünya çapında ciddi bir sağlık sorunudur. Antimikrobiyal fotodinamik tedavi (aPDT), ilaca dirençli mantar enfeksiyonlarına karşı savaşmak için bir strateji sunabilir. Bu protokol, in vitro olarak çoklu ilaca dirençli C. albicans suşu üzerinde Gül bengal aracılı aPDT etkinliğini tanımlamaktadır.

Özet

İnvaziv Candida albicans enfeksiyonu, insanlarda önemli bir fırsatçı mantar enfeksiyonudur, çünkü bağırsak, ağız, vajina ve cildin en yaygın kolonizatörlerinden biridir. Antifungal ilaçların mevcudiyetine rağmen, invaziv kandidiyazisin mortalite oranı ~% 50 oranında kalmaktadır. Ne yazık ki, ilaca dirençli C. albicans insidansı küresel olarak artmaktadır. Antimikrobiyal fotodinamik tedavi (aPDT), C. albicans biyofilm oluşumunu inhibe etmek ve ilaç direncinin üstesinden gelmek için alternatif veya adjuvan bir tedavi sunabilir. Gül bengal (RB) aracılı aPDT, bakteri ve C. albicans'ın etkili hücre öldürmesini göstermiştir. Bu çalışmada, RB-aPDT'nin çoklu ilaca dirençli C. albicans üzerindeki etkinliği tanımlanmıştır. Ev yapımı yeşil ışık yayan diyot (LED) ışık kaynağı, 96 delikli bir plakanın kuyusunun ortasına hizalanacak şekilde tasarlanmıştır. Mayalar, farklı RB konsantrasyonlarına sahip kuyucuklarda inkübe edildi ve değişen yeşil ışık akıcılıkları ile aydınlatıldı. Öldürme etkileri plaka seyreltme yöntemi ile analiz edildi. Optimal bir ışık ve RB kombinasyonu ile 3 log büyüme inhibisyonu sağlandı. RB-aPDT'nin ilaca dirençli C. albicans'ı potansiyel olarak inhibe edebileceği sonucuna varılmıştır.

Giriş

C. albicans , sağlıklı bireylerin gastrointestinal ve genitoüriner yollarında kolonize olur ve bireylerin yaklaşık yüzde 50'sinde normal mikrobiyota olarak tespit edilebilir¹. Konakçı ve patojen arasında bir dengesizlik yaratılırsa, C. albicans istila edebilir ve hastalığa neden olabilir. Enfeksiyon lokal mukoza zarı enfeksiyonlarından çoklu organ yetmezliğine kadar değişebilir². ABD'de yapılan çok merkezli bir sürveyans çalışmasında, 2009 ve 2017 yılları arasında invaziv kandidiyazisli hastalardan alınan izolatların yaklaşık yarısı C. albicans^3'tür. Kandidemi yüksek morbidite oranları, mortalite, hastanede kalış süresinin uzaması ile ilişkili olabilir⁴. ABD Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri, test edilen tüm Candida kan örneklerinin yaklaşık% 7'sinin antifungal ilaç flukonazol^5'e dirençli olduğunu bildirmiştir. İlaca dirençli Candida türlerinin ortaya çıkması, antimikotik ajanlara alternatif veya adjuvan bir tedavi geliştirme endişesini artırmaktadır.

Antimikrobiyal fotodinamik tedavi (aPDT), PS^6'nın tepe absorpsiyon dalga boyunda ışıkla spesifik bir fotosensitizörün (PS) aktive edilmesini içerir. Uyarmadan sonra, uyarılmış PS enerjisini veya elektronlarını yakındaki oksijen moleküllerine aktarır ve zemin durumuna geri döner. Bu işlem sırasında reaktif oksijen türleri ve singlet oksijen oluşur ve hücre hasarına neden olur. aPDT, 1990'lardan beri mikroorganizmaları öldürmek için yaygın olarak kullanılmaktadır⁷. aPDT'nin faydalarından biri, ışınlama sırasında çoklu organellerin bir hücrede singlet oksijen ve / veya reaktif oksijen türleri (ROS) tarafından hasar görmesidir; bu nedenle aPDT'ye karşı direnç bugüne kadar bulunamamıştır. Ayrıca, yakın tarihli bir çalışma, aPDT'den sonra hayatta kalan bakterilerin antibiyotiklere karşı daha duyarlı hale geldiğini bildirmiştir⁸.

