Gráfico automatizado do espaço visual dos olhos compostos housefly

Resumo

O protocolo aqui descreve a medição da organização espacial dos eixos visuais dos olhos de mosca-da-casa, mapeados por um dispositivo automático, utilizando o fenômeno pseudopupil e o mecanismo pupilar das células fotorreceptoras.

Resumo

Este artigo descreve a medição automática da organização espacial dos eixos visuais dos olhos compostos de insetos, que consistem em milhares de unidades visuais chamadas ommatidia. Cada ommatidium amostra as informações ópticas de um pequeno ângulo sólido, com uma sensibilidade distribuída gaussiana aproximada (meia largura na ordem de 1°) centrada em torno de um eixo visual. Juntas, a ommatidia reúne as informações visuais de um campo de visão quase panorâmico. A distribuição espacial dos eixos visuais determina assim a resolução espacial do olho. O conhecimento da organização óptica de um olho composto e sua acuidade visual é crucial para estudos quantitativos de processamento neural das informações visuais. Aqui apresentamos um procedimento automatizado para mapear os eixos visuais de um olho composto, utilizando um fenômeno óptico intrínseco, in vivo , o pseudopupil, e o mecanismo pupilar das células fotorreceptoras. Delineamos a configuração opomecanical para a varredura dos olhos dos insetos e usamos resultados experimentais obtidos de uma mosca doméstica, Musca domestica, para ilustrar as etapas do procedimento de medição.

Introdução

A compactação dos sistemas visuais de insetos e a agilidade de seus proprietários, demonstrando o processamento de informações visuais altamente desenvolvidos, têm intrigado pessoas de origens científicas e não científicas. Os olhos compostos de insetos foram reconhecidos como poderosos dispositivos ópticos que permitem capacidades visuais agudas e versáteis ^1,2. As moscas, por exemplo, são bem conhecidas por suas respostas rápidas a objetos em movimento, e as abelhas são famosas por possuir visão colorida e visão de polarização².

Os olhos compostos de artrópodes consistem de numerosas unidades anatomicamente semelhantes, a ommatidia, cada uma das quais é tampada por uma lente faceta. Em Diptera (moscas), o conjunto de lentes de faceta, conhecidas coletivamente como córnea, muitas vezes se aproxima de um hemisfério. Cada ommatidium amostra luz incidente de um pequeno ângulo sólido com meia largura na ordem de 1°. A ommatidia dos dois olhos juntos amostra aproximadamente o ângulo sólido completo, mas os eixos visuais da ommatidia não são distribuídos uniformemente. Certas áreas oculares têm uma alta densidade de eixos visuais, o que cria uma região de alta acuidade espacial, coloquialmente chamada de fovea. A parte restante do olho tem então uma resolução espacial mais grosseira 3,4,5,6,7,8,9.

Uma análise quantitativa da organização óptica dos olhos compostos é crucial para estudos detalhados do processamento neural de informações visuais. Estudos das redes neurais do cérebro de um inseto¹⁰ muitas vezes requerem conhecimento da distribuição espacial dos eixos ommatidiais. Além disso, os olhos compostos inspiraram várias inovações técnicas. Muitas iniciativas para produzir olhos artificiais bioins inspirados foram construídas em estudos quantitativos existentes de olhos compostos reais 11,12,13. Por exemplo, um sensor baseado em semicondutores com alta resolução espacial foi projetado com base no modelo de olhos compostos de^insetos 11,14,15,16,17. No entanto, os dispositivos desenvolvidos até agora não implementaram as características reais dos olhos de insetos existentes. Representações precisas de olhos compostos de insetos e sua organização espacial exigirão dados detalhados e confiáveis de olhos naturais, o que não está amplamente disponível.

A principal razão para a escassez de dados é o extremo tedioso dos procedimentos disponíveis para mapear as características espaciais dos olhos. Isso motivou tentativas de estabelecer um procedimento de mapeamento ocular mais automatizado. Em uma primeira tentativa de análises automatizadas de olhos compostos de insetos, Douglass e Wehling¹⁸ desenvolveram um procedimento de varredura para mapear tamanhos de facetas na córnea e demonstraram sua viabilidade para algumas espécies de moscas. Aqui ampliamos sua abordagem desenvolvendo métodos para não apenas escanear as facetas da córnea, mas também avaliar os eixos visuais da ommatidia a que as facetas pertencem. Apresentamos o caso dos olhos de mosca-da-casa para exemplificar os procedimentos envolvidos.

