Фотодинамический подход к изучению функции разрыва внутриклеточных везикул

Резюме

AlPcS-2a-опосредованная хромофорная лазерная инактивация (CALI) является мощным инструментом для изучения пространственно-временного повреждения внутриклеточных везикул (IV) в живых клетках.

Аннотация

Внутриклеточные везикулы (IV) образуются в результате эндоцитоза везикул в цитоплазму. Внутривенное образование участвует в активации различных сигнальных путей посредством пермеабилизации внутривенных мембран и образования эндосом и лизосом. Метод, называемый хромофорно-ассистированной лазерной инактивацией (CALI), применяется для изучения образования внутривенных вливаний и материалов, контролирующих внутривенную регуляцию. CALI - это фотодинамическая методология на основе визуализации для изучения сигнального пути, вызванного проникновением мембраны. Метод позволяет пространственно-временные манипуляции с выбранной органеллой проникать в клетку. Метод CALI был применен для наблюдения и мониторинга конкретных молекул путем проникновения эндосом и лизосом. Известно, что разрыв мембраны внутривенных вливаний селективно рекрутирует гликан-связывающие белки, такие как галектин-3. Здесь протокол описывает индукцию внутривенного разрыва AlPcS_2a и использование галектина-3 в качестве маркера для маркировки нарушенных лизосом, что полезно при изучении нисходящих эффектов разрыва мембраны IV и их последующих эффектов в различных ситуациях.

Введение

Эндосомы, тип внутриклеточных везикул (IV), образуются в результате эндоцитоза, а затем созревают в лизосомы. В образовании ВВ участвуют различные внутриклеточные сигнальные пути; кроме того, различные внутренние и внешние стимулы могут повредить внутривенные вливания (например, патогены могут вырваться из ограниченной мембраны во время инфекции и проникнуть в цитоплазму¹). Обычно это сопровождается разрывом эндоцитотических везикул². Таким образом, методы нацеливания и повреждения капельниц могут быть использованы в соответствующих исследованиях³.

Фотодинамическая терапия (ФДТ) - это светозависимая терапия для борьбы с заболеваниями путем уничтожения опухолей или патогенов⁴. При ФДТ клетки-мишени помечаются нетоксичными хромофорами, называемыми фотосенсибилизаторами, которые могут быть локально активированы световым освещением ^5,6. Фотосенсибилизаторы поглощают энергию света и трансформируются в возбужденное синглетное состояние, что приводит к долгоживущему возбужденному триплетному состоянию. Фотосенсибилизаторы триплетного состояния могут подвергаться электронному или энергетическому переносу и образовывать активные формы кислорода (АФК) в присутствии кислорода и могут пространственно разрушать меченые клетки в области^{освещения 7}. Последствия варьируются в зависимости от мощности света⁸. Контролируя концентрацию фотосенсибилизаторов и интенсивность светового освещения, целевые биомолекулы могут быть селективно инактивированы без лизиса клеток, называемого хромофорной инактивацией света (CALI)⁹. Благодаря значительному развитию фотосенсибилизаторов, которые могут избирательно маркировать различные субклеточные мишени, CALI стал ценным инструментом для контроля светоопосредованной инактивации биомолекул для небольших биомолекул, таких как нуклеотиды и белки, а также органелл, таких как митохондрии и эндолизосомы 3,10,11,12,13.

По сравнению с CALI, химические или физические методы также используются для повреждения мембран, такие как бактериальный токсин ^14,15 и лечение лизосомального повреждения Leu-Leu-OMe¹⁶. Однако эти методы показывают объемное нарушение внутривенных вливаний в клетках. Надежные фотосенсибилизаторы (т.е. Al(III)фталоцианинхлориддисульфоновая кислота (AlPcS_2a)) используются в CALI; AlPcS_2a, воздействуя на лизосомы посредством эндоцитоза, используется для разрыва эндосом или лизосом в контролируемой области¹⁷. AlPcS_2a представляет собой непроницаемый для клеточной мембраны хромофор на основе фталоцианина, который связывается с липидом на плазматической мембране и интернализуется посредством эндоцитоза и в конечном итоге накапливается в лизосоме через эндоцитарный путь¹⁸. Он поглощает свет в ближней инфракрасной области спектра и генерирует синглетный кислород, основной АФК, генерируемый возбужденным AlPcS_2a¹⁸. Распад синглетного кислорода быстро ограничивает его диффузию и расстояние реакции в крошечной области в клетках (примерно 10-20 нм)¹⁹. Регулируя продолжительность инкубации AlPcS_2a и световое освещение, допускается пространственно-временной контроль повреждения внутривенных вливаний в субклеточной области. Таким образом, CALI становится мощным инструментом для изучения последствий повреждения внутривенного вливания, а также формирования и регулирования внутривенных вливаний.