aPDT'de kullanılan ışık kaynakları arasında lazerler, filtreli metal halojen lambalar, yakın kızılötesi ışık ve ışık yayan diyot (LED)9,10,11,12 bulunur. Lazer, genellikle 0,5 W /^cm2'den daha büyük olan ve çok kısa sürede yüksek ışık dozunun verilmesine izin veren yüksek ışık gücü sağlar. Oral enfeksiyonlar için aPDT gibi daha uzun bir tedavi süresinin sakıncalı olduğu durumlarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Bir lazerin dezavantajı, spot aydınlatma boyutunun birkaç yüz mikrometreden bir difüzörle 10 mm'ye kadar değişen küçük olmasıdır. Dahası, lazer ekipmanı pahalıdır ve çalışması için özel eğitime ihtiyaç duyar. Öte yandan, filtreli metal bir halojen lambanın ışınlama alanı nispeten daha büyüktür¹³. Ancak, lamba çok ağır ve pahalıdır. LED ışık kaynakları, dermatolojik alanda aPDT'nin ana akımı haline gelmiştir, çünkü küçük ve daha ucuzdur. Işınlama alanı, LED ampulün bir dizi düzenlemesi ile nispeten büyük olabilir. Tüm yüz aynı anda aydınlatılabilir⁹. Bununla birlikte, bugün mevcut olan LED ışık kaynaklarının hepsi olmasa da çoğu klinik kullanım için tasarlanmıştır. Bir laboratuvardaki deneyler için uygun olmayabilir, çünkü yer kaplayan ve pahalıdır. Çok küçük ve bir LED şeritten kesilip monte edilebilen ucuz bir LED dizisi geliştirdik. LED'ler farklı deneysel tasarımlar için farklı düzenlemelere takılabilir. Bir deneyde 96 delikli bir plakada veya hatta 384 delikli bir plakada farklı aPDT koşulları tamamlanabilir.

Gül bengal (RB), insan gözlerinde kornea hasarlarının görselleştirilmesini arttırmak için yaygın olarak kullanılan renkli bir boyadır¹⁴. RB aracılı aPDT, Staphylococcus aureus, Escherichia coli ve C. albicans üzerinde, Toluidin mavisi O^15'inkiyle kabaca karşılaştırılabilir verimlilikte öldürücü etkiler göstermiştir. Bu çalışma, RB-aPDT'nin çoklu ilaca dirençli C. albicans üzerindeki etkisini doğrulamak için bir yöntem göstermektedir.

Protokol

1. aPDT sistem hazırlığı

1. Bir LED şeritten dört yeşil ışık yayan diyotu (LED'ler) kesin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve bunları 96 delikli bir plakanın dört kuyucuğuyla hizalayın (Şekil 1).
   NOT: LED'ler 4 x 3'lük bir dizi halinde düzenlenmiştir. LED'in arkası, ışınlama sırasında ısıyı dağıtmak için bir ısı emiciye yapıştırıldı.
2. LED'in akıcılık hızı^11'i bir ışık gücü ölçerle 540 nm'de ölçün (bkz. LED'in akıcılık hızının 510-560 nm arasında olduğundan emin olmak için Ek Şekil 1'e bakınız.
3. Sabit sıcaklığı (25 ± 1 °C)¹¹ korumak için ışınlama sırasında plakanın yanına elektrikli bir fan yerleştirin. Işınlama sırasında ortamın sabit sıcaklığının korunmasını sağlamak için Ek Şekil 2'ye bakınız.

