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要約

このプロトコルは、遺伝子発現および組織学的分析のためのマウス子宮内膜上皮オルガノイドを確立するための方法論を説明しています。

要約

子宮内膜組織は子宮の内腔を裏打ちし、エストロゲンとプロゲステロンの周期的な制御下にあります。これは、管腔および腺上皮、間質コンパートメント、血管網、および複雑な免疫細胞集団で構成される組織です。マウスモデルは子宮内膜を研究するための強力なツールであり、着床、胎盤形成、および癌を制御する重要なメカニズムを明らかにしています。3D子宮内膜オルガノイド培養の最近の開発は、子宮内膜生物学の根底にあるシグナル伝達経路を解剖するための最先端のモデルを提示します。遺伝子操作されたマウスモデルから子宮内膜オルガノイドを確立し、それらのトランスクリプトームを解析し、単一細胞分解能でそれらの形態を視覚化することは、子宮内膜疾患の研究にとって重要なツールです。本論文では、マウスの子宮内膜上皮の3D培養を樹立する方法を概説し、遺伝子発現を定量化し、オルガノイドの組織像を解析する技術について説明します。目標は、子宮内膜上皮オルガノイドの遺伝子発現と形態学的特徴を確立、培養、および研究するために使用できるリソースを提供することです。

概要

子宮内膜 - 子宮腔の内層粘膜組織 - は、女性のリプロダクティブヘルスに重要な役割を果たすユニークで非常に動的な組織です。生殖寿命の間、子宮内膜は卵巣ホルモン - エストロゲンとプロゲステロンの協調作用によって調整されて、増殖、分化、および分解の数百サイクルを経験する可能性を秘めています。遺伝子操作マウスの研究により、ホルモンに対する子宮内膜の反応と、胚着床、間質細胞の脱落膜化、妊娠の制御を支える基本的な生物学的メカニズムが明らかになりました1。しかし、in vitro研究は、従来の2D細胞培養で形質転換されていない初代マウス子宮内膜組織を維持することが困難であるため、制限されていました2,3。3D臓器系(オルガノイド)としての子宮内膜組織の培養における最近の進歩は、子宮内膜細胞の再生と分化を制御する生物学的経路を研究する新しい機会を提供します。マウスおよびヒトの子宮内膜オルガノイドシステムは、さまざまなマトリックスに封入された純粋な子宮内膜上皮から開発されており4,5、ヒト子宮内膜は足場のない上皮/間質共培養6,7として、最近ではコラーゲンカプセル化された上皮/間質集合体として培養されています8。.上皮オルガノイド培養の成長と再生の可能性は、オルガノイドの成長と再生を最大化するように経験的に決定された成長因子と低分子阻害剤の定義されたカクテルによってサポートされています4、5、9。さらに、子宮内膜オルガノイドを凍結および解凍する能力により、将来の研究のためにマウスおよびヒト由来の子宮内膜オルガノイドの長期的なバンクが可能になります。

遺伝子操作マウスは、妊娠初期と脱落膜化を制御する複雑なシグナル伝達経路を明らかにし、妊娠喪失、子宮内膜がん、子宮内膜症のモデルとして使用されています。これらの遺伝学的研究は、女性の生殖組織で特異的に活性なcreリコンビナーゼを使用して、loxP隣接対立遺伝子(「floxed」)の細胞特異的欠失によって大部分達成されました。これらのマウスモデルには、広く使用されているプロゲステロン受容体-cre10(子宮内膜上皮組織および間質組織で強力なリコンビナーゼ活性を有する)、成体マウスにおいて子宮内膜上皮組換えを誘導するラクトフェリンi-cre11、またはミュラー管由来組織において上皮特異的欠失を引き起こすWnt7a-creが含まれる12。.遺伝子操作されたマウスモデルから子宮内膜組織を3Dオルガノイドとして培養することは、子宮内膜生物学を調査し、子宮内膜細胞の再生と分化を制御する成長因子とシグナル伝達経路の同定を容易にする絶好の機会を提供しました13,14。マウス子宮内膜組織の単離および培養のための方法は文献に記載されており、その後の子宮内膜上皮オルガノイドの培養のための子宮上皮の単離のための様々な酵素戦略の使用を報告している4。以前の文献は子宮内膜上皮オルガノイド培養プロトコル4,5,6の重要なフレームワークを提供しますが、この論文はこれらのオルガノイドを生成、維持、処理、および分析するための明確で包括的な方法を提供します。これらの技術の標準化は、女性の生殖生物学の分野における進歩を加速させるために重要です。ここでは、ゲルマトリックス足場での子宮内膜オルガノイドのその後の培養のためのマウス子宮内膜上皮組織の酵素的および機械的精製のための詳細な方法論を報告します。また、ゲルマトリックス封入マウス子宮内膜上皮オルガノイドの下流組織学的および分子学的解析の方法論についても説明します。

