患者由来の腫瘍サンプルから3次元スフェロイドを樹立し、薬物に対する感受性を評価

要約

本プロトコルは、初代がん細胞から3D腫瘍培養モデルを生成し、細胞生存率アッセイおよび顕微鏡検査を使用して薬物に対するそれらの感受性を評価することを記載しています。

要約

腫瘍生物学の理解は目覚ましい進歩を遂げているにもかかわらず、臨床試験に入る腫瘍薬候補の大多数は、多くの場合、臨床効果の欠如が原因で失敗します。この高い失敗率は、主に腫瘍の不均一性と腫瘍の微小環境を反映する上での不十分なために、現在の前臨床モデルが臨床効果を予測できないことを明らかにしています。これらの制限は、個々の患者に由来するヒト腫瘍サンプルから確立された3次元(3D)培養モデル(スフェロイド)で対処できます。これらの3D培養は、腫瘍の不均一性を反映しない確立された細胞株よりも現実世界の生物学をよりよく表しています。さらに、3D培養は、低酸素、壊死、細胞接着などの腫瘍環境の要素を複製し、自然な細胞の形状と成長を維持するため、2次元(2D)培養モデル(単層構造)よりも優れています。本研究では、多細胞スフェロイドで増殖する個々の患者からの癌細胞の初代培養を調製する方法を開発しました。細胞は、患者腫瘍または患者由来の異種移植片から直接誘導することができる。この方法は、固形腫瘍(結腸、乳房、肺など)に広く適用可能であり、特殊な機器に頼らずに典型的な癌研究/細胞生物学ラボで完全に実行できるため、費用対効果も高くなります。ここでは、初代がん細胞から3D腫瘍培養モデル(多細胞スフェロイド)を生成し、細胞生存率アッセイ(MTT)と顕微鏡検査の2つの補完的なアプローチを使用して薬物に対する感受性を評価するためのプロトコルを提示します。これらの多細胞スフェロイドは、潜在的な薬剤候補の評価、潜在的なバイオマーカーまたは治療標的の特定、および応答と耐性のメカニズムの調査に使用できます。

概要

インビトロおよびインビボ研究は、がん治療法を開発するための補完的なアプローチを表しています。in vitroモデルは、ほとんどの実験変数の制御を可能にし、定量分析を容易にします。多くの場合、低コストのスクリーニングプラットフォームとして機能し、機構研究にも使用できます¹。ただし、そのようなモデルは腫瘍微小環境を部分的にしか反映していないため、それらの生物学的関連性は本質的に制限されています¹。対照的に、患者由来の異種移植片(PDX^)などのin vivoモデルは、腫瘍微小環境の複雑さを捉えており、トランスレーショナルスタディや患者の個別化治療(つまり、個々の患者に由来するモデルで薬物に対する反応を調査する)に適しています1。しかし、in vivoモデルは、実験パラメータをin vitroモデルほど厳密に制御できず、その開発に時間がかかり、労働集約的で、コストがかかるため、薬物スクリーニングのためのハイスループットアプローチを助長しません^1,2。

in vitroモデルは100年以上前から利用可能であり、細胞株は70年以上前から利用可能です³。しかし、過去数十年の間に、固形腫瘍の利用可能なin vitroモデルの複雑さは劇的に増加しました。この複雑さは、腫瘍由来の確立された細胞株または初代細胞株のいずれかである2次元(2D)培養モデル(単層構造)から、3次元(3D)モデルを含む最近のアプローチまで多岐にわたり^ます1。2Dモデル内では、確立された細胞株と初代細胞株が重要な違いがあります⁴。確立された細胞株は不死化されています。したがって、同じ細胞株を長年にわたってグローバルに使用することができ、歴史的な観点から、コラボレーション、データの蓄積、および多くの治療戦略の開発が容易になります。しかし、これらの細胞株の遺伝的異常は継代ごとに蓄積するため、生物学的関連性が損なわれます。さらに、利用可能な細胞株の数が限られていることは、患者^4,5における腫瘍の不均一性を反映していない。原発がん細胞株は、生検、胸水、または切除によって得られた切除された腫瘍サンプルから直接得られます。したがって、原発がん細胞株は、腫瘍微小環境の要素や、細胞間挙動(健康な細胞とがん細胞の間のクロストークなど)やがん細胞の幹細胞様表現型などの腫瘍特性を保存するため、生物学的により関連性があります。しかし、初代細胞株の複製能力は限られているため、培養時間が短くなり、分析に使用できる腫瘍細胞の数が制限されます^4,5。

