Ensayo de verde de malaquita para el descubrimiento de inhibidores de la proteína 90 de choque térmico

Resumen

El protocolo de ensayo de verde de malaquita es un método simple y rentable para descubrir supresores de la proteína de choque térmico 90 (Hsp90), así como otros compuestos inhibidores contra enzimas dependientes de ATP.

Resumen

La proteína de choque térmico 90 (Hsp90) es un objetivo anticancerígeno prometedor debido a su efecto de acompañamiento en múltiples proteínas oncogénicas. La actividad de Hsp90 depende de su capacidad para hidrolizar trifosfato de adenosina (ATP) a difosfato de adenosina (ADP) y fosfato libre. La actividad ATPasa de Hsp90 está vinculada a su función de acompañamiento; El ATP se une al dominio N-terminal del Hsp90, y se encontró que interrumpir su enlace era la estrategia más exitosa para suprimir la función Hsp90. La actividad de la ATPasa se puede medir mediante un ensayo colorimétrico de verde de malaquita, que determina la cantidad de fosfato libre formado por hidrólisis de ATP. Aquí, se describe un procedimiento para determinar la actividad ATPasa de la levadura Hsp90 utilizando el kit de ensayo de fosfato verde de malaquita. Además, se proporcionan instrucciones detalladas para el descubrimiento de inhibidores de Hsp90 tomando geldanamicina como un inhibidor auténtico. Finalmente, se discute la aplicación de este protocolo de ensayo a través del cribado de alto rendimiento (HTS) de moléculas inhibidoras contra levadura Hsp90.

Introducción

La proteína de choque térmico 90 (Hsp90) es una chaperona molecular que mantiene la estabilidad de las proteínas responsables del desarrollo y la progresión del cáncer. Además, las proteínas responsables del desarrollo de resistencia a los agentes antineoplásicos también son clientes de Hsp90¹. Hsp90 se sobreexpresa ubicuamente en todos los tipos de células cancerosas (>90% de las proteínas celulares), en comparación con las células normales donde puede constituir menos del 2% del total de proteínas. Además, el Hsp90 de las células cancerosas reside en un complejo con co-chaperonas, mientras que en una célula normal está presente predominantemente en un estado libre y no complejado ^2,3. En los últimos años, se ha demostrado que varios inhibidores de Hsp90 poseen efectos senolíticos en estudios in vitro e in vivo, donde han mejorado significativamente la vida útil de ratones ^4,5,6. Todos los hallazgos antes mencionados corroboran el hecho de que los inhibidores de Hsp90 podrían ser efectivos en múltiples tipos de cáncer, con menos efectos adversos y menores posibilidades de desarrollar resistencia. La función de acompañamiento de Hsp90 se logra uniendo ATP en el dominio N-terminal de Hsp90 e hidrolizándolo en ADP y fosfato libre⁷. Se encontró que las moléculas pequeñas que se unen competitivamente al bolsillo de unión al ATP de Hsp90 suprimen con éxito el efecto de acompañamiento de la proteína. Hasta la fecha, esta sigue siendo la mejor estrategia para la inhibición de Hsp90, lo que está respaldado por el hecho de que tales inhibidores han alcanzado ensayos clínicos⁸. Uno de ellos, Pimitespib, fue aprobado en Japón para el tratamiento del tumor del estroma gastrointestinal (GIST) en junio de 2022⁹. Este es el primer inhibidor de Hsp90 aprobado desde que se estableció la farmacogabilidad de la chaperona en 1994¹⁰.

El ensayo verde de malaquita es un procedimiento simple, sensible, rápido y económico para la detección de fosfato inorgánico, adecuado para la automatización y el cribado de alto rendimiento (HTS) de compuestos contra su objetivo deseado¹¹. El ensayo se ha empleado con éxito para el cribado de inhibidores de Hsp90 en pequeñas configuraciones a escala de laboratorio, así como en un HTS 12,13,14,15,16,17. El ensayo utiliza un método colorimétrico que determina el fosfato inorgánico libre formado debido a la actividad ATPasa de Hsp90. La base de esta cuantificación es la formación de un complejo de fosfomolibdato entre fosfato libre y molibdeno, que posteriormente reacciona con el verde malaquita para generar un color verde (Figura 1). Esta rápida formación de color se mide en un espectrofotómetro, o en un lector de placas, entre 600-660 nm^18,19.