プロトコル

マウスの取り扱いと実験的研究は、ベイラー医科大学の施設内動物管理使用委員会(IACUC)によって承認されたプロトコルと、実験動物の世話と使用のためのNIHガイドによって確立されたガイドラインの下で実施されました。

1.酵素的および機械的方法を用いたマウスからの子宮上皮の単離

注:このセクションでは、ゲルマトリックススキャフォールドを使用してマウスから上皮子宮内膜オルガノイドを確立、継代、凍結、および解凍するために必要な手順について説明します。以前の研究では、マウス子宮内膜オルガノイドの最適な培養物が発情期4の間にマウスから確立されることが決定されており、これは膣スワブ15の細胞学的検査によって決定することができる。成体雌WTマウス(6〜8週齢、ハイブリッドC57BL/6Jおよび129S5/SvEvBrd)を全ての実験に使用した。マウスは、IACUC承認のガイドラインに従って、イソフルラン鎮静とそれに続く子宮頸部関節脱離を使用して人道的に安楽死させた。マウスを安楽死させたら、次の手順に従う必要があります。このプロトコルで使用される材料とソリューションに関連する詳細については、 材料の表 を参照してください。

  1. 使用前に、ゲルマトリックスを氷上で約1〜2時間解凍します。
  2. マウスを解剖するには、ハサミを使用して腹部を中線切開し、皮膚をそっと剥がして下にある腹膜層を露出させます。鉗子を使用して腹膜層を支え、ハサミで横方向を切開して腹部の内容物を露出させます。
    1. 腹部の脂肪パッドをそっと脇に動かして、子宮角を見つけます。最初に頸部接合部でそれらを保持し、ハサミを使用して腸間膜脂肪に沿って切断することによってそれらを解剖します。マウスの子宮を解剖した後、小さなハサミで子宮角から脂肪組織を完全に取り除きます。
      注:使用前にすべての手術器具を滅菌することにより、細胞分離中の無菌性を維持し、マウスの腹部に70%エタノールをスプレーし、滅菌組織培養フードの下で解剖後のすべての手順を実行します。
  3. 各子宮角をそれぞれ約4〜5 mmの小さな断片に切ります。
  4. 1つの子宮からのすべての子宮断片を、0.5 mLの1%トリプシンを含む24ウェルプレートの1ウェルに入れます。酵素溶液が子宮内腔に入るのを許し、子宮内膜上皮を下にある間質から酵素的に分離させる。
  5. 24ウェルプレートを37°Cの加湿組織培養インキュベーター内で約1時間インキュベートします。
  6. 1時間のインキュベーション後、子宮の断片を、1 mLのダルベッコリン酸緩衝溶液(DPBS)を含む35 mm組織培養プレートに移します。
  7. 解剖顕微鏡下で、細かい鉗子と1 mLピペットを使用して、子宮上皮を子宮管から機械的に分離します。子宮片片の一端を鉗子で押さえながら、ピペットチップを断片を縦方向にゆっくりと動かし、子宮管のもう一方の端から上皮を絞り出します。子宮断片から分離した上皮シートを解剖顕微鏡で観察する。
  8. 1 mLピペットを使用して上皮シートを回収し、1.5 mLチューブに穏やかに移します。
  9. 残りの子宮片についてもこのプロセスを繰り返し、すべての上皮シートを同じ収集チューブに移します。
  10. 解離した上皮シートを375 × gで5分間遠心分離することによりペレット化する。
  11. 細胞ペレットを乱さないように上清を慎重に取り除きます。
  12. 細胞ペレットを0.5 mLの2.5 mg/mLコラゲナーゼ+ 2 mg/mLのDNase溶液に再懸濁します。ピペットで上下に約10倍、またはシングルセル懸濁液が得られるまで。
  13. 0.5 mLのDMEM/F12 + 10%ウシ胎児血清(FBS)+抗生物質を加え、細胞を375 × gで5分間遠心分離します。
    注:細胞培養に使用される広域抗生物質の詳細については、 材料表を参照してください。
  14. 上清を注意深く除去し、1 mLのDMEM/F12 + 10%FBS +抗生物質に細胞を再懸濁します。細胞を375 × gで5分間遠心分離します。