3D培養を使用するモデルは、in vivo条件が保持されるため、2D培養モデルよりも生物学的に関連性があります。したがって、3D培養モデルは、自然な細胞の形状と成長を維持し、低酸素、壊死、細胞接着などの腫瘍環境の要素を複製します。がん研究で最も一般的に使用される3Dモデルには、多細胞スフェロイド、足場ベースの構造、およびマトリックス埋め込み培養が含まれます⁴、^6、7。

本プロトコルは、初代がん細胞から3D腫瘍培養モデル(多細胞スフェロイド)を生成し、細胞生存率アッセイ(MTT)と顕微鏡検査の2つの補完的なアプローチを使用して薬物に対する感受性を評価します。ここに提示される代表的な結果は、乳がんおよび結腸がんからのものです。ただし、このプロトコルは、他の固形腫瘍タイプ(胆管がん、胃がん、肺がん、膵臓がんなど)にも広く適用でき、特殊な機器に依存せずに一般的ながん研究/細胞生物学ラボで完全に実行できるため、費用対効果も高くなります。このアプローチを使用して生成された多細胞スフェロイドは、潜在的な薬剤候補の評価、潜在的なバイオマーカーまたは治療標的の特定、および応答と耐性のメカニズムの調査に使用できます。

このプロトコルは3つのセクションに分かれています:(1)薬効をテストするためのモデルとして使用するためのスフェロイドの生成、収集、およびカウント。(2)スフェロイドに対する薬効を評価するためのMTTアッセイ;(3)薬物有効性を評価するための別のアプローチとしてのスフェロイドの薬物による治療後の形態学的変化の顕微鏡的評価(図1)。

プロトコル

初代腫瘍細胞培養に使用されたヒト腫瘍サンプルの収集は、患者からの書面によるインフォームドコンセントを得て、ラビン医療センターで治験審査委員会(IRB)が承認したプロトコルに従って実施されました。研究への参加対象となる患者には、非転移性乳がん、結腸がん、肝臓がん、肺がん、神経内分泌がん、卵巣がん、膵臓がん、小児がん、または転移がんの男性および女性の成人および小児がん患者が含まれていました。唯一の除外基準は、インフォームドコンセントを提供する能力の欠如であった。

1. スフェロイドの生成と収集

注:原発腫瘍細胞の単離は、Kodakら⁸に記載されているように実行できます。重要なことに、スフェロイドを生成するために使用される原発性腫瘍細胞は、Moskovitsらによって記載されるように、生検、切除などによって得られた患者サンプルから直接、または患者由来の異種移植片(PDX)モデルからの腫瘍サンプルを使用して間接的に誘導^{され得る。}