A configuração experimental para a varredura dos olhos dos insetos é: parcialmente óptica, ou seja, um microscópio com câmera e óptica de iluminação; em parte mecânico, ou seja, um sistema de goniômetro para rotação do inseto investigado; e parcialmente computacional, ou seja, uso de drivers de software para os instrumentos e programas para execução de medições e análises. Os métodos desenvolvidos abrangem uma série de procedimentos computacionais, desde capturar imagens, escolher canais de câmera e definir limiares de processamento de imagens até reconhecer locais de facetas individuais através de pontos brilhantes de luz refletidos de suas superfícies convexas. Os métodos de transformação de Fourier foram cruciais na análise de imagens, tanto para a detecção de facetas individuais quanto para a análise dos padrões de facetas.

O papel está estruturado da seguinte forma. Primeiro introduzimos a configuração experimental e o fenômeno pseudopupil - o marcador óptico usado para identificar os eixos visuais dos fotorreceptores em olhos vivos 19,20,21. Posteriormente, os algoritmos utilizados no procedimento de digitalização e análise de imagem são descritos.

Protocolo

O protocolo está de acordo com as diretrizes de cuidados com insetos da Universidade.

1. Preparação de uma mosca doméstica, Musca domestica

1. Recolhe a mosca da população criada em laboratório. Coloque a mosca no suporte de latão (Figura 1).
   1. Corte 6 mm da parte superior do tubo de contenção (ver Tabela de Materiais). A nova parte superior do tubo tem diâmetro externo de 4 mm e diâmetro interno de 2,5 mm (Figura 1A). Coloque a mosca viva dentro do tubo, sele o tubo com algodão para evitar danificar a mosca, e empurre a mosca de tal forma que a cabeça se projeta do tubo e seu corpo seja contido (Figura 1B). Imobilize a cabeça com cera de abelha de tal forma que os olhos permaneçam descobertos (Figura 1C-E).
   2. Corte novamente o tubo de tal forma que o comprimento do tubo seja de 10 mm (Figura 1C). Coloque o tubo de plástico com a mosca no suporte de latão, de modo que um olho da mosca esteja apontando para cima quando o suporte estiver descansando sobre uma mesa (Figura 1D,E).
2. Ajuste a orientação do tubo de tal forma que com a elevação do goniômetro em 0° (ou seja, o estágio azimute esteja em uma posição horizontal), o feixe de iluminação vertical do microscópio é perpendicular à superfície do olho em uma região central, entre ventral e dorsal, e entre bordas anteriores e posteriores do olho, para que todo o olho possa ser escaneado dentro da faixa de azimuth e elevação permitida pela configuração.

2. Alinhamento do eixo azimute rotativo do goniômetro com o eixo óptico do microscópio

1. Monte um pino de alinhamento no estágio de rotação do azimute para que a posição x-y da ponta possa ser ajustada para coincidir com o eixo azimute no palco motorizado. Ao visualizar com o microscópio, equipado com um objetivo de 5x, foque na ponta usando o joystick do eixo Z (Figura 2).
2. Alinhe o ajuste x-y do eixo azimuth com o eixo óptico do microscópio e garanta que os eixos rotativos de elevação e azimute estejam pré-alinhados com o pino centralado, usando os joysticks x e y-axis.
3. Manipule os joysticks de azimute e elevação para verificar se o pino está centrado em relação a ambos os graus de liberdade. Quando bem centrada, a ponta do pino permanece, aproximadamente, na mesma posição durante as rotações de azimute e elevação.

3. Alinhamento do olho voador com os estágios motorizados

1. Com o estágio de elevação em 0°, monte a mosca e seu suporte no estágio azimuth. Observe o olho da mosca com o microscópio.
2. Com o LED de iluminação ligado, ajuste a posição horizontal da mosca para que o centro do pseudopupil esteja alinhado com o microscópio. Ajuste a posição vertical da mosca usando o parafuso rotativo do suporte (Figura 1D), de modo que o pseudopupil profundo (DPP; Figura 3) 19,20,21 é colocado em foco no nível do eixo de elevação.
3. Alinhe o DPP em relação aos eixos de azimute e elevação centralizando-o no campo de visão (ver Figura 2). Use os ímãs colados na parte inferior do suporte de mosca para afixá-lo firmemente a uma placa de ferro montada no estágio azimute, permitindo ajustes manuais de deslizamento.
   1. Mude a visão para a câmera digital montada no microscópio. Execute a inicialização do software do sistema GRACE, que inclui a inicialização dos controladores do motor e o controlador LED Arduino (Figura 4). Portanto, abra MATLAB R2020a ou versão superior. Execute o Initialize_All_Systems de script MATLAB (Arquivo Complementar 1).
4. Confirme se o pseudopupil da mosca (Figura 3B,C) está no centro da imagem projetada na tela do computador.