2.間質コンパートメントの処理

注:このセクションでは、マウス子宮内膜の間質コンパートメントを分離するために必要なプロトコルの概要を説明します。上皮/間質共培養実験への関心が高まっていることを考えると、オルガノイドを生成する上皮細胞に加えて、間質細胞集団を処理できることが重要です。

  1. すべての上皮が子宮片から酵素的および機械的に分離されると、残りの管状構造は「間質/子宮筋層」コンパートメントです。この組織をHBSS溶液中の2.5 mg / mLコラゲナーゼ+ 2 mg / mLDNaseに集めます。
  2. 間質/子宮筋層サンプルを37°Cのシェーカーで15分間インキュベートします。
  3. インキュベーション後、マウスあたり500 μLのDMEM/F12 + 10%FBS + 抗生物質を加え、解離していないフラグメントを40 μmのセルフィルターでろ過します。
  4. 375 × gで5分間遠心分離することにより細胞をペレット化します。
  5. 上清を注意深く除去し、細胞ペレットを1 mLのDMEM/F12 + 10%FBS +抗生物質に再懸濁します。混合物を10 cm細胞培養プレート内のDMEM/F12 + 10%FBS +抗生物質10 mLに滴下します。プレートを加湿した細胞培養インキュベーター内で37°Cでインキュベートします。
  6. マウス子宮内膜上皮細胞および間質細胞の共培養を生成するには、スキャフォールドフリーまたはコラーゲンマトリックス系を使用するヒト子宮内膜オルガノイドについて記載された方法に従う6、8。
    注:これらの技術はまだマウスに対して公開されていませんが、ヒト子宮内膜で公開されているプロトコルに基づいて適応させることができます。

3. 子宮上皮をゲルマトリックスに封入し、オルガノイドを樹立

注意: 使用する準備ができるまで、ゲルマトリックスを氷の上に置いておきます。

  1. 上清を除去し、細胞ペレットの20倍の量のゲルマトリックスに細胞ペレットを再懸濁します(すなわち、細胞ペレットが20 μLの場合は、400 μLのゲルマトリックスで細胞を再懸濁します)。気泡が発生しないように、ペレットを注意深く再懸濁します。
  2. ゲルマトリックス/細胞懸濁液を室温で~10分間沈降させます。
  3. ゲルマトリックス/細胞懸濁液が半固体ゲルになったら、200 μLのワイドボアチップを備えたP200マイクロピペットを使用して、25 μLのゲルマトリックス/細胞懸濁液を穏やかに吸引します。12ウェルプレートのウェルごとに3つの別々の25 μLドームを分注し、37°Cの加湿組織培養インキュベーターでゲルマトリックスを15分間硬化させます。
  4. ゲルマトリックスが硬化したら、ゲルマトリックスドームを含む各ウェルに750 μLのオルガノイド培地を追加します。加湿した組織培養インキュベーター内で37°Cでインキュベートします。
    注:オルガノイド培地の処方は、 材料の表に記載されています。オルガノイドは通常、最初の培養から4日以内に形成されます。