1. 単一細胞付着初代細胞培養物を入れた小型フラスコ(T25)を採取し、細胞培養培地を除去し、PBSで洗浄した後、1 mLの1x Accutase(細胞剥離溶液)( 材料の表を参照)を37°Cで3分間添加することにより、75%〜100%コンフルエントの付着性初代腫瘍細胞培養の単一細胞懸濁液を調製します。
2. 5 mLの細胞培養培地(10%FBS、1:100ペニシリン-ストレプトマイシン、1%非必須アミノ酸、および1%L-グルタミンを添加したRPMI-1640培養培地; 材料の表を参照)を加えて、アキュターゼ溶液を中和します。
3. 10 mLの血清学的ピペットで細胞を吸引し、15 mLのコニカルチューブに入れます。チューブを800 x g で室温で5分間遠心分離します。
4. 細胞培養培地を取り出し、細胞ペレットの上に新鮮な細胞培養培地5 mLを加え、穏やかに混合します。
5. 血球計算^盤10で生細胞をカウントする。これを行うには、50 μLの細胞懸濁液のアリコートを取り、50 μLのトリパンブルーと混合します。生細胞(青色に対して陰性の細胞)を数え、懸濁液中の生細胞の総数を計算します。
6. 「3D培養培地」(5%基底膜マトリックスを添加した細胞培養培地; 材料表を参照)を準備します。
   注:「3D培地」は室温で液体状です。37°Cでは、粘稠度はよりゲル状になります(細胞が一緒にとどまるように)が、ピペットでピペッティングすることはできます(基底膜マトリックスが5%しか含まれていないため)。
7. アッセイに必要な細胞数と必要な総量を計算します。各ウェルには、200 μLの培地に2,000〜8,000個の細胞が含まれている必要があります。
8. 200 μLの「3D培養培地」に所望の細胞数(4,000細胞など)の細胞懸濁液を調製し、ピペットで穏やかに混合して均一な分布を確保します。
9. 懸濁液をピペッティングリザーバーに移します。マルチチャンネルピペットを使用して、超低接着96ウェルプレートの各ウェルに200 μLの細胞懸濁液を追加します( 材料の表を参照)。細胞の各収集の前に、懸濁液をよく混合する。
10. プレートを室温で300 x g で10分間遠心分離して細胞のクラスタリングを強化し、それによって細胞凝集を改善し、5%_CO2加湿インキュベーター内でプレートを37°Cでインキュベートします。
11. 2〜3日ごとに、「3D培地」を更新します。プレートを室温で300 x g で10分間遠心分離し、培地の50%(100 μL)を静かに取り出して廃棄し、100 μLの新鮮な「3D培養培地」を加えて既存の溶液を置き換えます。ステップ1.11を繰り返し、プレートを37°C、5%_CO2加湿インキュベーターに戻します。
    注意: 培地の除去は、プレートを45°に保持したときに実行する必要があり、細胞が収集されないように、培地は上部からのみ収集する必要があります。真空吸引システムは使用しないでください。新鮮な培地は、すでに形成され始めているスフェロイドを破壊しないように、ゆっくりと穏やかに添加する必要があります。
12. 1〜2日ごとに顕微鏡で細胞を検査して、スフェロイド形成を監視します。イメージングソフトウェアの「スケール」ツールを使用して形成されたスフェロイドの直径を測定します( 材料の表を参照)。
    注:顕微鏡検査では、時間が経つにつれて回転楕円体の形状をとる不規則な円形から楕円形の物体が最初に明らかになります^11,12。
    1. スフェロイド径が100〜200μmに達したら、薬効実験を行う。
       注:薬効実験は、スフェロイドがこの直径に達したときに行われ、その時点で細胞の大部分が増殖しており、治療に対する反応を評価するのに役立ちます。より大きな直径のスフェロイドは、壊死コアおよび静止層¹¹、¹²を含み、その結果^、治療に応答する増殖細胞の割合が小さくなる。
13. スフェロイド採取には、1,000 μLのピペットを使用して各ウェルからスフェロイドを回収し、15 mLのコニカルチューブに入れます。
    注:スフェロイドは本質的に壊れやすく、穏やかな取り扱いが必要です。スフェロイドを含む培地を円錐形のチューブに移すときは、チューブを45°に保持し、チューブの壁にゆっくりとピペットで固定します。スフェロイドは目に見えます。
14. コニカルチューブを室温で300 x g で5分間遠心分離し、ピペットを使用して上清を注意深く吸引して廃棄します。
15. 0.5 mLの細胞培養培地を加え、ペレットを穏やかに再懸濁します。泡を作らないでください。
16. 以下の手順に従ってスフェロイドカウントを実行します。
    1. 96ウェルプレートを使用し、ウェルの下側にプラス記号を描画して、ウェルを象限に分割します(カウントを追跡するのに役立ちます)。
    2. 50 μLの懸濁液をウェルに加え、顕微鏡下で手動でスフェロイドを数えます(10倍の対物レンズを使用)。
    3. 各象限の回転楕円体を数え、二重に数えないように注意し、ウェル内の回転楕円体の総数を計算します。
       注:カウントの精度を高めるために、ウェル内の少なくとも50個のスフェロイドをカウントします。スフェロイドが50個未満の場合は、懸濁液を穏やかに混合して均一な分布を確保し、新しいウェルに添加した懸濁液の量を増やして再度カウントします。あるいは、ウェル内のスフェロイドが50個未満の場合は、スフェロイドを遠心分離し、<0.5 mLの容量で穏やかに再懸濁することができます。スフェロイドが100個を超える場合は、スフェロイド懸濁液に細胞培養培地を加え、穏やかに混合して再カウントします。
    4. スフェロイド濃度(スフェロイド数/計数体積[μL])を計算し、懸濁液中のスフェロイドの総数(スフェロイド濃度×総体積)を計算します。