4. Foco automático e autocentroamento

1. Leve o foco ao nível do pseudopupil da córnea (CPP; Figura 3B) 19,20,21 manualmente usando o joystick do eixo z.
2. Execute o algoritmo de autofoco (Arquivo Suplementar 1, script AF) para obter uma imagem nítida no nível da córnea. Verifique retornando o foco ao nível DPP ajustando o estágio motorizado do eixo z. Armazene a distância entre o DPP e o CPP (em etapas do motor).
3. Ajuste a sintonia do centro pseudopupil executando o algoritmo de autocentering (Arquivo Suplementar 1, script AC). Leve o foco de volta ao nível CPP.
4. Re-executar o algoritmo de autofoco. Zero os estágios motorizados em suas posições atuais (X,Y, Z,E,A) = (0,0,0,0,0), onde E é elevação e A é azimute.
5. Execute o algoritmo de digitalização (Arquivo Suplementar 1, script Scan_Begin), que amostra imagens oculares ao longo de trajetórias em etapas de 5°, enquanto executa os algoritmos de autocentro e autofoco.
6. Ao final da amostragem, desligue o controlador led e os controladores do motor.
7. Processe as imagens aplicando os algoritmos de processamento de imagem (Arquivo Suplementar 1, script ImProcFacets).

Resultados

Animais e estimulação óptica
Experimentos são realizados em moscas-da-casa (Musca domestica) obtidos a partir de uma cultura mantida pelo Departamento de Genética Evolutiva da Universidade de Groningen. Antes das medições, uma mosca é imobilizada colando-a com uma cera de ponto de fusão baixa em um tubo bem ajustado. A mosca é subsequentemente montada no palco de um goniômetro motorizado. O centro dos dois estágios rotativos coincide com o ponto focal de uma configuração microsc...

Discussão

A distribuição espacial dos eixos visuais dos olhos de mosca-da-casa pode ser mapeada usando o fenômeno pseudopupil de olhos compostos e as mudanças de reflexão causadas pelo mecanismo pupilar dependente da luz. Portanto, uma mosca investigada é montada em um sistema goniométrico, que permite a inspeção do padrão de facet local com uma configuração de microscópio equipada com uma câmera digital, tudo sob controle de computador. A análise da imagem produz mapas oculares. Uma dificuldade essencial encontrada...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digital Camera	PointGrey	BFLY-U3-23S6C-C	Acquision of amplified images and digital communication with PC
High power star LED	Velleman	LH3WW	Light source for observation and imaging the compound eye
Holder for the investigated fly	University of Groningen		Different designs were manufactured by the university workshop
Linear motor	ELERO	ELERO Junior 1, version C	Actuates the upper microscope up and down. (Load 300N, Stroke speed 15mm/s, nominal current 1.2A)
Low temperature melting wax	various		The low-temperature melting point wax serves to immobilize the fly and fix it to the holder
Microscope	Zeiss		Any alternative microscope brand will do; the preferred objective is a 5x
Motor and LED Controller	University of Groningen	Z-o1	Designed and built by the University of Groningen and based on Arduino and Adafruit technologies.
Motorized Stage	Standa (Vilnius, Lithuania)	8MT175-50XYZ-8MR191-28	A 6 axis motorized stage modified to have 5 degrees of freedom.
Optical components	LINUS		Several diagrams and lenses forming an epi-illumination system (see Stavenga, Journal of Experimental Biology 205, 1077-1085, 2002)
PC running MATLAB	University of Groningen		The PC is able to process the images of the PointGrey camera, control the LED intensity, and send control commants to the motor cotrollers of the system
Power Supply (36V, 3.34A)	Standa (Vilnius, Lithuania)	PUP120-17	Dedicated power supply for the STANDA motor controllers
Soldering iron	various		Used for melting the wax
Stepper and DC Motor Controller	Standa (Vilnius, Lithuania)	8SMC4-USB-B9-B9	Dedicated controllers for the STANDA motorized stage capable of communicating with MATLAB
Finntip-61	Finnpipette Ky, Helsinki	FINNTIP-61, 200-1000μL	PIPETTE TIPS FOR FINNPIPETTES, 400/BOX. It is used to restrain the fly
Carving Pen Shaping/Thread Burning Tool	Max Wax		The tip of the carving pen is designed to transfer wax to the head of fly
MATLAB	Mathworks, Natick, MA, USA	main program plus Image Acquisition, Image Analysis, and Instrument Control toolboxes.	Programming language used to implement the algorithms