4. エストラジオール投与後の子宮内膜オルガノイドの遺伝子発現解析

注:このセクションでは、エストラジオールによる処理後のリアルタイムqPCRを使用して子宮内膜上皮オルガノイドの遺伝子発現をプロファイリングするために使用される方法について説明します(E2;表1を参照)。子宮内膜は卵巣ホルモンE2の周期的な制御下にあるため、E2に対するオルガノイドの反応性をテストすることは、生理学的機能の重要な尺度です。高品質のRNAを取得し、子宮内膜上皮オルガノイドからqPCRおよび/またはRNAシーケンシングを使用して遺伝子発現をプロファイリングするのに十分なmRNAを生成しました。このセクションでは、オルガノイドを収集し、遺伝子発現のダウンストリーム解析のためにそれらを処理する方法について説明します。選択された処理培地は、培養子宮内膜細胞を処理するために使用されるものを反映しています。しかしながら、この治療培地は、ホルモン8、16、17によるヒト子宮内膜3D培養物の治療のために行われるように、それに応じて最適化され得ることに留意すべきである。

  1. 上記のように子宮内膜オルガノイドを培養する。
  2. オルガノイド培地を取り出し、播種の4日後に750 μLの飢餓培地と交換します。一晩インキュベートします。
  3. 翌朝、飢餓培地を取り除きます。ビヒクルまたは10 nM E2を含む750 μLの治療培地を追加します。48時間インキュベートします。
  4. キットメーカーのプロトコルに従ってRNA単離を進めてください。

5. 子宮内膜オルガノイドの組織学的解析

注:子宮内膜オルガノイドの形態学的特徴を画像化することは、成長因子、遺伝子操作、または低分子阻害剤の細胞効果を評価するために重要です。このセクションでは、組織学的染色と抗体免疫蛍光染色を使用して子宮内膜上皮オルガノイドを固定、処理、および画像化するために使用される技術について説明します。

  1. 1 mLの4%パラホルムアルデヒドを1x PBSで含む1.5 mLの微量遠心チューブを準備します。それらを氷の上に置きます。
  2. オルガノイドを含む12ウェルプレートのウェルから培地を吸引する。
  3. チップをカットした1 mLピペットチップを使用して、500 μLの4%パラホルムアルデヒドを各ウェルに移し、ゲルマトリックスドームをプレートの底から静かに取り外します。
  4. ゲルマトリックスドーム全体をピペットチップに静かに吸引し、1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。
  5. オルガノイドを4°Cのローテーターに一晩置き、固定します。
  6. 翌朝、チューブを600 × g で5分間遠心分離し、オルガノイドをペレット化します。4%パラホルムアルデヒド溶液をピペットで静かに取り除き、廃棄します。オルガノイドを70%エタノールで2回洗浄します。
  7. 最後の洗浄後、50〜100μLを除くすべてのエタノールをチューブから取り除きます。チューブを脇に置きます。
  8. 試料処理ゲルのチューブを水浴に入れ、電子レンジで~30秒間マイクロ波でゲルを溶かします。ゲルの粘稠度を監視して、検体処理ゲルが沸騰しないようにします。
    注:試料処理ゲルが溶けても熱く沸騰しなかったら、オルガノイドをカプセル化するために迅速に作業します。
  9. 金型の表面全体を覆うのに十分な試料処理ゲル(約250μL)を移します。
  10. 検体処理ゲルがまだ溶融している間に、オルガノイドを含む50 μLの70%エタノール溶液を素早く移します。オルガノイドが沈んでいるか、金型の底部に押し込まれていることを確認します。
  11. 組織学型を氷の入ったバケツの上に置き、標本処理ゲルを冷まして固化させます。
  12. 検体処理ゲルが完全に乾いたら、オルガノイドが配置されている平面を追跡しながら、標本処理ゲルの正方形を標本バッグに慎重に移します。
  13. バッグを組織学カセットに入れ、組織のホルマリン固定およびパラフィン包埋に使用される標準的な方法を用いて処理する18。
  14. パラフィンに固定および包埋した後、ミクロトーム19を用いて5μm切片に切片化する。以下に概説するように、標準的なヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)染色または免疫染色手順を進めてください。

