マウスの胸腺内注射のための低侵襲、正確、効率的な技術

要約

本プロトコルは、開腹手術のリスクを回避し、盲検経皮的注射の精度を向上させるためにマウスの胸腺内注射のために確立されたインターベンショナルラジオロジー手順について説明しています。

要約

マウスモデルにおける胸腺内注射は、遺伝的および後天性T細胞障害を含む胸腺および免疫機能を研究するための重要な技術です。これには、試薬および/または細胞を生きているマウスの胸腺に直接沈着させる方法が必要です。胸腺内注射の伝統的な方法には、胸部手術または低侵襲経皮的盲検注射が含まれますが、どちらも重大な制限があります。超高周波超音波イメージング装置により、マウスへの画像誘導経皮注射が可能になり、経皮的注射アプローチの注入精度が大幅に向上し、より小さなターゲットの注入が可能になりました。ただし、画像誘導注入は統合されたレールシステムの利用に依存しているため、これは厳格で時間のかかる手順になります。ここでは、マウスの経皮的胸腺内注射のためのユニークで安全かつ効率的な方法を紹介し、注射のためのレールシステムへの依存を排除します。この技術は、高解像度のマイクロ超音波ユニットを使用してマウス胸腺を非侵襲的に画像化することに依存しています。フリーハンド技術を使用して、放射線科医は超音波検査ガイダンスの下で針先をマウス胸腺に直接配置することができます。マウスは、イメージングの前に洗浄および麻酔される。超音波ガイド下手順に長けた経験豊富な放射線科医にとって、述べられた技術の学習期間は非常に短く、通常は1セッション以内です。この方法は、マウスの罹患率および死亡率が低く、経皮的注射のための現在の機械的支援技術よりもはるかに高速である。これにより、研究者は、動物へのストレスを最小限に抑えながら、あらゆるサイズの胸腺(高齢マウスや免疫不全マウスの胸腺などの非常に小さな臓器を含む)の正確で信頼性の高い経皮注射を効率的に行うことができます。この方法は、必要に応じて個々のローブの注入を可能にし、手順の時間を節約する性質のために大規模な実験を容易にします。

概要

胸腺は、T細胞の発生と免疫に不可欠な役割を果たしています。胸腺退縮、遺伝性疾患、感染症、癌治療などの要因によって引き起こされる可能性のあるT細胞欠乏症は、高い死亡率と罹患率につながります^1,2。マウスモデルは、基礎免疫学研究とトランスレーショナル免疫学研究の両方に不可欠であり、胸腺生物学とT細胞発生の研究、ならびに胸腺機能障害とT細胞欠乏症に苦しむ人々の治療法の開発に何十年にもわたって使用されてきました^3,4,5。

胸腺研究の中心的な部分は、マウスモデル⁶、^7、8、⁹、^10、11、¹²における細胞、遺伝子^、またはタンパク質などの生物学的物質の胸腺内注射でした。従来の胸腺内注射法は、開胸術とそれに続く直接可視化下での胸腺内注射、または縦隔への「盲検」経皮注射を使用する。外科的アプローチは、とりわけ気胸のリスクを大幅に増加させます。さらに、この手術中のストレスの上昇は免疫抑制をもたらし、したがって免疫学的データを損なう可能性があります¹³。経験豊富な研究者は、ある程度の練習の後、ブラインド注射技術を実行できますが、このアプローチは精度が低いため、実験対象を胸腺の大きな若いマウスに限定します。

超音波ガイダンスの利用は、従来の胸腺内注射アプローチに代わる正確で低侵襲の代替手段として導入されています¹⁴。ただし、この手順は、フリーハンド技術の代わりに統合レールシステムを使用する場合に非常に時間がかかります。インジェクションマウントを使用して注入を行うには、トランスデューサのスタンドとマウント、X、Y、Zポジショニングシステムなどのさまざまなアタッチメントを使用したトランスデューサの慎重なイメージングの最適化と位置決め、およびマイクロマニピュレーションコントロールとレールシステムエクステンションの熟練した操作が必要です。簡単な代替技術である超音波ガイド下胸腺注射が、上記の方法に対する迅速かつ正確な低侵襲代替手段であるフリーハンドアプローチ¹⁵を使用して放射線科医によって実行されることをここに提示する。重要なことに、現在のアプローチは、注入マウントと統合されたレールシステムを必要とせずに、高解像度の超音波イメージングシステムで実行できます。これは、多数のマウス¹¹の注射を必要とする研究、両方の胸腺葉の注射を含む実験、または老化、照射、または免疫不全マウス¹²における小さな胸腺の正確な注射に特に有用である。

