Fabricación de chip micropatrón con espesor controlado para microscopía electrónica criogénica de alto rendimiento

Resumen

Un chip micropatronado recientemente desarrollado con ventanas de óxido de grafeno se fabrica mediante la aplicación de técnicas de sistemas microelectromecánicos, lo que permite obtener imágenes de microscopía electrónica criogénica eficiente y de alto rendimiento de varias biomoléculas y nanomateriales.

Resumen

Una limitación importante para el análisis eficiente y de alto rendimiento de la estructura de biomoléculas utilizando microscopía electrónica criogénica (crio-EM) es la dificultad de preparar muestras crio-EM con espesor de hielo controlado a nanoescala. El chip basado en silicio (Si), que tiene una matriz regular de microagujos con ventana de óxido de grafeno (GO) modelada en una película de nitruro de silicio controlado por espesor (Si_xN_y), se ha desarrollado mediante la aplicación de técnicas de sistema microelectromecánico (MEMS). La fotolitografía UV, la deposición química de vapor, el grabado húmedo y seco de la película delgada y la fundición en gota de materiales de nanoláminas 2D se utilizaron para la producción en masa de los chips micropatronados con ventanas GO. La profundidad de los micro-agujeros se regula para controlar el espesor del hielo bajo demanda, dependiendo del tamaño de la muestra para el análisis crio-EM. La afinidad favorable de GO hacia las biomoléculas concentra las biomoléculas de interés dentro del microagujeto durante la preparación de la muestra crio-EM. El chip micropatronado con ventanas GO permite imágenes crio-EM de alto rendimiento de varias moléculas biológicas, así como nanomateriales inorgánicos.

Introducción

La microscopía electrónica criogénica (crio-EM) se ha desarrollado para resolver la estructura tridimensional (3D) de las proteínas en su estado nativo 1,2,3,4. La técnica consiste en fijar proteínas en una capa delgada (10-100 nm) de hielo vítreo y adquirir imágenes de proyección de proteínas orientadas aleatoriamente utilizando un microscopio electrónico de transmisión (TEM), con la muestra mantenida a temperatura de nitrógeno líquido. Miles o millones de imágenes de proyección son adquiridas y utilizadas para reconstruir una estructura 3D de la proteína mediante algoritmos computacionales ^5,6. Para un análisis exitoso con crio-EM, la preparación de crio-muestras se ha automatizado mediante la congelación por inmersión del equipo que controla las condiciones de borrado, la humedad y la temperatura. La solución de muestra se carga en una rejilla TEM con una membrana de carbono agujereada, se borra sucesivamente para eliminar el exceso de solución y luego se congela con etano líquido para producir hielo vítreo delgado ^1,5,6. Con los avances en crio-EM y la automatización de la preparación de^{muestras 7}, el crio-EM se ha utilizado cada vez más para resolver la estructura de las proteínas, incluidas las proteínas de la envoltura para virus y las proteínas del canal iónico en la membrana celular ^8,9,10. La estructura de las proteínas de la envoltura de las partículas virales patógenas es importante para comprender la patología de la infección viral, así como para desarrollar el sistema de diagnóstico y las vacunas, por ejemplo, el SARS-CoV-2¹¹, que causó la pandemia de COVID-19. Además, las técnicas de crio-EM se han aplicado recientemente a las ciencias de los materiales, como para materiales sensibles al haz de imágenes utilizados en la batería ^12,13,14 y los sistemas catalíticos ^14,15 y el análisis de la estructura de materiales inorgánicos en estado de solución¹⁶.