В этом исследовании рассматривается конкретный протокол CALI с использованием AlPcS_2a в качестве фотосенсибилизатора. Этот протокол может применяться к различным типам внутривенных вливаний, включая эндосомы и лизосомы, и использоваться для изучения последующих реакций после разрыва мембраны. Для демонстрации этого протокола используются клетки HeLa, экспрессирующие флуорофор-конъюгированный галектин-3^16,20, выявленные после разрыва лизосомы.

протокол

1. Подготовка материала AlPcS_2a

1. Растворите 10 мг AlPcS_2a в 400 мкл 0,1 М NaOH. Для улучшения растворимости нагрейте раствор до 50 °C и встряхните.
2. Смешайте раствор с 4 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS). Затем отфильтруйте раствор фильтром 0,22 мкм, чтобы удалить нерастворимые осадки.
3. Измерьте концентрацию раствора с помощью УФ-ВИД спектрофотометра. Коэффициент экстинкции AlPcS_2a на длине волны 672 нм равен 4 x 10⁴ см-1 ^М-1. Разбавьте раствор AlPcS_2a PBS, чтобы получить раствор 1 мМ. Сделайте 1 мл аликвот и храните при -20 ° C.

2. Трансфекция

ПРИМЕЧАНИЕ: Gal3-GFP применяется в качестве индикатора для визуализации лизосомального разрыва живых клеток.

1. Поддерживайте культуру клеток HeLa в DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). После промывки клеток PBS трипсинизируют клетки, затем ресуспендируют клетки в DMEM с добавлением 10% FBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Метод применим для большинства прикрепленных клеточных линий, включая клеточные линии HeLa и A549. В принципе, несмотря на то, что суспензионные ячейки не тестируются, с ними можно проводить анализы CALI.
2. Разведите 300 нг плазмиды Gal3-GFP в 25 мкл восстановленной сывороточной среды, а затем добавьте 0,6 мкл реагента P3000. Аккуратно перемешайте. Разбавьте 0,45 мкл реагента Lipofectamine 3000 в 25 мкл восстановленной сывороточной среды. Аккуратно перемешайте.
3. Инкубировать 5 минут при комнатной температуре. Смешайте разбавленную ДНК и разбавленный Lipofectamine 3000, а затем инкубируйте в течение 10 мин при комнатной температуре.
4. Смешайте смесь ДНК и липофектамина, 3 x 10⁵ суспендированных клеток HeLa и 200 мкл DMEM + 10% FBS, а затем засейте клетки в центральную стеклянную область стеклянной чашки 35 мм.

3. Окрашивание AlPcS2a

1. Чтобы обеспечить прикрепление клеток, инкубируйте клетки при 37 ° C в инкубаторе, снабженном 5% CO₂, в течение не менее 4 часов.
2. Разбавьте AlPcS 2a в DMEM с добавлением 10% FBS, чтобы получить раствор AlPcS_2a размером 1 мкМ. Предварительно подогрейте среду, содержащую AlPcS_2a, на водяной бане с температурой 37 °C. Замените питательную среду средой, содержащей AlPcS_2a.
3. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C в инкубаторе, снабженном 5% CO₂ , в течение ночи (16-18 часов).
4. На следующий день дважды промойте клетки PBS, чтобы удалить внеклеточный AlPcS2a. Замените среду свежей средой, а затем инкубируйте при 37 ° C в течение 4 часов, чтобы остаточный краситель вдоль эндоцитарного пути накапливался в лизосомах.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для окрашивания эндосом инкубируйте клетки в 1 мкМ AlPcS_2a в DMEM, содержащем 10% FBS, в течение 15 мин при 37 °C. Затем дважды промойте клетки PBS и инкубируйте их в предварительно подогретой среде перед визуализацией.

Рисунок 1. Схематичный рисунок, представляющий селективное внутривенное повреждение AlPcS_2a. На рисунке представлены схемы селективного внутривенного повреждения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2. Лизосомальное окрашивание AlPcS2a. Лизосомы, меченные в течение ночи 1 мкМ AlPcS_2a в клетках HeLa, положительно окрашиваются зеленым флуоресцентным красителем 50 нМ. Масштабная линейка: 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

4. Визуализация образца и световое освещение

ПРИМЕЧАНИЕ: Может быть выполнено внутривенное повреждение в субклеточной области одной клетки или всех клеток, меченных AlPcS_2a, в чашке для культивирования. Объемное освещение всей чашки культуры позволяет количественно изучить это повреждение, в том числе биохимические.

