Ein photodynamischer Ansatz zur Untersuchung der Funktion der intrazellulären Vesikelruptur

Zusammenfassung

Die AlPcS_{2a-vermittelte} Chromophor-assistierte Laserinaktivierung (CALI) ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der raumzeitlichen Schädigung intrazellulärer Vesikel (IVs) in lebenden Zellen.

Zusammenfassung

Intrazelluläre Vesikel (IVs) werden durch Endozytose von Vesikeln in das Zytoplasma gebildet. Die IV-Bildung ist an der Aktivierung verschiedener Signalwege durch Permeabilisierung von IV-Membranen und die Bildung von Endosomen und Lysosomen beteiligt. Eine Methode namens Chromophor-assistierte Laserinaktivierung (CALI) wird angewendet, um die Bildung von Infusionen und die Materialien zur Steuerung der Infusionsregulation zu untersuchen. CALI ist eine bildgebende photodynamische Methode zur Untersuchung des durch Membranpermeabilisierung induzierten Signalwegs. Die Methode erlaubt es, die selektierte Organelle räumlich und zeitlich in einer Zelle zu permeabilisieren. Die CALI-Methode wurde angewendet, um bestimmte Moleküle durch die Permeabilisierung von Endosomen und Lysosomen zu beobachten und zu überwachen. Es ist bekannt, dass der Membranriss von IVs selektiv glykanbindende Proteine wie Galektin-3 rekrutiert. Hier beschreibt das Protokoll die Induktion einer IV-Ruptur durch AlPcS_2a und die Verwendung von Galektin-3 als Marker zur Markierung beeinträchtigter Lysosomen, was nützlich ist, um die nachgeschalteten Effekte der IV-Membranruptur und ihre nachgeschalteten Effekte unter verschiedenen Situationen zu untersuchen.

Einleitung

Endosomen, eine Art intrazellulärer Vesikel (IV), werden durch Endozytose gebildet und reifen dann zu Lysosomen heran. Verschiedene intrazelluläre Signalwege sind an der Bildung von Infusionen beteiligt; Darüber hinaus können unterschiedliche intrinsische und extrinsische Reize IVs schädigen (z. B. können Krankheitserreger während der Infektion aus der gebundenen Membran entweichen und in das Zytoplasma¹ gelangen). Dies geht in der Regel mit der Ruptur endozytotischer Vesikel^{einher 2}. Daher können die Techniken zur gezielten und schädigenden Infusion in verwandten Studien^{verwendet werden 3}.

Die Photodynamische Therapie (PDT) ist eine lichtabhängige Therapie zur Bekämpfung von Krankheiten durch Abtötung von Tumoren oder Krankheitserregern⁴. Bei der PDT werden die Zielzellen mit nicht-toxischen Chromophoren, sogenannten Photosensibilisatoren, markiert, die durch Lichtbeleuchtung lokal aktiviert werden können ^5,6. Photosensibilisatoren absorbieren Energie aus Licht und wandeln sich in einen angeregten Singulett-Zustand um, was zum langlebigen angeregten Triplett-Zustand führt. Photosensibilisatoren des Triplett-Zustands können Elektronen- oder Energietransfer durchlaufen und in Gegenwart von Sauerstoff reaktive Sauerstoffspezies (ROS) bilden und markierte Zellen innerhalb des Beleuchtungsbereichs⁷ räumlich zerstören. Die Konsequenz variiert je nach Lichtstärke⁸. Durch die Kontrolle der Konzentration von Photosensibilisatoren und der Intensität der Lichtbeleuchtung können gezielte Biomoleküle selektiv inaktiviert werden, ohne dass eine Zelllyse erforderlich ist, was als chromophorgestützte Lichtinaktivierung (CALI) bezeichnet ^wird9. Mit der bedeutenden Entwicklung von Photosensibilisatoren, die verschiedene subzelluläre Ziele selektiv markieren können, ist CALI zu einem wertvollen Werkzeug geworden, um die lichtvermittelte Inaktivierung von Biomolekülen für kleine Biomoleküle wie Nukleotide und Proteine sowie von Organellen wie Mitochondrien und Endolysosomen^zu kontrollieren 3,10,11,12,13.