En el presente protocolo, se describe el procedimiento para llevar a cabo un ensayo de verde de malaquita con levadura Hsp90 y la posterior identificación de inhibidores contra la chaperona. La molécula de producto natural, geldanamicina (GA), con la que se estableció por primera vez la farmacogabilidad de Hsp90, fue tomada como un inhibidor auténtico¹⁰. HTS se ha convertido en una parte integral del programa actual de descubrimiento de fármacos, debido a la disponibilidad de un gran número de moléculas para pruebas. Esta técnica ha ganado más importancia en los últimos 2 años debido a la necesidad urgente de reutilizar medicamentos para tratar la infección por Covid-19^20,21. Por lo tanto, se presenta un esquema detallado para el HTS de moléculas contra la proteína Hsp90 de levadura mediante la adopción del método de ensayo verde de malaquita.

Protocolo

1. Ensayo de verde de malaquita a escala de laboratorio

1. Preparación del tampón de ensayo
   1. Prepare el tampón del ensayo, según la composición y preparación presentadas en la Tabla 1.
2. Preparación de patrones de fosfato
   1. Utilice el estándar de fosfato de 1 mM, proporcionado en el kit de ensayo de fosfato de ensayo verde de malaquita (almacenado a 4 °C).
   2. Pipetear 40 μL de 1 mM de fosfato patrón en 960 μL de agua ultrapura para obtener 40 μM de solución de fosfato (solución de premezcla). Agregue la solución de premezcla con agua ultrapura, según las instrucciones del fabricante, para formar una dilución en serie de fosfato de 0 a 40 μM.
3. Preparación de levadura Hsp90
   1. Use levadura Hsp90 con una concentración de glicerol de 0.66 mg / ml. Descongelar sobre hielo justo antes de usar.
   2. Use 8 μL (5.98 μg, 0.80 μM) de levadura Hsp90 para la actividad medible de la ATPasa. Compruebe que la diferencia de densidad óptica después de la adición del reactivo verde de malaquita entre el blanco y el control positivo es de al menos 0,5 y menos de 1,0. Aquí, la diferencia de absorbancia entre el blanco (sin Hsp90) y el control positivo (con Hsp90) se encontró que era 0.510.
4. Preparación de ATP
   1. Transfiera 1 mg de ATP a un vial que contenga 453,39 μL de agua ultrapura para obtener 4 mM de solución madre. Realizar cálculos de peso basados en ATP anhidro (peso molecular [m.w.] = 551.14). Prepare ATP fresco, ya que puede hidrolizarse espontáneamente con el tiempo.
   2. Añadir 4 μL de solución madre de ATP a cada pocillo para obtener una concentración final del pozo de 0,2 mM (volumen total final del pozo de ensayo de 80 μL). Añadir ATP como último componente a la reacción, utilizando una pipeta multicanal para que todas las reacciones comiencen simultáneamente.
5. Preparación de geldanamicina (GA)
   1. Preparar una reserva de 10 mM de AG disolviendo 1 mg en 178,37 μL de DMSO (m.w. = 560,64). Usando la solución madre, prepare 4 mM, 0.8 mM, 0.16 mM, 0.032 mM, 0.0064 mM y 0.00128 mM en solución DMSO por dilución en serie.
   2. Agregue 2 μL de estas soluciones madre a cada pozo para obtener una concentración final del pozo de 0.1 mM, 0.02 mM, 0.004 mM, 0.0008 mM, 0.00016 mM y 0.000032 mM, respectivamente.
   3. Prepare los pozos como se describe en la Tabla 2 y la Tabla 3, con los pozos que contienen el espacio en blanco (tampón + agua + DMSO) y el control negativo (Hsp90 en tampón + agua + DMSO). Los pozos que contienen GA (Hsp90 en tampón + agua + GA) sirven como control positivo.
6. Preparación de placas de pozo y orden de adición
   1. Prepare placas de 96 pocillos con el diseño presentado en la Tabla 2. Para los compuestos que muestran absorbancia a 620 nm, prepare un pocillo separado para registrar la absorbancia en esta longitud de onda. No prepare un pocillo separado para GA, ya que GA no muestra absorbancia a 620 nm para la concentración utilizada en el ensayo.
   2. Prepare cada componente con el volumen total de cada constituyente, como se presenta en la Tabla 3.
   3. Establezca pozos de ensayo agregando agua ultrapura a cada pozo. Después de esto, agregue la cantidad requerida de tampón de ensayo y una solución compuesta (por ejemplo, solución GA).
   4. Luego, agregue Hsp90 a los pocillos apropiados y agite las placas durante 2 minutos en un agitador de placas a temperatura ambiente.
   5. Añadir 4 μL de solución de ATP con una pipeta multicanal. Envuelva la placa en papel de aluminio y agite durante 2 minutos en un agitador de placas (200 rpm) a temperatura ambiente. Incubar la placa a 37 °C durante 3 h.
7. Preparación y adición de reactivo verde de malaquita
   1. El reactivo verde de malaquita consiste en los reactivos A (molibdato de amonio en HCl 3M) y B (verde de malaquita y alcohol polivinílico). Lleve el reactivo a temperatura ambiente antes de usarlo. Mezclar los reactivos A y B en una proporción de 100:1 (1.000 μL:10 μL). Prepare esto dentro de las 3 h antes de su uso, ya que es inestable y comienza a descomponerse después de 3 h.
   2. Después de 3 h del paso 1.6.5, detener la reacción añadiendo 20 μL de reactivo verde de malaquita, añadido en el mismo orden que el ATP, utilizando una pipeta multicanal.
   3. Después de una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente, mida la absorbancia de la placa a 620 nm en un lector de placas.