2. C. albicans'ın maya formunun kültürlenmesi

NOT: Deneyler için flukonazol de dahil olmak üzere çoğu antifungale dirençli çoklu ilaca dirençli bir C. albicans (BCRC 21538 / ATCC 10231) kullanılmıştır¹⁶.

1. Antimikotik ilaç duyarlılığını daha önce yayınlanmış rapor^17'yi takiben disk difüzyon yöntemi ile belirlemek.
2. Mikro-ekolojik ortamlara bağlı olarak maya, hifaj ve psödohifa formlarında C. albicans yetiştirin¹⁸.
   NOT: Hifa ve psödohifa formları doğru bir hesaplama için zordur. Maya formu mikroskop altında veya akış sitometrisi ile hassas bir şekilde hesaplanabilir. Hücre büyümesi sırasındaki sıcaklık, morfolojisini belirler. Oda sıcaklığında (25 ° C), neredeyse tüm hücreler maya formundadır. C. albicans'ın 30 °C'de 4 saatlik kısa bir inkübasyonu, maya morfolojisini etkilemedi.

3. Planktonik C. albicans üzerinde aPDT

1. Tek bir C. albicans kolonisini steril bir döngü ile bir agar plakasından izole edin ve sterilize edilmiş bir cam tüp içinde 3 mL maya özü pepton dekstroz (YPD) ortamına ekleyin (bkz.
   1. C. albicans'ı genişletmek ve mantarı doğru niceleme için maya formunda tutmak için tüpü 155 rpm dönme hızına sahip bir inkübatörde gece boyunca 25 ± 1 ° C'de (14-16 saat) inkübe edin.
2. Gece kültürünü, 30 ° C'de yaklaşık_{0,5 OD 600} değerine kadar orta ila bir OD 600 değeri ile seyreltin ve C. albicans'ın kütük büyüme fazını elde etmek için 4 saat boyunca 155 rpm hızında döndürün.
3. Log fazı kültürünü tekrar taze YPD ortamı ile 0,65 OD₆₀₀ değerine kadar seyreltin (yaklaşık 1 x 10⁷ koloni oluşturan birim, CFU / mL). Son konsantrasyonu bir agar plakası⁸ üzerinde seri seyreltme yöntemiyle onaylayın.
4. Tozu 1x PBS'de çözerek bir Rose bengal (RB) stok çözeltisi (% 4) hazırlayın. 0,22 μm'lik bir filtre ile filtreleyip sterilize edin ve karanlıkta 4 °C'de saklayın. RB'nin son çalışma konsantrasyonu% 0.2'dir.
5. RB'nin hücrelerdeki emilimini anlamak için oda sıcaklığında 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne ve farklı zaman noktalarında (0, 15 ve 30 dakika) ko-kültüre 111 mL'lik log faz C. albicans'a 111 μL% 2 RB ekleyin (Şekil 2).
6. Ko-kültürü, oda sıcaklığında 2,5 dakika boyunca 16.100 x g'de santrifüjleme ile 1 mL 1x PBS ile üç kez yıkayın.
   NOT: aPDT dört farklı koşul içerir: mutlak kontrol (ışığa maruz kalma yok, RB yok), karanlık kontrol (ışık yok ancak RB ile inkübe ediyor), ışık kontrolü (RB olmadan ışığa maruz kalıyor), aPDT (RB varlığında ışığa maruz kalıyor).
7. C. albicans'ı 1 mL'lik 1x PBS'de yeniden askıya alın ve her koşul için 96 kuyu plakasında üç farklı kuyuya ayırın. Yıkadıktan sonra kuyucukları LED dizisi ile hizalayın.
8. Işığa maruz kalan gruplarda, elektrikli fanı ve ışığı açın.
   NOT: Kuyucukların değişen zaman periyotlarına maruz bırakılmasıyla farklı bir akıcılık (J/^cm2) elde edilebilir. Örneğin, 16,7 dakikalık bir ışık pozlaması, 10 mW / cm2 LED ampulle 10 J /^cm2'ye gelir.
9. Işınlamadan sonra, 10x seyreltme hazırlamak için 180 μL 1x PBS içeren 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne bir kuyucuktan 20 μL ko-kültür çözeltisi ekleyin. Ayrıca, daha sonra aynı yöntemi izleyerek on kez seyreltin.
10. Plakanın sayılabilir kolonilerini elde etmek için her seri seyreltmenin üç damlasını bir YPD agar plakasının bir çeyreğine 20 μL'lik damlatın. CFU / mL'yi, kolonileri seyreltme faktörleri³ ile çarparak hesaplayın.