Im Vergleich zu CALI werden auch chemische oder physikalische Methoden zur Schädigung von Membranen eingesetzt, wie z.B. bakterielles Toxin ^14,15 und Leu-Leu-OMe¹⁶ Behandlung bei lysosomalen Schäden. Diese Methoden zeigen jedoch eine massive Beeinträchtigung der intravenösen Infusionen innerhalb der Zellen. Robuste Photosensibilisatoren (d. h. Al(III)-phthalocyaninchloriddisulfonsäure (AlPcS_2a)) werden in CALI verwendet; AlPcS_2a, das durch Endozytose auf die Lysosomen abzielt, wird verwendet, um Endosomen oder Lysosomen in einer kontrollierten Region^{aufzubrechen 17}. AlPcS_2a ist ein Zellmembran-undurchlässiger Phthalocyanin-basierter Chromophor, der an Lipide auf der Plasmamembran bindet und durch Endozytose internalisiert wird und sich schließlich über den endozytären Weg im Lysosom anreichert¹⁸. Es absorbiert Licht in einem nahinfraroten Spektralbereich und erzeugt Singulett-Sauerstoff, eine wichtige ROS, die durch angeregtes AlPcS_{2a 18} erzeugt wird. Der schnelle Zerfall des Singulett-Sauerstoffs begrenzt seine Diffusion und Reaktionsdistanz innerhalb eines winzigen Bereichs in Zellen (ca. 10-20 nm)¹⁹. Durch die Anpassung der Dauer der AlPcS_{2a-Inkubation} und der Lichtbeleuchtung wird eine raumzeitliche Kontrolle der Schädigung von IVs innerhalb eines subzellulären Bereichs ermöglicht. CALI wird daher zu einem mächtigen Werkzeug, um die Folgen von IV-Schäden sowie die Bildung und Regulation von IVs zu untersuchen.

In dieser Studie wird ein spezifisches CALI-Protokoll unter Verwendung von AlPcS_2a als Photosensibilisator untersucht. Dieses Protokoll kann auf verschiedene Arten von Infusionen, einschließlich Endosomen und Lysosomen, angewendet und verwendet werden, um die Folgereaktionen nach einem Membranriss zu untersuchen. HeLa-Zellen, die Fluorophor-konjugiertes Galectin-3 ^16,20 exprimieren, das nach Lysosomenruptur sichtbar ist, werden verwendet, um dieses Protokoll zu demonstrieren.

Protokoll

1. AlPcS_2a Stoffaufbereitung

1. 10 mg AlPcS_2a werden in 400 μl 0,1 M NaOH gelöst. Um die Löslichkeit zu verbessern, erhitzen Sie die Lösung auf 50 °C und wirbeln Sie sie.
2. Mischen Sie die Lösung mit 4 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Filtrieren Sie dann die Lösung mit einem 0,22-μm-Filter, um die unlöslichen Ausfällungen zu entfernen.
3. Messen Sie die Konzentration der Lösung mit einem UV-Vis-Spektralphotometer. Der Extinktionskoeffizient von AlPcS_2a bei 672 nm beträgt 4 x 10⁴ cm-1 ^M-1. Verdünnen Sie die AlPcS_2a-Lösung mit PBS, um eine 1-mM-Lösung herzustellen. 1 ml Aliquots herstellen und bei -20 °C lagern.

2. Transfektion

HINWEIS: Gal3-GFP wird als Indikator für die Lebendzellbildgebung der lysosomalen Ruptur verwendet.