A pesar de los notables desarrollos en crio-EM y técnicas relevantes, existen limitaciones en la preparación de criomuestras, lo que dificulta el análisis de estructuras 3D de alto rendimiento. Preparar una película de hielo vítreo con un espesor óptimo es especialmente importante para obtener la estructura 3D de materiales biológicos con resolución atómica. El hielo debe ser lo suficientemente delgado como para minimizar el ruido de fondo de los electrones dispersos por el hielo y para prohibir la superposición de biomoléculas a lo largo de la trayectoria del haz de electrones ^1,17. Sin embargo, si el hielo es demasiado delgado, puede hacer que las moléculas de proteínas se alineen en las orientaciones preferidas o desnaturalicen 18,19,20. Por lo tanto, el espesor del hielo vítreo debe optimizarse en función del tamaño del material de interés. Además, generalmente se necesita un esfuerzo extenso para la preparación de la muestra y la detección manual de la integridad del hielo y la proteína en las rejillas TEM preparadas. Este proceso consume mucho tiempo, lo que dificulta su eficiencia para el análisis de estructuras 3D de alto rendimiento. Por lo tanto, las mejoras en la fiabilidad y reproducibilidad de la preparación de muestras de crio-EM mejorarían la utilización de crio-EM en biología estructural y descubrimiento de fármacos comerciales, así como para la ciencia de materiales.

Aquí, presentamos procesos de microfabricación para hacer un chip micro-estampado con ventanas de óxido de grafeno (GO) diseñadas para crio-EM de alto rendimiento con espesor de hielo controlado²¹. El chip micropatronado se fabricó utilizando técnicas de sistema microelectromecánico (MEMS), que pueden manipular la estructura y las dimensiones del chip según los fines de imagen. El chip micropatronado con ventanas GO tiene una estructura de micropocillo que se puede llenar con la solución de muestra, y la profundidad del micropozo se puede regular para controlar el grosor del hielo vítreo. La fuerte afinidad de GO por las biomoléculas mejora la concentración de biomoléculas para la visualización, mejorando la eficiencia del análisis de la estructura. Además, el chip micropatronado está compuesto por un marco de Si, que proporciona una alta estabilidad mecánica para la rejilla¹⁹, lo que lo hace ideal para manipular el chip durante los procedimientos de preparación de muestras y la obtención de imágenes crio-EM. Por lo tanto, un chip micropatrullado con ventanas GO fabricadas por técnicas MEMS proporciona confiabilidad y reproducibilidad de la preparación de muestras crio-EM, lo que puede permitir un análisis de estructura eficiente y de alto rendimiento basado en cryo-EM.

