Hücre İçi Vezikül Rüptürünün İşlevini İncelemek İçin Fotodinamik Bir Yaklaşım

Özet

AlPcS_2a aracılı kromofor yardımlı lazer inaktivasyonu (CALI), canlı hücrelerde hücre içi veziküllerin (IV'ler) uzaysal zamansal hasarını incelemek için güçlü bir araçtır.

Özet

Hücre içi veziküller (IV'ler), veziküllerin sitoplazmaya endositozu ile oluşur. IV oluşumu, IV membranlarının geçirgenliği ve endozom ve lizozomların oluşumu yoluyla çeşitli sinyal yolaklarının aktive edilmesinde rol oynar. IV'lerin oluşumunu ve IV regülasyonunu kontrol etmedeki materyalleri incelemek için kromofor yardımlı lazer inaktivasyonu (CALI) adı verilen bir yöntem uygulanır. CALI, membran geçirgenliği tarafından indüklenen sinyal yolunu incelemek için görüntüleme tabanlı bir fotodinamik metodolojidir. Yöntem, seçilen organelin mekansal zamansal manipülasyonunun bir hücrede geçirgenleştirilmesine izin verir. CALI yöntemi, endozomların ve lizozomların geçirgenliği yoluyla spesifik molekülleri gözlemlemek ve izlemek için uygulanmıştır. IV'lerin membran rüptürünün, galektin-3 gibi glikan bağlayıcı proteinleri seçici olarak işe aldığı bilinmektedir. Burada, protokol, IV rüptürünün AlPcS_2a tarafından indüklenmesini ve bozulmuş lizozomları etiketlemek için bir belirteç olarak galektin-3'ün kullanılmasını açıklar; bu, IV membran rüptürünün aşağı akış etkilerini ve çeşitli durumlar altında aşağı akış etkilerini incelemede yararlıdır.

Giriş

Bir tür hücre içi vezikül (IV) olan endozomlar, endositoz tarafından oluşturulur ve daha sonra lizozomlara olgunlaşır. IV'lerin oluşumunda çeşitli hücre içi sinyal yolları rol oynar; Ek olarak, farklı içsel ve dışsal uyaranlar IV'lere zarar verebilir (örneğin, patojenler enfeksiyon sırasında sınırlı zardan kaçabilir ve sitoplazma^1'e girebilir). Buna genellikle endositotik veziküllerin^{rüptürü eşlik eder 2}. Bu nedenle, IV'leri hedefleme ve zarar verme teknikleri ilgili çalışmalarda kullanılabilir³.

Fotodinamik terapi (PDT), tümörleri veya patojenleri öldürerek hastalıklarla mücadele etmek için ışığa bağımlı bir terapidir⁴. PDT'de, hedeflenen hücreler, ışık aydınlatması^ile lokal olarak aktive edilebilen fotosensitizörler adı verilen toksik olmayan kromoforlarla etiketlenir ^5,6. Fotosensitizörler ışıktan enerjiyi emer ve uyarılmış bir singlet durumuna dönüşür ve uzun ömürlü uyarılmış üçlü duruma yol açar. Üçlü durumun fotosensitizörleri elektron veya enerji transferine uğrayabilir ve oksijen varlığında reaktif oksijen türleri (ROS) oluşturabilir ve aydınlatma bölgesi⁷ içindeki etiketli hücreleri mekansal olarak yok edebilir. Sonuç, ışığın gücüne bağlı olarak değişir⁸. Fotosensitizörlerin konsantrasyonunu ve ışık aydınlatmasının yoğunluğunu kontrol ederek, hedeflenen biyomoleküller, kromofor yardımlı ışık inaktivasyonu (CALI)⁹ olarak adlandırılan hücre lizisi olmadan seçici olarak inaktive edilebilir. Çeşitli hücre altı hedefleri seçici olarak etiketleyebilen fotosensitizörlerin önemli ölçüde gelişmesiyle CALI, nükleotidler ve proteinler gibi küçük biyomoleküllerin yanı sıra mitokondri ve endo-lizozomlar 3,10,11,12,13 gibi organeller için biyomoleküllerin ışık aracılı inaktivasyonunu kontrol etmek için değerli bir araç haline gelmiştir.