プロトコル

すべての手順は、発見とイノベーションセンターの動物飼育ガイドライン(IACUCプロトコル290)に従って実行されました。本研究では、C57BL/6マウス(雌、4-6週齢)、C57BL/6マウス(雌、6ヶ月齢)、J:NU雌マウス、NODシドガンマ(NSG)雌マウス、およびB6;CAG-luc、-GFPマウスを、それぞれ若齢マウスモデル、高齢マウスモデル、胸腺ヌードモデル、免疫不全モデル、および生物発光細胞源として用いた。マウスは市販の供給源から入手した( 材料表参照)。この手順では、通常、2人が必要です(1人は注射中に無菌状態を維持し、もう1人はマウスを取り扱うため)。

1.動物の準備

1. 3%〜4%のイソフルランガスを使用してマウスに麻酔を誘発し、ノーズコーンと精密に校正された気化器を介して投与された1%〜3%のイソフルランガスを使用して麻酔を維持します(材料の表を参照)。
2. 後足のつまみに対する無反応により、適切な麻酔深度/無意識を確認します。
3. 脱毛クリームの薄層を1分未満塗布することにより、マウスの前胸部から毛皮を取り除きます。濡れたペーパータオルを使用して、ゆるい毛皮と一緒にクリームを完全に取り除きます。
   注意: クリームを塗りすぎると、胸部の皮膚が炎症を起こします。
4. ノーズコーンを所定の位置に置いた状態で、小動物超音波画像ステーション( 材料の表を参照)の加熱されたプラットフォームに一度に1匹ずつマウスを仰臥位で置きます(図1)。
5. マウスを後肢と前肢の医療用粘着テープでステージに固定します(図1)。
6. 眼科用軟膏を両目に塗り、角膜の乾燥を防ぎます。
7. クロルヘキシジングルコン酸アプリケーターを使用して、毛皮のない胸部上部皮膚を消毒します( 材料の表を参照)。

2.超音波装置と無菌フィールドの準備

1. 利用可能な最高周波数リニアプローブ、通常は画像化される動物のサイズに対して最高の空間分解能を持つプローブをアクティブにします。起動画面の後に対応するボタンをタップして、プローブをアクティブにします。
   注:マウスを使用したこのアプリケーションでは、使用されるプローブはマウスおよび小型ラットで使用するために特別に設計されています(材料の表を参照)。
2. 以下の手順に従って、イメージングと注射の超音波設定を最適化します。
   1. 画面右側の垂直方向のスライダーを調整し、視野の深さを対象動物に適したサイズに調整します(図2)。最大深度設定は、通常、若いマウスの場合、約6〜8 mmになります。
   2. 画面下部の水平バーに沿ってボタンをスライドさせて、グレースケールゲインを調整します(図2)。目標は、通常の「灰色」の外観よりもわずかに暗い画像から始めることです。
   3. 焦点ゾーン(画面の右側の青い矢印、 図2)を胸腺の予想されるレベルに調整します。若いマウスの場合、これは約4 mmの深さになります。
   4. イメージ キャプチャが必要な場合は、[ イメージの保存 ] ボタンと [ クリップの保存 ] ボタンの機能をテストして、手順全体でイメージを適切に保存できることを確認します。画面の右下にある [クリップの保存 ]ボタンをタップするか、[ フリーズ ]ボタンをタップしてから[ 画像を保存 ]をタップして、これを実行します(図2)。
3. 少量(~1 mL)の超音波ゲルをトランスデューサーの表面( 材料の表を参照)に、超音波装置ホルダーまたは助手の手に置いた状態で直立させて塗布します。
4. 加熱されたプラットフォームの隣に小さな滅菌フィールドを準備します。これに最適な位置決めは、通常、プラットフォームと超音波装置の間です。
   1. これらのアイテムを滅菌フィールドに空にします:滅菌プローブカバー、輪ゴム、滅菌手袋、および滅菌超音波ゲル( 材料の表を参照)。
   2. 滅菌フィールドをセットアップし、アイテムを配置したら、滅菌手袋を着用します。
   3. 滅菌プローブカバーを超音波トランスデューサーの上(および最初にプローブに配置したゲルの上)に慎重に配置します。無菌性を維持し、滅菌カバーにのみ触れてください。滅菌輪ゴムを滅菌プローブカバーの上にスライドさせて、所定の位置に保ちます。
      注意: 空気の焦点は、サイズに関係なく、超音波イメージングを妨げる可能性があります。したがって、超音波プローブと動物の間に空気のないインターフェースを確保するために、トランスデューサーと滅菌プローブカバーの間、およびプローブカバーの上に超音波ゲルを適用することが不可欠です。
   4. 適量(2〜3 mL)の滅菌超音波ゲルをトランスデューサーに置きます。
      注意: これで、麻酔をかけたマウスを画像化する準備が整いました。