1. Aufrechterhaltung der HeLa-Zellkultur in DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS). Nachdem Sie die Zellen mit PBS gewaschen haben, trypsinisieren Sie die Zellen und resuspendieren Sie die Zellen in DMEM, das mit 10% FBS ergänzt wird.
   HINWEIS: Die Methode ist auf die meisten der angehängten Zelllinien anwendbar, einschließlich HeLa- und A549-Zelllinien. Obwohl keine Suspensionszellen getestet wurden, könnten CALI-Assays mit ihnen durchgeführt werden.
2. Verdünnen Sie 300 ng Gal3-GFP-Plasmid in 25 μl reduziertem Serummedium und fügen Sie dann 0,6 μl P3000-Reagenz hinzu. Vorsichtig mischen. Verdünnen Sie 0,45 μl Lipofectamin-3000-Reagenz in 25 μl reduziertem Serummedium. Vorsichtig mischen.
3. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Mischen Sie verdünnte DNA und verdünntes Lipofectamin 3000 und inkubieren Sie es dann 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.
4. Mischen Sie das DNA-Lipofectamin-Gemisch, 3 x 10⁵ suspendierte HeLa-Zellen und 200 μl DMEM+10% FBS und säen Sie die Zellen dann auf den zentralen Glasbereich einer 35-mm-Glasknopfschale.

3. AlPcS2a-Färbung

1. Um die Zellbindung zu ermöglichen, inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C im mit 5 % CO₂ versorgten Inkubator für mindestens 4 h.
2. Verdünnen Sie AlPcS 2a in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, um eine 1 μM AlPcS_2a-Lösung herzustellen. Das AlPcS_2a-haltige Medium wird im 37 °C warmen Wasserbad vorgewärmt. Ersetzen Sie das Nährmedium durch das AlPcS_2a-haltige Medium.
3. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C im mit 5% CO₂ versorgten Inkubator über Nacht (16-18 h).
4. Waschen Sie die Zellen am nächsten Tag zweimal mit PBS, um extrazelluläres AlPcS2a zu entfernen. Ersetzen Sie das Medium durch frisches Medium und inkubieren Sie es dann 4 h lang bei 37 °C, damit sich der restliche Farbstoff entlang des endozytären Weges in den Lysosomen anreichern kann.
   HINWEIS: Um Endosomen zu färben, inkubieren Sie Zellen in 1 μM AlPcS_2a in DMEM, das 10 % FBS enthält, für 15 min bei 37 °C. Waschen Sie die Zellen anschließend zweimal mit PBS und inkubieren Sie sie vor der Bildgebung in einem vorgewärmten Medium.

Abbildung 1. Eine schematische Abbildung, die die selektive IV-Schädigung mit AlPcS_2a darstellt. Die Abbildung zeigt die schematische Darstellung des selektiven IV-Schadens. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2. Lysosomale Färbung mit AlPcS2a. Lysosomen, die über Nacht mit 1 μM AlPcS_2a in HeLa-Zellen markiert wurden, werden mit 50 nM grünem Fluoreszenzfarbstoff positiv gefärbt. Maßstabsleiste: 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

4. Probenbildgebung und Lichtbeleuchtung

HINWEIS: Eine intravenöse Schädigung innerhalb einer subzellulären Region einer einzelnen Zelle oder aller AlPcS_{2a-markierten} Zellen in einer Kulturschale kann durchgeführt werden. Die Massenbeleuchtung der gesamten Kulturschale ermöglicht eine quantitative Untersuchung dieser Schäden, einschließlich biochemischer Untersuchungen.

1. Manipulieren Sie einzelne Zellen, indem Sie Lysosomen innerhalb einer einzelnen Zelle beschädigen, wie unten beschrieben.
   1. Stellen Sie die Kulturschale auf den Tisch eines konfokalen Mikroskops. Verwenden Sie die 488-nm- und 561-nm-Laser für die Anregung von GFP bzw. AlPcS2a.
   2. Kreisen Sie eine 5 x 5^μm2 große Region of Interest (ROI) auf den AlPcS_{2a-markierten} Vesikeln ein, die zur Schädigung ausgewählt werden.
   3. Beleuchten Sie den ROI mit einem 633 nm Laser von 0,21 mW für 70 Wiederholungen. Beobachtung der Bildung von Gal3 puncta als Indikator für die Permeabilisierung der lysosomalen Membran.
2. Beschädigen Sie alle markierten Zellen in einer Kulturschale wie unten beschrieben.
   1. Stellen Sie die Kulturschale auf eine Plattform. Beleuchten Sie die Schüssel mit 660 nm kollimiertem LED-Licht (Nahinfrarotlicht ist die ideale Basis für das Anregungsspektrum von AlPcS2a).
   2. Stellen Sie die Kulturschale auf das Mikroskop und überwachen Sie die Indikatoren für die Membranpermeabilisierung, wie in Schritt 4.1.3 beschrieben.
3. Beurteilen Sie die Schädigung von Infusionen anhand der folgenden Indikatoren.
   1. Der Inhalt des Endosoms oder Lysosoms ist am stärksten glykosyliert, das bei einer IV-Ruptur dem Zytosol ausgesetzt ist. Markieren Sie diese schnell mit zytosolischen Glykan-bindenden Galektinen, einschließlich Galektin-1, Galektin-3, Galektin-8 und Galektin-9^16,20.
   2. Die Größe der Wunde kann durch die Freisetzung von membranundurchlässigem Farbstoff bestimmt werden, wie in²¹ beschrieben.
   3. Der Unterschied zwischen Endosomen und Lysosomen liegt in ihrem luminalen pH-Wert. Die lysosomale Ruptur stört den luminalen pH-Wert, der mit pH-empfindlichen Farbstoffen wie FITC-Dextran³ gemessen werden kann.