CALI ile karşılaştırıldığında, lizozomal hasar için bakteriyel toksin ^14,15 ve Leu-Leu-OMe¹⁶ tedavisi gibi membranları bozmak için kimyasal veya fiziksel yöntemler de kullanılır. Bununla birlikte, bu yöntemler hücreler içindeki IV'lerin toplu bozulmasını gösterir. CALI'de sağlam fotosensitizörler (yani, Al(III) ftalosiyanin klorür disülfonik asit (AlPcS_2a)) kullanılır; Endositoz yoluyla lizozomları hedef alan AlPcS_2a, kontrollü bir bölgede endozomları veya lizozomları parçalamak için kullanılır¹⁷. AlPcS_2a, plazma zarındaki lipitlere bağlanan ve endositoz yoluyla içselleştirilen ve sonunda endositik yol¹⁸ aracılığıyla lizozom içinde biriken hücre zarı geçirimsiz ftalosiyanin bazlı bir kromofordur. Yakın kızılötesi spektral bir bölgedeki ışığı emer ve uyarılmış AlPcS_{2a 18} tarafından üretilen büyük bir ROS olan singlet oksijen üretir. Singlet oksijeninin hızla bozunması, hücrelerdeki küçük bir bölgede (yaklaşık 10-20 nm) difüzyon ve reaksiyon mesafesini ^sınırlar19. AlPcS_2a inkübasyon ve ışık aydınlatmasının süresini ayarlayarak, IV'lerin hücre altı bir alandaki hasarının mekansal zamansal kontrolüne izin verilir. Bu nedenle CALI, IV hasarının sonuçlarını ve IV'lerin oluşumunu ve düzenlenmesini incelemek için güçlü bir araç haline gelir.

Bu çalışmada, AlPcS_2a'yı fotosensitizör olarak kullanan spesifik bir CALI protokolü ele alınmıştır. Bu protokol, endozomlar ve lizozomlar da dahil olmak üzere çeşitli IV tiplerine uygulanabilir ve membran rüptürü sonrası takip yanıtlarını incelemek için kullanılabilir. Lizozom rüptüründen sonra ortaya çıkan florofor konjuge galektin-3^16,20 eksprese eden HeLa hücreleri bu protokolü göstermek için kullanılır.

Protokol

1. AlPcS_2a stok hazırlama

1. 10 mg AlPcS_2a'yı 400 μL 0.1 M NaOH içinde çözün. Çözünürlüğü artırmak için, çözeltiyi 50 ° C'de ve vortekste ısıtın.
2. Çözeltiyi 4 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile karıştırın. Ardından, çözünmeyen çökeltileri gidermek için çözeltiyi 0,22 μm'lik bir filtre ile filtreleyin.
3. Çözeltinin konsantrasyonunu bir UV-Vis spektrofotometresi ile ölçün. AlPcS_2a'nın 672 nm'deki yok olma katsayısı 4 x 10⁴ cm-1 ^M-1'dir. 1 mM çözeltisi oluşturmak için AlPcS_2a çözümünü PBS ile seyreltin. 1 mL aliquots yapın ve -20 ° C'de saklayın.

2. Transfeksiyon

NOT: Gal3-GFP, lizozomal rüptürün canlı hücre görüntülemesi için bir gösterge olarak uygulanır.