Protocolo

1. Fabricación de chip micro-estampado con ventanas GO (Figura 1)

1. Deposite el nitruro de silicio.
   1. Deposite nitruro de silicio de baja tensión (Si_xN_y) a ambos lados de la oblea de Si (4 pulgadas de diámetro y 100 μm de espesor) utilizando deposición química de vapor de baja presión (LPCVD) a 830 °C y una presión de 150 mTorr, bajo un flujo de 170 sccm de diclorosilano (SiH₂Cl₂, DCS) y 38 sccm de amoníaco (NH₃).
   2. Usando una velocidad de deposición de ~30 Å/min, controle el espesor de Si_xN_y para que esté dentro de 25-100 nm variando el tiempo de deposición.
      NOTA: Se debe tener mucho cuidado al manipular la oblea Si porque la oblea es muy delgada y frágil. Tenga cuidado de no doblar la oblea durante su manipulación o carga en el equipo.
2. Patrón de la fotorresistente.
   1. Aplique una solución de hexametildisilazano (HMDS) sobre la oblea de Si_xN depositada en_y con volumen suficiente para cubrir toda la superficie de la oblea, haga girar la capa con un recubrimiento de espín a 3.000 rpm durante 30 s, y hornee a 95 °C durante 30 s en una placa caliente para hacer que la superficie de la oblea sea hidrofóbica y así garantizar un buen rendimiento de recubrimiento con fotorresistencia (PR).
   2. Aplicar PR positivo (Tabla de Materiales) con volumen suficiente para cubrir toda la superficie de la oblea, hilar la capa a 3.000 rpm durante 30 s, y hornear a 100 °C durante 90 s en una placa caliente. El PR recubierto de espín tiene un grosor de 500 nm.
   3. Exponga la oblea recubierta de PR con luz ultravioleta (longitud de onda de 365 nm e intensidad^{de 20} mW/cm 2) durante 5 s a través de una máscara de cromo (Figura 2A-D) utilizando un alineador.
   4. Desarrolle el PR durante 1 minuto utilizando un revelador (Tabla de Materiales) y enjuague la oblea sumergiéndola en agua desionizada (DI) 2x. Seque completamente la oblea con patrón PR soplando gas N₂ sobre la superficie de la oblea.
      NOTA: Se debe tener mucho cuidado al soplar gas N₂ en la oblea Si porque la oblea es muy delgada y frágil. No sople gas N₂ con alta presión en una dirección perpendicular a la oblea, ya que esto puede causar la fractura de la oblea.
3. Patrón Si_xN_y.
   1. Grabe el Si_xN_y expuesto siguiendo el patrón del PR utilizando un grabador de iones reactivos (RIE) construido en laboratorio, con 3 sccm de gas hexafluoruro de azufre (SF₆) a una potencia de radiofrecuencia (RF) de 50 W. La velocidad de grabado con estos ajustes es de ~6 Å/s. Establecer el tiempo de grabado en función del grosor de la capa de Si_xN_y depositada.
      NOTA: La velocidad de grabado puede variar y necesitar optimización en el laboratorio dependiendo de las especificaciones del equipo RIE utilizado.
   2. Elimine el PR sumergiendo la oblea con patrón Si_xN_y en acetona a temperatura ambiente durante 30 min, seguido de enjuagar la oblea sumergiéndola en agua DI 2x. Seque completamente la oblea soplando gas N₂ sobre la superficie de la oblea.
      NOTA: Se debe tener extremo cuidado al sumergir o sacar la oblea de las soluciones porque la oblea puede fracturarse por la tensión superficial de la solución. No sumerja ni saque la oblea paralela a la superficie de la solución. Utilice pinzas de manejo de obleas de precisión con puntas de fibra de carbono. No agarre fuertemente la oblea con la pinza; Levante un lado de la oblea hasta que la oblea se incline hacia un ángulo, donde se puede sacar de la solución. La oblea puede fracturarse cuando se dobla debido al agarre firme durante el levantamiento.
4. Graba el Si.
   1. Prepare una solución de hidróxido de potasio (KOH) de 1,5 M disolviendo el polvo de KOH en agua DI a 80 °C.
   2. Sumerja la oblea estampada de Si_xN_y en una solución de KOH para grabar el Si expuesto. Deje la oblea en la solución con agitación hasta que se puedan observar las ventanas independientes de Si_xN_y en el lado opuesto del Si_xN_y estampado.
      NOTA: El tiempo de grabado húmedo puede diferir dependiendo del grosor del Si; para una oblea de 100 μm de espesor, el grabado húmedo normalmente toma varias horas. No ajuste la velocidad de agitación demasiado alta durante el grabado de Si porque las ventanas independientes de Si_xN_y son muy delgadas y pueden fracturarse por el flujo del fluido. En este experimento, la velocidad de agitación se estableció en 250 rpm.
   3. Limpie la oblea grabada sumergiéndola varias veces en un baño de agua DI para eliminar los residuos de grabado. Seque la oblea al aire.