2. Cribado de alto rendimiento de inhibidores de Hsp90 mediante ensayo de verde de malaquita

NOTA: El protocolo para la detección de alto rendimiento es similar a la metodología a escala de laboratorio. El volumen final del pozo en cada caso es de 80 μL. Sin embargo, hay una ligera diferencia en el orden de la adición de reactivos. En el método basado en escala de laboratorio, hay cinco etapas de adición de solución (34 μL de agua, 32 μL de tampón, 2 μL de compuesto en DMSO, 8 μL de Hsp90 y finalmente 4 μL de solución de ATP). En contraste, con HTS hay tres etapas de adición (40 μL de solución tampón que contiene levadura Hsp90, 2 μL de DMSO en 18 μL de agua que contienen los compuestos, y finalmente 20 μL de ATP disuelto en agua). La cantidad mínima de solución que se puede pipetear con precisión en la configuración HTS es de 20 μL. Por lo tanto, se observa una diferencia en el pipeteo entre las escalas de laboratorio y HTS.

1. Preparación del tampón de ensayo (pH 7.4)
   1. Utilice el mismo tampón en HTS que para el ensayo de verde de malaquita a escala de laboratorio (Tabla 1).
2. Preparación de levadura Hsp90
   1. Use proteínas con una concentración de glicerol de 0.66 mg / ml. Descongelar sobre hielo justo antes de usar.
   2. Use 8 μL (5.98 μg, 0.80 μM) de levadura Hsp90 en cada pocillo, lo que proporciona una actividad ATPasa medible.
   3. Diluir la proteína (8 μL) en tampón (32 μL) para cada pocillo. El volumen total de trabajo final para cada pocillo es de 40 μL en un volumen total de ensayo de 80 μL.
3. Preparación de 0.8 mM ATP
   1. Disolver 1 mg de ATP en 2.267 μL de agua destilada para obtener una solución de 0,8 mM. El volumen total de trabajo para cada pocillo es de 20 μL en un volumen total de ensayo de 80 μL.
4. Preparación de geldanamicina (GA)/compuestos problema
   1. Prepare un stock de 0,8 mM de GA en DMSO, como en el paso 1.5. Diluir 10 μL de la cepa de GA con 90 μL de agua para obtener una concentración final de 80 μM.
   2. Utilizar 20 μL de la solución de GA de 80 μM en pocillos de ensayo apropiados (volumen total final del pozo de ensayo = 80 μL), dando una concentración final del pocillo de 20 μM. Esto sirve como un control positivo.
   3. Para los compuestos de ensayo, preparar soluciones en DMSO según su concentración deseada para la evaluación.
   4. Preparar 10 μL de DMSO en 90 μL de agua para agregar a pozos en blanco (tampón + agua + DMSO) y control negativo (Hsp90 en tampón + agua + DMSO). Preparar los compuestos de ensayo de manera similar a una concentración final de pocillo de 100 μM.
5. Diseño de placas de ensayo y orden de adición
   1. Utilice cuatro placas principales, una placa compuesta y cuatro placas de adición que contengan existencias de reactivos para configurar el ensayo (Figura 2 y Tabla 4).
   2. Además, la placa A, agregue 90 μL de tampón de ensayo en cada pocillo; además de la placa B, añadir 90 μL de tampón con Hsp90 en cada pocillo; además de las placas C y D, añadir 90 μL de ATP y 90 μL de reactivo verde malaquita, respectivamente, en cada pocillo (Tabla 5 y Tabla 6).