1. DMEM'de HeLa hücre kültürünü% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ile destekleyin. Hücreleri PBS ile yıkadıktan sonra, hücreleri deneyin, daha sonra% 10 FBS ile desteklenmiş DMEM'deki hücreleri yeniden askıya alın.
   NOT: Yöntem, HeLa ve A549 hücre satırları da dahil olmak üzere ekli hücre satırlarının çoğu için geçerlidir. Prensip olarak, süspansiyon hücrelerini test etmemesine rağmen, CALI testleri onlarla yapılabilir.
2. 300 ng Gal3-GFP plazmidini 25 μL indirgenmiş serum ortamında seyreltin ve ardından 0.6 μL P3000 reaktifi ekleyin. Yavaşça karıştırın. 0.45 μL Lipofectamine 3000 reaktifini 25 μL indirgenmiş serum ortamında seyreltin. Yavaşça karıştırın.
3. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Seyreltilmiş DNA ve seyreltilmiş Lipofectamine 3000'i karıştırın ve ardından oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
4. DNA-Lipofectamine karışımını, 3 x 10⁵ askıya alınmış HeLa hücrelerini ve 200 μL DMEM +% 10 FBS'yi karıştırın ve ardından hücreleri 35 mm'lik bir cam düğme kabının merkezi cam bölgesine tohumlayın.

3. AlPcS2a boyama

1. Hücre bağlanmasına izin vermek için, hücreleri en az 4 saat boyunca% 5 CO₂ ile birlikte verilen inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin.
2. 1 μM AlPcS_2a çözeltisi oluşturmak için DMEM'deki AlPcS 2a'yı %10 FBS ile birlikte seyreltin. AlPcS_2a içeren ortamı 37 °C su banyosunda önceden ısıtın. Kültür ortamını AlPcS_2a içeren ortamla değiştirin.
3. Hücreleri 37 ° C'de inkübe edin, gece boyunca% 5 CO₂ ile birlikte verilen inkübatörde (16-18 saat).
4. Ertesi gün, hücre dışı AlPcS2a'yı çıkarmak için hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Ortamı taze ortamla değiştirin ve daha sonra endositik yol boyunca kalan boyanın lizozomlara birikmesine izin vermek için 4 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   NOT: Endozomları boyamak için, DMEM'de 1 μM AlPcS_2a'daki hücreleri 37 ° C'de 15 dakika boyunca% 10 FBS içeren inkübe edin. Daha sonra, hücreleri PBS ile iki kez yıkayın ve görüntülemeden önce önceden ısıtılmış ortamda inkübe edin.

Şekil 1. AlPcS_2a ile seçici IV hasarını temsil eden şematik bir figür. Şekil, seçici IV hasarının şematiklerini göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2. AlPcS2a ile lizozomal boyama. HeLa hücrelerinde 1 μM AlPcS_2a ile gece boyunca etiketlenen lizozomlar, 50 nM yeşil floresan boya ile pozitif boyanır. Ölçek çubuğu: 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

4. Örnek görüntüleme ve ışık aydınlatması

NOT: Tek bir hücrenin hücre altı bölgesinde veya bir kültür kabındaki tüm AlPcS_2a etiketli hücrelerde IV hasarı gerçekleştirilebilir. Tüm kültür kabının toplu olarak aydınlatılması, biyokimyasal çalışmalar da dahil olmak üzere bu hasarın nicel olarak incelenmesine izin verir.

1. Aşağıda açıklandığı gibi, tek bir hücre içindeki lizozomlara zarar vererek tek hücreleri manipüle edin.
   1. Kültür kabını konfokal mikroskop sahnesine yerleştirin. Heyecan verici GFP ve AlPcS2a için sırasıyla 488 nm ve 561 nm lazerleri kullanın.
   2. Hasar görmek üzere seçilen AlPcS_2a etiketli veziküller üzerinde 5 x 5 μm² ilgi alanını (ROI) daire içine alın.
   3. Pulse, 70 tekrar için 0,21 mW'lık 633 nm lazer ile yatırım getirisini aydınlatır. Lizozomal membran geçirgenliğinin bir göstergesi olarak Gal3 puncta oluşumunu izleyin.
2. Aşağıda açıklandığı gibi bir kültür kabındaki etiketli tüm hücrelere zarar verin.
   1. Kültür tabağını bir platforma yerleştirin. Çanağı 660 nm kolimasyonlu LED ışığı ile aydınlatın (yakın kızılötesi ışık, AlPcS2a'nın uyarma spektrumunda ideal bir temeldir).
   2. Kültür kabını mikroskop üzerine yerleştirin ve adım 4.1.3'te belirtildiği gibi membran geçirgenliği göstergelerini izleyin.
3. Aşağıdaki göstergeleri kullanarak IV'lerin yaralanmasını değerlendirin.
   1. Endozom veya lizozom içeriği, IV rüptürü üzerine sitozole maruz kalan en yüksek glikozile edilir. Bunları, galektin-1, galektin-3, galektin-8 ve galektin-9^16,20 dahil olmak üzere sitozolik glikan bağlayıcı galektinler kullanarak hızla etiketleyin.
   2. Yaranın boyutu,^21'de tarif edildiği gibi membran geçirimsiz boyanın salınması ile belirlenebilir.
   3. Endozomlar ve lizozomlar arasındaki fark, luminal pH değerleridir. Lizozomal rüptür, FITC-dekstran³ gibi pH'a duyarlı boya kullanılarak ölçülebilen luminal pH'ı bozar.