3.胸腺のイメージングと位置特定

1. 無菌性を維持しながら、初期イメージングのために、超音波ゲルトッププローブをマウスの前胸壁の消毒部分に垂直に置きます。
   1. 超音波画像を見て、さらに最適化してください。手順 2.2 に戻り、 図 3 のような外観になるように調整します。
2. 横面でマウスの前胸部をスキャンします。これを実行するには、トランスデューサーを垂直に持ち、絵筆のような、または「スイープ」の動きで首から腹部まで上下に動かします。
   注:心臓は、その急速な動きと「チャンバー化された」外観により、胸部で最も有名な構造になります。心臓が局在化されると、これを胸腺の画像を取得するための基準点として使用できます。
3. 心臓を視野の中央に向け、トランスデューサーを首に向かって少しスイープします。心臓よりもちょうど上に、胸腺は通常遭遇します。
4. 胸腺を、正中線の中央、大動脈の前方、胸骨の後方にある二葉、ピラミッド型、低エコー(画面に表示される「暗い」または「黒」)の構造として視覚化します(図3A)。
5. 胸の上部の両側にある2つの丸いペアの黒い(つまり、「低エコー」)構造に注意してください。
   注:これらは両側大静脈です。大動脈は、2つの大静脈の間の正中線における同様の曲線低エコー構造である。これらは、脈動の動きによって簡単に認識できます。

4.胸腺の注射

1. 必要に応じて、さらに(2〜3 mL)滅菌超音波ゲルをトランスデューサーに塗布します。
   注:トランスデューサー上の比較的大量の滅菌ゲル(マウスの胸部のサイズと比較して)は、マウスの胸壁の周りの「ゲルパッド」として機能します。これにより、視野内の空気によって行われる超音波アーチファクトの数が減少します。
2. 超音波プローブを使用して、通常は注射の理想的な標的部位である胸腺の最も広い部分を見つけます。選択した場所で水平方向の針の軌道を予測します。
   1. 主要な血管(SVCと大動脈)がこの部位のどこにあるかに注意してください。注射中はこれらを避けてください。
   2. 血管は、ステップ3.7で説明されているように、低エコーの拍動構造になります。不明な場合は、カラードップラーモードを使用して容器内の流れを確認します(図4A)。画面上の カラー ボタンをタップして、カラードップラーモードをアクティブにします。
   3. 主要な血管の1つ(または心臓)が予想される針の軌道に沿っていると予想される場合は、新しいターゲット領域を選択するか、別のアプローチ/軌道を見つけます。
3. 片手にトランスデューサーを持ち、もう片方の手に30 Gのインスリン針( 材料の表を参照)を持ち、もう片方の手に10 μLの注射液を入れます。
   注:注入液は実験デザインによって異なります。本研究では、リン酸緩衝生理食塩水、トリパンブルー、またはD-ルシフェリン(0.1μg/10μL)を使用しました。
4. 注入プロセスを開始するには、胸腺が超音波視野の中心から外れるようにトランスデューサーを横方向に動かします。視野の反対側が主に超音波ゲルで構成され、他には何も含まれていないことを確認してください。
5. 針の先端をトランスデューサーの下のゲルに入れ、皮膚表面に隣接して視覚化されるまで針をゆっくりと動かします(図4B)。
6. 超音波下で針を連続的にイメージングしながら、血管から離れた経皮軌道で胸腺に針を挿入します。
   1. 「クロス胸腺」水平軌道を使用して、針先を入口部位の反対側の胸腺葉に配置します。これは、針管に沿った潜在的な漏れを説明しています(図5A)。
7. 針先が胸腺の目的の部分に入ったら、超音波視覚化を使用しながら、30 Gシリンジから内容物(10 μLのトリパンブルーまたはD-ルシフェリン、0.1 μg / 10 μLなど)をすばやく注入します。
   1. 針の挿入および注入中にシリンジを安定させるには、シリンジを親指と人差し指の間に保持し、人差し指でシリンジプランジャーを制御します。
8. すべての内容物が堆積した後、針を取り外します。