2.薬効アッセイ(MTTアッセイ)

注:詳細については、van Meerloo et ^al.13を参照してください。また、MTTアッセイでは、「3D培養培地」ではなく、細胞培養培地のみを使用する必要があります(基底膜マトリックスを追加する必要はなく、MTTアッセイに干渉する可能性があります)。

1. 新しいチューブで、細胞培養培地200 μLあたり200スフェロイドの濃度でスフェロイド懸濁液を調製します(10%FBS、1:100ペニシリン-ストレプトマイシン、1%非必須アミノ酸、および1%L-グルタミンを添加したRPMI-1640培養培地)。
   1. 薬物治療ごとに、15 mLチューブにスフェロイドのストックを準備します。反復に必要なウェルの数で各薬物に必要な量を計算します:(5-8)×200μL。必要な最終濃度までチューブに薬を加えます。
      注:本研究に使用された薬とその投与量については、代表的な結果のセクションを参照してください。また、薬の商業的詳細は 材料表に記載されています。
2. 200 μLのスフェロイド懸濁液を超低接着96ウェルプレートのウェルに移し、5%_CO2加湿インキュベーター内でプレートを37°Cでインキュベートします。96ウェルプレートの外側の列は蒸発の増加を特徴とし、繰り返し実験間のばらつきが大きくなる可能性があるため、アッセイには使用しないでください。代わりに、これらのウェルにPBSを追加します。
   注:培養物を96ウェルプレートに分注する前に、スフェロイドの培養が均一であることが重要です。また、すべての実験には、対照条件(未処理のスフェロイド)を含める必要があります。
3. スフェロイドを治験薬と一緒に24〜72時間インキュベートした後、プレートを室温で300 x g で5分間遠心分離し、170 μLの細胞培養培地を静かに取り除き、30 μL(スフェロイドを含む)をウェルの底に残します。
   注:170 μLの細胞培養培地の除去は、スフェロイドを除去しないように慎重に行う必要があります。プレートを45°に持ち、片方の手(コントラストのために暗い手袋を着用)をウェルの下に置き、回転楕円体が見えるようにします(白い点)。
4. MTT溶液を調製します(フェノールフリーRPMI溶液0.714 mg / mL、 材料の表を参照)。
5. 70 μLのMTT溶液を各ウェルに添加し、ウェルあたり100 μLの最終容量にします(ウェル内の最終MTT濃度は100 μLあたり0.05 mgになります)。さらに、細胞を含まないMTT溶液で「ブランク」ウェルを調製します。
   注意: MTTは光に敏感です。したがって、フード内のライトをオフにし、MTTソリューションを含むチューブをアルミホイルで覆う必要があります。
6. プレートを5%_CO2加湿インキュベーター中で37°Cで3〜4時間インキュベートし、ウェル内の溶液の色の変化が観察されるまで(紫色は生細胞を表す)。
7. 変化が見られたら、100 μLの停止液(イソプロパノール溶液0.1N HCl)を各ウェルに加え、気泡を作らずにウェルの内容物を穏やかに混合します。
8. 蛍光光度計-ELISAリーダー( 材料表を参照)で、波長570 nm、背景波長630〜690 nMでのプレートの吸光度を読み取ります。
   注意: 利用可能な蛍光光度計-ELISAリーダーが超低アタッチメント96ウェルプレートを読み取ることができない場合は、各ウェルの内容物を対応する平底96ウェルプレートに移します。
9. 以下の手順に従って細胞生存率を計算します。
   1. 各ウェルについて、「特異的シグナル」(「特異的シグナル」=570 nmのシグナル - 630-690 nmのシグナル)を計算します。次に、「ブランク」ウェルの平均値を計算し、各ウェルからこの値を差し引きます。
   2. 治験薬(「AV-SS-unt」)で処理されなかった細胞を含む対照ウェルにおける「特異的シグナル」の平均を計算する。
   3. 未処理細胞を含むウェルに対する各ウェル内の細胞の生存率(パーセンテージ)を計算します。
      注:生存率=(各ウェルの特定のシグナル/"AV-SS-unt")×100

3. スフェロイドの形態変化のモニタリングと解析

注:MTTアッセイに関しては、この評価では「3D培養培地」ではなく、細胞培養培地のみを使用する必要があります(基底膜マトリックスを追加する必要はなく、分析に干渉する可能性があります)。