Şekil 3. AlPcS_2a aracılı CALI, aydınlatma bölgesindeki lizozomlara TagRFP-galektin-3'ün (Gal3) yerel olarak işe alınmasını indükler. TagRFP-galektin-3 eksprese edilen HeLa hücrelerindeki lizozomlar, 1 μM AlPcS_2a ile gece boyunca boyandı, ardından sarı kare içinde yakın kızılötesi ışıkla (633 nm) aydınlatmaya odaklandı. Sarı kare içindeki AlPcS_2a sinyali, TagRFP-galektin-3 punkta oluşumu ile birlikte fotoağartılır. Ölçek çubuğu: 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar

Endozom ve lizozom da dahil olmak üzere IV'ün AlPcS_2a kaynaklı hasarını temsil eden şematik bir şekil gösterilmiştir (Şekil 1).

Ticari olarak temin edilebilen belirteçler, AlPcS_2a boyama koşullarını belirlemek için kullanılabilir. Örneğin, AlPcS_2a puncta ve yeşil floresan boya²² kolokalizasyon (Şekil 2).

Florofor etiketli galektin-...

Tartışmalar

AlPcS_2a plazma zarına bağlanır, daha sonra endositoz tarafından içselleştirilir ve sonunda lizozomlarda birikir. AlPcS_2a böylece inkübasyon süresini ayarlayarak hücre altı bölmelerde lokalize edilebilir. Bu metodolojinin bir sınırlaması, IV'lerin sadece bir alt popülasyonunun AlPcS_2a tarafından endositoz yoluyla etiketlenebilmesidir, çünkü ER ve Golgi aparatı gibi IV'lerin başka birçok membran kaynağı vardır. Ek olarak, AlPcS_2a'nın erken veya geç end...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Al(III) Phthalocyanine Chloride Disulfonic acid (AlPcS2a)	Frontier Scientific	P40632
Culture dish	ibidi	812128-200
Culture Medium			DMEM supplemented with 10% FBS and 100 U/mL penicillin G and 100 mg/mL Streptomycin
DMEM	Gibco	11965092
FBS	Thermo Fisher Scientific	A4736301
Gal3-GFP plasmid	addgene
Lipofectamine 3000 kit	Thermo Fisher Scientific	L3000008
LysoTracker Green DND-26	Thermo Fisher Scientific	L7526	green fluorescent dye
Multiwall plate	perkinelmer	PK-6005550
NaOH	Thermo Fisher Scientific	Q15895
OptiMEM	Thermo Fisher Scientific	31985070
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140163
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	21600-069	137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4
Cell line
HeLa Cell Line	ATCC	CCL-2	The methods are applicable for most of the attached cell lines. Conditions must be determined individually.
Equipments
0.22 µm Filter	Merck	SLGV013SL
Collimated LED Light  (660nm)	Thorlabs	M660L3-C1 and DC2100	Near-infared light is ideal base on the excitation spectrum of AlPcS2a.
Confocal microscopy	Carl Zeiss	LSM 780	An incubation system is required for long-term imaging.
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers	Thermo Fisher Scientific
Red LED light	Tholabs	M660L4-C1