      NOTA: Se debe tener extremo cuidado al sumergir o sacar la oblea con patrón de Si de las soluciones porque las ventanas independientes de Si_xN_y son muy delgadas y frágiles y pueden fracturarse por la tensión superficial de la solución. La oblea debe sumergirse o sacarse en ángulo, de modo que el borde de la oblea entre y salga primero de la solución.
5. Eliminar los residuos de grabado KOH.
   1. Presione ligeramente los límites de la matriz de chips con una pinza para obtener una matriz de chips que serán micro-modelados (Figura 1B).
   2. Preparar una solución de KOH de 1,5 M a 80 °C con agitación.
   3. Sumerja la matriz de chips en una solución KOH durante 30 s y enjuáguela sumergiéndola en agua DI 2x. Seque completamente las virutas soplando gas N₂ .
      NOTA: Se debe tener mucho cuidado al sumergir las virutas en soluciones y secarlas con gas N₂ porque las ventanas independientes de Si_xN_y son muy delgadas y frágiles. Mientras el chip está sumergido en la solución de KOH, se debe detener la agitación. Las virutas deben sumergirse con sus bordes primero en la dirección perpendicular a la solución y soplarse con gas N₂ en la dirección paralela.
   4. Seque completamente la matriz de chips en el aire durante al menos 1 h.
6. Modela el PR.
   1. Prepare una oblea de Si en blanco de 525 μm como soporte sólido. Cubra la oblea Si con HMDS y PR positivo, como se describió anteriormente, pero conecte la matriz de chips (con la ventana independiente Si_xN_y hacia arriba) en la oblea Si antes de hornear la PR. El PR actúa como un adhesivo entre la oblea y la matriz de chips. Hornea la oblea Si unida con la matriz de chips a 100 °C durante 90 s en una placa caliente.
   2. Gire el conjunto de chips con HMDS y PR positivo, como se describió anteriormente.
   3. Exponga el conjunto de chips con luz ultravioleta (longitud de onda de 365 nm; intensidad de 20 mW / cm² ) durante 5 s a través de una máscara de cromo (Figura 2E, F) utilizando un alineador.
   4. Desarrolle el PR usando un revelador durante 15 s, enjuague el conjunto de chips sumergiéndolo en agua DI 2x y seque completamente el conjunto de chips con patrón PR soplando gas N₂ .
7. Preparar el Si_xN y con micropatrones.
   1. Etch Si_xN_y siguiendo el patrón PR utilizando un RIE construido en laboratorio, con 3 sccm SF₆ gas a una potencia de RF de 50 W. Controle el tiempo de grabado dependiendo del grosor de la capa Si_xN_y .
8. Eliminar las relaciones públicas.
   1. Elimine el PR sumergiendo el chip estampado en solución de 1-metil-2-pirrolidinona (NMP) a 60 °C y dejándolo durante la noche. Enjuague el juego de chips sumergiéndolo en agua DI 2x, y seque completamente el conjunto de chips estampado soplando gas N₂ .
   2. Elimine los residuos de PR con un proceso de plasma O₂ utilizando gas O_{2 de} 100 sccm a una potencia de RF de 150 W durante 1 minuto con el RIE construido en laboratorio.
9. Enjuague el chip micro-estampado.
   1. Preparar una solución de KOH de 1,5 M a 80 °C.
   2. Sumerja los chips micropatrullados en una solución KOH durante 30 s para eliminar completamente los residuos de PR y enjuague los chips sumergiéndolos en agua DI 2x. Seque completamente las virutas soplando gas N₂ .
   3. Seque completamente las virutas al aire durante al menos 1 h.
10. Transferencia de óxido de grafeno (GO) por el método de fundición por gota.
    1. Diluya la solución de GO (2 mg/ml) a 0,2 mg/L con agua DI y sonicato durante 10 min para romper los agregados de las láminas de GO. Centrifugar la solución diluida de GO a 300 x g durante 30 s.
    2. Descarga de resplandor el lado grabado en Si del chip micropatronado para renderizar la superficie del chip con carga positiva utilizando un descargador de resplandor (Tabla de Materiales) a 15 mA durante 1 min.
    3. Deje caer 3 μL de la solución GO en el lado descargado por resplandor del chip micropatronado y deje la gota en el chip durante 1 minuto. Después de 1 minuto, seque el exceso de solución go en el chip con papel de filtro.
    4. Lave el chip transferido por GO con gotas de agua DI preparadas en película de parafina y borre el agua DI en el chip con papel de filtro. Repita este procedimiento 2x en el lado transferido GO y 1x en el lado opuesto. Seque el chip transferido por GO a temperatura ambiente durante la noche.
    5. Lave el chip microesmplado con ventanas GO sumergiéndolo en el agua DI y seque el chip con gas N₂ .