Abbildung 3. AlPcS_{2a-vermitteltes} CALI induziert die lokale Rekrutierung von TagRFP-Galectin-3 (Gal3) an die Lysosomen innerhalb der Beleuchtungsregion. Lysosomen in TagRFP-Galektin-3-exprimierten HeLa-Zellen wurden über Nacht mit 1 μM AlPcS_2a gefärbt, gefolgt von fokussierender Beleuchtung mit Nahinfrarotlicht (633 nm) innerhalb des gelben Quadrats. Das AlPcS_2a-Signal innerhalb des gelben Quadrats wird photogebleicht, begleitet von der Bildung von TagRFP-Galectin-3-Puncta. Maßstabsleiste: 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergebnisse

Eine schematische Abbildung, die die AlPcS 2a-induzierte Schädigung von IV, einschließlich Endosom und Lysosom, darstellt, wurde gezeigt (Abbildung 1).

Kommerziell erhältliche Marker können verwendet werden, um die AlPcS 2a-Färbebedingungen zu bestimmen. Zum Beispiel die Kolokalisation von AlPcS 2a_Puncta und grünem Fluoreszenzfarbstoff²² (Abbildung 2).

Diskussion

AlPcS_2a bindet an die Plasmamembran, wird dann durch Endozytose internalisiert und reichert sich schließlich in Lysosomen an. AlPcS_2a kann somit durch Anpassung der Inkubationsdauer in den subzellulären Kompartimenten lokalisiert werden. Eine Einschränkung dieser Methodik besteht darin, dass nur eine Subpopulation von IVs durch Endozytose durch AlPcS_2a markiert werden konnte, da es viele andere Membranquellen für IVs gibt, wie z.B. ER- und Golgi-Apparate. Darüber hinaus wäre die sel...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Al(III) Phthalocyanine Chloride Disulfonic acid (AlPcS2a)	Frontier Scientific	P40632
Culture dish	ibidi	812128-200
Culture Medium			DMEM supplemented with 10% FBS and 100 U/mL penicillin G and 100 mg/mL Streptomycin
DMEM	Gibco	11965092
FBS	Thermo Fisher Scientific	A4736301
Gal3-GFP plasmid	addgene
Lipofectamine 3000 kit	Thermo Fisher Scientific	L3000008
LysoTracker Green DND-26	Thermo Fisher Scientific	L7526	green fluorescent dye
Multiwall plate	perkinelmer	PK-6005550
NaOH	Thermo Fisher Scientific	Q15895
OptiMEM	Thermo Fisher Scientific	31985070
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140163
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	21600-069	137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4
Cell line
HeLa Cell Line	ATCC	CCL-2	The methods are applicable for most of the attached cell lines. Conditions must be determined individually.
Equipments
0.22 µm Filter	Merck	SLGV013SL
Collimated LED Light  (660nm)	Thorlabs	M660L3-C1 and DC2100	Near-infared light is ideal base on the excitation spectrum of AlPcS2a.
Confocal microscopy	Carl Zeiss	LSM 780	An incubation system is required for long-term imaging.
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers	Thermo Fisher Scientific
Red LED light	Tholabs	M660L4-C1