   3. Desde la placa de adición A y la placa B, transferir 40 μL de solución de cada pocillo a la placa principal 1 y 2, y 3 y 4, respectivamente, utilizando un sistema de dosificación multicanal automatizado. Aquí se utilizó la estación de trabajo de automatización de laboratorio Biomek(^R) FX^P (Figura 2 y Tabla 6).
   4. Desde cada pocillo de la placa compuesta, transfiera 20 μL de la solución a las placas principales 1, 2, 3 y 4 (Figura 2). Agite los platos durante 1 minuto en una coctelera (200 rpm).
   5. Desde cada pocillo de la placa de adición C (ATP), transfiera 20 μL de solución a las placas principales 1, 2, 3 y 4 (Figura 2). Agite los platos durante 1 minuto en una coctelera (200 rpm).
   6. Incubar las placas durante 3 h a 37 °C.
   7. Preparar el reactivo verde de malaquita según el paso 1.7. Después de 3 h, transferir 20 μL de reactivo verde de malaquita de la placa de adición D a los pocillos de las placas principales 1, 2, 3 y 4 (Figura 2).
   8. Después de una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente, medir la absorbancia de la placa es de 620 nm en un lector de placas.

Resultados

Los resultados del ensayo se interpretan en términos de absorbancia debido a la concentración de iones fosfato libres. La absorbancia por fosfato libre debido a la hidrólisis de ATP por la levadura Hsp90 a 620 nm se considera como 100% de actividad ATPasa, o inhibición de proteína de porcentaje cero. La inhibición de la proteína conduce al cese de la hidrólisis del ATP (menos fosfato libre). que se refleja en términos de disminución de la absorbancia a 620 nm.

Resultados del ...

Discusión

Hsp90 es un objetivo importante para el descubrimiento de nuevas moléculas de fármacos contra el cáncer. Desde que se estableció su farmacogabilidad en 1994^{10, 18} moléculas han llegado a ensayos clínicos. En la actualidad, siete moléculas se encuentran en diversas fases de ensayos clínicos, ya sea solas o en combinación²². Todas estas moléculas pequeñas son inhibidores de unión al ATP N-terminal. Los otros medios para inhibir la chaperona (inhibidores C-terminal...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1M Magnesium chloride solution in water	Sigma-Aldrich	63069-100ml
1M Potassium chloride solution in water	Sigma-Aldrich	60142-100ml
96-well plate	SPL Life Sciences	Not applicable
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A7699-5G
Biomek FX laboratory automation workstation	Beckman Coulter	Not applicable
Compounds 3-96	Not applicable	Not applicable	Histidine tagged yeast Hsp90 was obtained from Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom, and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Details cannot be disclosed due to patent infringement issues.
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418
Geldanamycin, 99% (HPLC), powder	AK Scientific, Inc.	V2064
Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	ThermoFisher Scientific	10977015
Malachite Green Phosphate Assay  Assay kit	Sigma-Aldrich	MAK307-1KT
Multi-Detection Microplate Reader Synergy HT	Biotek Instruments, Inc.	Not applicable
Synergy HT multi-plate reader	Biotek Instruments, Inc.	Not applicable
Trizma hydrochloride buffer solution, pH7.4	Sigma-Aldrich	93313-1L
Yeast Hsp90	Not applicable	Not applicable	School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Primary Accession number: P02829