5.動物の注射後のモニタリング

1. 動物を空のケージに移し、胸骨横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで観察します。
   注:麻酔からの完全な回復は2分以内に起こると予想されます。
2. 動物をさらに10分間監視して、苦痛、呼吸困難、または出血の兆候がないか確認します。
   注:注射後の痛みは予想されず、通常、注射後の痛みは必要ありません。
3. 完全に回復し、注射後の観察期間が平穏になったら、注射した動物を他の動物の会社に戻します。

結果

この手法の実装を成功させるには、従うべきいくつかの重要な手順が必要です。第一に、胸腺自体の確実な識別が保証されなければならない。若いマウスでは、腺のサイズが大きいため、これは簡単です(図3A)。年配のマウスまたは免疫不全マウスでは、それはより困難な場合があります。しかし、それはまだ現代の超音波装置で非常に実行可能です(図3B...

ディスカッション

超音波ガイドフリーハンド注射は、効率的かつ無菌的な方法で胸腺に研究材料を送達するための非常に正確な技術です。注射部位での皮膚の最初の滅菌に続いて、滅菌手袋、滅菌超音波プローブカバー、および滅菌超音波ゲルの使用により、処置中に無菌性が維持されます。マウスの胸腺内注射に一般的に使用される方法である胸腺^18,19の直接視覚化のための外科的切開に?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aquasonic 100 Ultrasound Gel	Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA)	01-01	Sterile Ultrasound Transmission Gel
B6;CAG-luc, -GFP mouse	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	025854	Bioluminescence cell source
BD Insulin Syringes with needle	Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA)	328431	Ultra-fine needle - 12.7 mm, 30 G
C57BL/6 mouse - aged	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	000664	age 6 months old; aged model
C57BL/6 mouse - young	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	000664	age 4-6 weeks; young model
Chloraprep One-step 0.67 mL	CareFusion (El Paso, TX, USA)	260449	chlorhexidine gluconate applicator
Curity Cotton Tipped Applicator	Cardinal Health (Dublin, OH, USA)	A5000-2	Sterile, 6"
D-Luciferin	Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA)	LUCK-1G
Isoflurane	Henry Schein (Melville, NY, USA)	1182097
IVIS Lumina X5	PerkinElmer (Melville, NY, USA)	n/a	In vivo bioluminescence imaging system
J:NU mouse	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	007850	Athymic nude model
Kendall Hypoallergenic Paper Tape	Cardinal Health (Dublin, OH, USA)	1914C
Kimtech Surgical Nitrile Gloves	Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA)	56892	Sterile Gloves
Nair Hair Remover Lotion	Church and Dwight (Trenton, NJ, USA)	n/a	Depilatory agent
NOD scid gamma (NSG) mouse	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	005557	Immunodeficient model
Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x	Corning (Corning, NY, USA)	21-040-CV
Puralube Vet Ointment	Med Vet International	PH-PURALUBE-VET	Eye ointment
Sheathes	Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA)	10040	Sterile Ultrasound Probe Covers
Sure-Seal Induction Chamber	Braintree Scientific (Braintree, MA, USA)	EZ-17 85	Anesthesia induction chamber
Transducer MX550D	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Vevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz)
Trypan Blue, 0.4% solution in PBS	MP Biomedicals (Solon, OH, USA)	91691049
Vevo 3100 Imaging System	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Ultrasound imaging system
Vevo 3100 Lab Software	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Version 3.2.7 for imaging and analysis
Vevo Compact Dual Anesthesia System	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Tabletop isoflurane-based anesthesia unit
Vevo Imaging Station	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Procedural platform