4. İstatistiksel analiz

1. Toplanan verileri bir grafik ve istatistik yazılımı kullanarak analiz edin (bkz.
2. Verileri ortalamaya ± ortalamanın standart hatasına göre gösterin. Farklı test koşulları arasındaki önemli farklılıkları değerlendirmek için varyans^8'in iki yönlü ANOVA analizini gerçekleştirin.
3. İkili karşılaştırmalar için Tukey'in çoklu karşılaştırma testlerini gerçekleştirin⁸. Her farklı tedavi için en az üç bağımsız deney yapın. P değerinin 0,05 < istatistiksel olarak anlamlı olduğunu düşünün.

Sonuçlar

Şekil 1'de bu çalışmada kullanılan aPDT sistemi görülmektedir. Yüksek sıcaklıklar önemli hücre ölümüne neden olabileceğinden, LED dizisi bir elektrikli fan tarafından soğutulur ve ışınlama sırasında 25 ± 1 ° C'de sabit bir sıcaklığı korumak için bir ısı emici kullanılır. Isı etkisi azaltılabilir. Eşit bir ışık dağılımına sahip olmak da başarılı bir aPDT için önemli bir belirleyici faktördür; bu nedenle, aydınlatma sırasında LED ampulün ...

Tartışmalar

RB-PDT'nin fungal keratit için klinik uygulamalarının cesaret verici sonuçları son zamanlarda bildirilmiştir¹⁹. RB'nin absorpsiyon zirvesi 450-650 nm'dir. Başarılı bir aPDT için ışık kaynağının akıcılık oranını belirlemek esastır. Kanser hücrelerini tedavi etmek için yüksek bir fluans (genellikle >100 J /^cm2) gerekirken, enfekte lezyonları tedavi etmek için daha düşük bir fluans beklenmektedir⁶. Yüksek akıcılık, klinik bir ortamd...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microfuge tube	Neptune, San Diego, USA	#3745.x
5 mL round-bottom tube with cell strainer cap	Falcon, USA	#352235
96-well plate	Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan	#16196
Aluminum foil	sunmei, Tainan, Taiwan
Aluminum heat sink	Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan	BK-T220-0051-01	Disperses heat from the LED array.
Centrifuge	Eppendorf, UK	5415R
Graph pad prism software	GraphPad 8.0, San Diego, California, USA		graphing and statistics software
Green light emitting diode (LED) strip	Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan	2835	Emission peak wavelength: 525 nm, Viewing angle: 150°; originated from https://www.aliva.com.tw/product.php?id=63
Incubator	Yihder, Taipei, Taiwan	LM-570D (R)
Light power meter	Ophir, Jerusalem, Israel	PD300-3W-V1-SENSOR,
Millex 0.22 μm filter	Merck, NJ, USA	SLGVR33RS
Multidrug-resistant Candida albicans	Bioresource Collection and Research CenterBioresource, Hsinchu, Taiwan	BCRC 21538/ATCC 10231	http://catalog.bcrc.firdi.org.tw/BcrcContent?bid=21538
OD600 spectrophotometer	Biochrom, London, UK	Ultrospec 10
Rose Bengal	Sigma-Aldrich, MO, USA	330000	stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C
Sterilized glass tube	Sunmei Co., Ltd., Tainan, Taiwan	AK45048-16100
Yeast Extract Peptone Dextrose Medium	HIMEDIA, India	M1363