1. スフェロイドをカウントした後、細胞培養培地(10%FBS、1:100ペニシリン-ストレプトマイシン、1%非必須アミノ酸、および1%L-グルタミンを添加したRPMI-1640培養培地)で懸濁液を20 μLあたり約1〜2スフェロイドに希釈します。
2. 80 μLの細胞培養培地を超低接着96ウェルプレートのウェルに入れ、20 μLのスフェロイド懸濁液をウェルに加えます。
   注:したがって、ウェルには100μLの容量で1〜2個のスフェロイドが含まれます。
3. 顕微鏡下でウェルを注意深くチェックし、この分析に使用される1つのスフェロイドを含むウェルに印を付けます。
4. 目的の濃度の2倍の濃度で治験薬を準備します。100 μLの薬液を関連するウェルに追加します(ウェル内の総濃度は1倍になります)。
5. 0日目(治験薬を追加する前)に各ウェルの画像をキャプチャし、イメージングソフトウェアの「スケール」ツール( 材料の表を参照)を使用して、スフェロイドの直径を決定します。
6. プレートを5%_CO2加湿インキュベーター内で37°Cでインキュベートし、薬物効果が観察される時期に応じて、形態を調べ、「スケール」ツールを使用して3〜7日間毎日スフェロイドの直径を測定します(例:細胞播種、侵襲性ポッド、構造破壊など)。
7. 実験の最後に、時間の経過に伴う回転楕円体の直径の変化(0日目に対する)をプロットします。
   注: 変化 (パーセンテージ) = (特定の日における回転楕円体の直径/0日目におけるその回転楕円体の直径) × 100

結果

このプロトコルは、原発腫瘍細胞からスフェロイドの均質な培養を生成し、スフェロイド培養に対する薬効を定量的に評価し(MTTアッセイ)、およびスフェロイド形態に対する治験薬の効果を決定するための手順を提示します。結腸および乳癌細胞培養から生成されたスフェロイドにおける代表的な実験からのデータが提示される。同様の実験を、胆管癌、胃癌、肺癌、および膵臓癌を含む他?...

ディスカッション

本プロトコルは、ヒト腫瘍サンプルに由来する3D初代細胞培養物(スフェロイド)を生成するための簡単な方法を記載する。これらのスフェロイドは、潜在的な薬剤候補や薬剤の組み合わせの評価、潜在的なバイオマーカーや治療標的の特定、応答と耐性のメカニズムの調査など、さまざまな分析に使用できます。このプロトコルでは、患者サンプルから直接得られた初代腫瘍細胞、またはPDXモ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 Fluorouracil	TEVA Israel	lot 16c22NA	Fluorouracil, Adrucil
Accutase	Gibco	A1110501	StemPro Accutase Cell Dissociation
Cisplatin	TEVA Israel	20B06LA	Abiplatin,
Cultrex	Trevigen	3632-010-02	Basement membrane matrix, type 3
DMSO (dimethyl sulfoxide)	Sigma Aldrich	D2650-100ML
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	2391595
Flurometer ELISA reader	Biotek	Synergy H1	Gen5 3.11
Hydrochloric acid (HCl)	Sigma Aldrich	320331	for stop solution
ImageJ	National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA	Version 1.52a	Open-source software ImageJ
Isopropanol	Gadot	P180008215	for stop solution
L-glutamine	Gibco	1843977
MTT	Sigma Aldrich	M5655-1G	3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide
Non-essential amino acids	Gibco	11140050
Palbociclib	Med Chem Express	CAS # 571190-30-2
PBS	Gibco	14190094	Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium
Penicillin–streptomycin	Invitrogen	2119399
Phenol-free RPMI 1640	Biological industries, Israel	01-103-1A
Pippeting reservoir	Alexred	RED LTT012025
RPMI-1640 culture medium	Gibco	11530586
Sunitinib	Med Chem Express	CAS # 341031-54-7
Trastuzumab	F. Hoffmann - La Roche Ltd, Basel, Switherland	10172154 IL	Herceptin
Trypan blue 0.5% solution	Biological industries, Israel	03-102-1B
Ultra-low attachment 96 well plate	Greiner Bio-one	650970
Vinorelbine	Ebewe	11733027-03	Navelbine