6. ヘマトキシリン&エオジン染色

  1. 次のように切片を脱パラフィンする:キシレン、2 x 10分;100%エタノール、2 x 3分;80%エタノール、3分;60%エタノール、3分;dH 2 O,2x 3 分;ヘマトキシリンで1分;水道水(3 x 5秒);エオシンで1分。
  2. 次のように切片を脱水する:60%エタノール、3分;80%エタノール、3分;95%エタノール、3分;100%エタノール、2 x 3分;キシレン、2 x 15分
  3. 封入剤を使用してマウントします。

7. 免疫蛍光染色

  1. 手順6.1の説明に従ってセクションをパラフィン除去します。
  2. 抗原賦活化の実行
    1. スライドをマイクロ波対応容器の抗原賦活化溶液に浸します。
    2. 溶液が沸騰しないように5分間隔を使用して、強火で20分間電子レンジで加熱します。
  3. 20分間の抗原賦活化ステップが完了したら、抗原賦活化バッファーに浸したまま、スライドを氷上で40分間冷却します。
  4. スライドを1x TBSTで3分間洗浄します
  5. TBST中の3%BSA中で室温で1時間インキュベートすることにより、スライドをブロックします。
  6. 一次抗体インキュベーション
    1. 抗体をTBSTの3%BSAで希釈します(Abに応じて1:50-1:1,000)。
    2. 加湿チャンバー内で4°Cで一晩インキュベートします。
    3. TBSTで3 x 5分洗ってください。
  7. 二次抗体インキュベーション
    1. 抗体を3%BSA(TBST)(1:250)または5%正常ロバ血清で希釈します。
    2. 抗体は蛍光色素に結合しているため、暗所で室温(RT)で1時間インキュベートします。
  8. 核染色
    1. 4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)をTBSTで1:1,000に希釈します。
    2. RTで5分間インキュベートします。
    3. TBSTで2 x 5分洗ってください。
  9. マウンティング
    1. 1滴の封入剤を使用してカバーガラスを取り付けます。
    2. 翌日、マニキュアを使用してカバーガラスを密封します。

結果

マウス子宮内膜オルガノイドの位相差画像
添付のプロトコルに記載されているように、WTマウス子宮内膜上皮からオルガノイドを樹立しました(図 1の図を参照)。マウス子宮内膜上皮の酵素的解離に続いて、上皮シートを子宮間質細胞から機械的に分離し、さらにコラゲナーゼで解離して単一細胞懸濁液を生成した。この上皮細胞と間質細胞分離の方法を?...

ディスカッション

ここでは、マウス子宮内膜から子宮内膜上皮オルガノイドを生成する方法と、それらのダウンストリーム分析に日常的に使用されているプロトコルについて説明します。子宮内膜オルガノイドは、子宮内膜症、子宮内膜がん、着床不全などの子宮内膜関連疾患を制御するメカニズムを研究するための強力なツールです。2017年に発表された画期的な研究では、マウスおよびヒト上皮由来の子宮...