1. Манипулируйте отдельными клетками, повреждая лизосомы внутри одной клетки, как описано ниже.
   1. Поместите чашку с культурой на столик конфокального микроскопа. Используйте лазеры с длиной волны 488 нм и 561 нм для возбуждения GFP и AlPcS2a соответственно.
   2. Обведите область интереса (ROI) размером 5 x 5^мкм2 на везикулах, меченных AlPcS_2a, которые выбраны для повреждения.
   3. Pulse освещает ROI с помощью лазера с длиной волны 633 нм мощностью 0,21 мВт в течение 70 повторов. Следите за образованием Gal3 puncta как индикатора пермеабилизации лизосомальной мембраны.
2. Повредите все меченые клетки в чашке для культивирования, как описано ниже.
   1. Поставьте культурное блюдо на платформу. Осветите тарелку коллимированным светодиодным светом с длиной волны 660 нм (ближний инфракрасный свет идеально подходит для спектра возбуждения AlPcS2a).
   2. Поместите чашку для культивирования на микроскоп и следите за показателями проницаемости мембраны, как указано в шаге 4.1.3.
3. Оцените травму от капельниц, используя следующие показатели.
   1. Содержимое эндосомы или лизосомы наиболее сильно гликозилировано, которое подвергается воздействию цитозоля при внутривенном разрыве. Быстро маркируйте их с помощью цитозольных гликан-связывающих галектинов, включая галектин-1, галектин-3, галектин-8 и галектин-9^16,20.
   2. Размер раны можно определить по высвобождению мембранно-непроницаемого красителя, как описано в²¹.
   3. Разница между эндосомами и лизосомами заключается в значении рН их просвета. Лизосомальный разрыв нарушает рН просвета, который можно измерить с помощью рН-чувствительного красителя, такого как FITC-декстран³.

Рисунок 3. AlPcS 2a-опосредованный CALI индуцирует локальное рекрутирование TagRFP-галектина-3 (Gal3) в лизосомы в области освещения. Лизосомы в клетках HeLa, экспрессируемых TagRFP-галектин-3, окрашивали в течение ночи 1 мкМ AlPcS_2a с последующей фокусировкой освещения ближним инфракрасным светом (633 нм) в пределах желтого квадрата. Сигнал AlPcS 2a в желтом_{квадрате} фотообесцвечивается, что сопровождается образованием точки TagRFP-галектин-3. Масштабная линейка: 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Результаты

На рисунке показана схематическая фигура, представляющая индуцированное AlPcS_2a повреждение внутривенного вливания, включая эндосомы и лизосому (рис. 1).

Коммерчески доступные маркеры могут быть использованы для определения условий окрашивания AlPcS_...

Обсуждение

AlPcS_2a связывается с плазматической мембраной, затем интернализуется эндоцитозом и в конечном итоге накапливается в лизосомах. Таким образом, AlPcS_2a может быть локализован в субклеточных компартментах путем регулировки продолжительности инкубации. Ограничением этой методики...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Al(III) Phthalocyanine Chloride Disulfonic acid (AlPcS2a)	Frontier Scientific	P40632
Culture dish	ibidi	812128-200
Culture Medium			DMEM supplemented with 10% FBS and 100 U/mL penicillin G and 100 mg/mL Streptomycin
DMEM	Gibco	11965092
FBS	Thermo Fisher Scientific	A4736301
Gal3-GFP plasmid	addgene
Lipofectamine 3000 kit	Thermo Fisher Scientific	L3000008
LysoTracker Green DND-26	Thermo Fisher Scientific	L7526	green fluorescent dye
Multiwall plate	perkinelmer	PK-6005550
NaOH	Thermo Fisher Scientific	Q15895
OptiMEM	Thermo Fisher Scientific	31985070
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140163
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	21600-069	137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4
Cell line
HeLa Cell Line	ATCC	CCL-2	The methods are applicable for most of the attached cell lines. Conditions must be determined individually.
Equipments
0.22 µm Filter	Merck	SLGV013SL
Collimated LED Light  (660nm)	Thorlabs	M660L3-C1 and DC2100	Near-infared light is ideal base on the excitation spectrum of AlPcS2a.
Confocal microscopy	Carl Zeiss	LSM 780	An incubation system is required for long-term imaging.
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers	Thermo Fisher Scientific
Red LED light	Tholabs	M660L4-C1