2. Imágenes crio-EM

1. Prepare la criomuestra.
   1. Prepare la criomuestra utilizando una máquina criopulsadora mecánica (Tabla de materiales), que controla la temperatura, la humedad, el tiempo de secado y la fuerza. Después de cargar la almohadilla secante en los blotters, asegúrese de que la humedad y la temperatura en la cámara se mantengan al 100% y 15 ° C, respectivamente.
   2. Recoja el chip micro-estampado con una crio-pinza típica y cargue la pinza a la máquina crio-sumergida. Pipete 3 μL de solución de muestra en el chip micro-estampado en el lado con patrón de agujero, con ventanas GO en la parte inferior. Controle el tiempo y la fuerza de borrado en función de la solución de muestra.
      NOTA: Aquí, se utilizaron especímenes biológicos, a saber, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1), la ferritina, el proteasoma 26S, el groEL, las partículas de proteína apoferritina y las proteínas de filamento tau para las imágenes crio-EM. Además, se utilizaron diversos tipos de materiales inorgánicos, como nanopartículas de Fe₂O₃ (NP), nanopartículas de Au, nanovarillas de Au y nanopartículas de sílice, para la obtención de imágenes crio-EM. El tiempo y la fuerza de borrado deseados se establecieron en el émbolo criogénico para diferentes tipos de muestras.
   3. Después del proceso de secado, congele el chip cargado con muestra inmediatamente en etano líquido. Transfiera el chip a la caja de rejilla en nitrógeno líquido (LN₂) y guárdelo en LN₂ antes de obtener imágenes crio-EM.
2. Realizar imágenes crio-EM.
   1. Cargue la criomuestra en un soporte crio-EM con la temperatura mantenida a -180 °C.
   2. Cargue el soporte crio-EM en un TEM y observe las muestras con el modo de sistema de dosis mínima (MDS).

Resultados

Un chip micro-estampado con ventanas GO fue fabricado por la fabricación MEMS y la transferencia de nanoláminas GO 2D. Los chips para micropatrones se produjeron en masa, con aproximadamente 500 chips producidos a partir de un 4 en oblea (Figura 1B y Figura 2A, B). Los diseños de los chips micro-estampados pueden ser manipulados utilizando diferentes diseños de la máscara de cromo (Figura 2) durante el procedim...

Discusión

Los procesos de microfabricación para producir chips micro-modelados con ventanas GO se presentan aquí. El chip micropatronado fabricado está diseñado para regular el grosor de la capa de hielo vítreo controlando la profundidad del microagujeto con ventanas GO dependiendo del tamaño del material a analizar. Se fabricó un chip microestampado con ventanas GO utilizando una serie de técnicas MEMS y un método de transferencia de nanoláminas 2D (Figura 1). La principal ventaja de utiliz...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP)	Sigma Aldrich, USA	443778
Acetone
AFM	Park Systems, South Korea	NX-10
Aligner	Midas System, South Korea	MDA-600S
AZ 300 MIF developer	AZ Electronic Materials USA Corp., USA	184411
Cryo-EM holder	Gatan, USA	626 single tilt cryo-EM holder
Cryo-plunging machine	Thermo Fisher SCIENTIFIC, USA	Vitrobot Mark IV
Focused ion beam-scanning electron microscopy (FIB-SEM)	FEI Company, USA	Helios NanoLab 650
Glow discharger	Ted Pella Inc., USA	PELCO easiGlow
Graphene oxide (GO) solution	Sigma Aldrich, USA	763705
Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+%	Alfa Aesar, USA	10226590
Low pressure chemical vapor deposition (LPCVD)	Centrotherm, Germany	LPCVD E1200
maP1205 positive PR	Micro resist technology, Germany	A15139
Potassium hydroxide (KOH), flake	DAEJUNG CHEMICALS & METALS Co. LTD., South Korea	6597-4400
Raman Spectrometer	NOST, South Korea	Confocal Micro Raman System HEDA
Reactive ion etcher (RIE)	Scientific Engineering, South Korea	Lab-built
SEM	Carl Zeiss, Germany	SUPRA 55VP
Si wafer	JP COMMERCE, South Korea		4" Silicon wafer, P(B)type, (100), 1-30ohm.c m, DSP, T:100um
Spin coater	Dong Ah Trade Corp., South Korea	ACE-200
TEM	JEOL, Japan	JEM-2100F