開示事項

著者は開示する利益相反を持っていません。

謝辞

ステファニー・パンガス博士とマーティン・M・マツク博士(M.M.M.)には、私たちの原稿を批判的に読み、編集していただき、ありがとうございます。研究は、 Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development Grants R00-HD096057 (D.M.), R01-HD105800 (D.M.)、R01-HD032067 (M.M.M.)、R01-HD110038 (M.M.M.)、およびNCI-P30 Cancer Center Support Grant(NCI-CA125123)の支援を受けた。ダイアナ・モンシバイス博士は、バロウズウェルカム基金から次世代妊娠賞を受賞しています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Organoid Media Formulation
NameCompanyCatalog NumberFinal concentration
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-freeCorning354230100%
Trypsin from Bovine PancreasSigma AldrichT1426-1G1%
Advanced DMEM/F12Life Technologies126340101X
N2 supplementLife Technologies175020481X
B-27™ Supplement (50X), minus vitamin ALife Technologies125870101X
PrimocinInvivogenant-pm-1100 µg/mL
N-Acetyl-L-cysteineSigma AldrichA9165-5G1.25 mM
L-glutamineLife Technologies250300242 mM
NicotinamideSigma AldrichN0636-100G10 nM
ALK-4, -5, -7 inhibitor, A83-01Tocris2939500 nM
Recombinant human EGFPeprotechAF-100-1550 ng/mL
Recombinant human NogginPeprotech120-10C100 ng/mL
Recombinant human Rspondin-1Peprotech120-38500 ng/mL
Recombinant human FGF-10Peprotech100-26100 ng/mL
Recombinant human HGFPeprotech100-3950 ng/mL
WNT3aR&D systems5036-WN200 ng/mL
Other supplies and reagents
NameCompanyCatalog NumberFinal concentration
Collagenase from Clostridium histolyticumSigma AldrichC0130-1G5 mg/mL
Deoxyribonuclease I from bovine pancreasSigma AldrichDN25-100MG2 mg/mL
DPBS, no calcium, no magnesiumThermoFisher14190-2501X
HBSS, no calcium, no magnesiumThermoFisher141701121X
Falcon Polystyrene Microplates (24-Well)Fisher Scientific#08-772-51
Falcon Polystyrene Microplates (12-Well)Fisher Scientific#0877229
Falcon Cell Strainers, 40 µmFisher Scientific#08-771-1
Direct-zol RNA MiniPrep (50 µg)Genesee Scientific11-331
Trizol reagentInvitrogen15596026
DMEM/F-12, HEPES, no phenol redThermoFisher11039021
Fetal Bovine Serum, Charcoal strippedSigma AldrichF6765-500ML2%
Estratiol (E2)Sigma AldrichE1024-1G10 nM
Formaldehyde 16% in aqueous solution, EM GradeVWR157104%
Epredia Cassette 1 Slotted Tissue CassettesFisher Scientific1000961
Epredia Stainless-Steel Embedding Base MoldsFisher Scientific64-010-15 
Ethanol, 200 proof (100%)Fisher Scientific22-032-601 
HistoclearFisher Scientific50-899-90147
Permount Mounting MediumFisher Scientific50-277-97
Epredia Nylon Biopsy BagsFisher Scientific6774010
HistoGel Specimen Processing GelVWR83009-992
Hematoxylin solution PremiumVWR95057-844
Eosin Y (yellowish) solution PremiumVWR95057-848
TBS Buffer, 20X, pH 7.4GenDEPORTT80541X
TBST (10X), pH 7.4GenDEPORTT80561X
Citric acid Sigma AldrichC0759-1KG
Sodium citrate tribasic dihydrateSigma AldrichS4641-500G
Tween20Fisher ScientificBP337-500 
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma AldrichA2153-100G3%
DAPI Solution (1 mg/mL)ThermoFisher622481:1000 dilution
VECTASHIELD Antifade Mounting MediumVector LabsH-1000-10
Clear Nail PolishFisher ScientificNC1849418
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific22037246
VWR Micro Cover GlassesVWR48393-106
SuperScript VILO Master MixThermoFisher11755050
SYBR Green PCR Master MixThermoFisher4364346
Krt8 Antibody (TROMA-I) DSHBTROMA-I 1:50 dilution
Vimentin AntobodyCell Signaling5741S1:200 dilution
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 594		ThermoFisherA-212091:250 dilution
Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 488		ThermoFisherA-212061:250 dilution
ZEISS Stemi 508 Stereo MicroscopeZEISS
ZEISS Axio Vert.A1 Inverted Routine Microscope with digital cameraZEISS
Primer SequenceForward (5'-3')Reverse (5'-3')_
Lipocalin 2 (Lcn2)GCAGGTGGTACGTTGTGGGCTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC
Lactoferrin (Ltf)TGAGGCCCTTGGACTCTGTACCCACTTTTCTCATCTCGTTC
Progesterone (Pgr)CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTCTAACTTCAGACATCATTTCCGG
Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (Gapdh)CAATGTGTCCGTCGTGGATCTGCCTGCTTCACCACCTTCTT

参考文献

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