Rapido sviluppo di circuiti di identificazione dello stato cellulare con poli-trasfezione

Riepilogo

I circuiti genetici complessi richiedono molto tempo per progettare, testare e ottimizzare. Per facilitare questo processo, le cellule di mammifero vengono trasfettate in modo da consentire il test di più stechiometrie di componenti del circuito in un singolo pozzetto. Questo protocollo delinea le fasi per la pianificazione sperimentale, la trasfezione e l'analisi dei dati.

Abstract

I circuiti genetici dei mammiferi hanno dimostrato il potenziale per rilevare e trattare una vasta gamma di stati patologici, ma l'ottimizzazione dei livelli dei componenti del circuito rimane impegnativa e laboriosa. Per accelerare questo processo, il nostro laboratorio ha sviluppato la poli-trasfezione, un'estensione ad alto rendimento della trasfezione tradizionale dei mammiferi. Nella poli-trasfezione, ogni cellula della popolazione trasfettata esegue essenzialmente un esperimento diverso, testando il comportamento del circuito a diversi numeri di copie del DNA e consentendo agli utenti di analizzare un gran numero di stechiometrie in una reazione single-pot. Finora sono state dimostrate poli-trasfezioni che ottimizzano i rapporti di circuiti a tre componenti in un singolo pozzetto di cellule; In linea di principio, lo stesso metodo può essere utilizzato per lo sviluppo di circuiti ancora più grandi. I risultati della poli-trasfezione possono essere facilmente applicati per trovare rapporti ottimali tra DNA e co-transfettazione per circuiti transitori o per scegliere livelli di espressione per componenti circuitali per la generazione di linee cellulari stabili.

Qui, dimostriamo l'uso della poli-trasfezione per ottimizzare un circuito a tre componenti. Il protocollo inizia con i principi di progettazione sperimentale e spiega come la poli-trasfezione si basa sui tradizionali metodi di co-trasfezione. Successivamente, viene eseguita la poli-trasfezione delle cellule e seguita dalla citometria a flusso pochi giorni dopo. Infine, i dati vengono analizzati esaminando fette dei dati di citometria a flusso a singola cellula che corrispondono a sottoinsiemi di cellule con determinati rapporti componenti. In laboratorio, la poli-trasfezione è stata utilizzata per ottimizzare classificatori cellulari, controller di feedback e feedforward, motivi bistabili e molti altri. Questo metodo semplice ma potente accelera i cicli di progettazione per circuiti genetici complessi nelle cellule di mammifero.

Introduzione

Il campo della biologia sintetica dei mammiferi è progredito rapidamente, dallo sviluppo di semplici parti senso-e-risposta in linee cellulari in coltura all'ottimizzazione di reti complesse di geni per affrontare le sfide del mondo reale nella diagnostica e nella terapia¹. Questi sofisticati circuiti sono in grado di rilevare input biologici dai profili di microRNA alle citochine ai farmaci a piccole molecole e di implementare circuiti di elaborazione logica tra cui transistor, filtri passa-banda, interruttori a levetta e oscillatori. Hanno anche mostrato risultati promettenti in modelli animali di malattie come cancro, artrite, diabete e molti altri 1,2,3,4,5. Tuttavia, man mano che la complessità di un circuito cresce, l'ottimizzazione dei livelli di ciascuno dei suoi componenti diventa sempre più impegnativa.

Un tipo particolarmente utile di circuito genetico è un classificatore cellulare, che può essere programmato per rilevare e rispondere agli stati cellulari. La produzione selettiva di proteine o RNA in specifici stati cellulari è un potente strumento per guidare e programmare la differenziazione di cellule e organoidi, identificare e distruggere le cellule malate e/o i tipi di cellule indesiderabili e regolare la funzione delle cellule terapeutiche 1,2,3,4,5 . Tuttavia, la creazione di circuiti nelle cellule di mammifero in grado di classificare con precisione gli stati cellulari da più RNA cellulare e / o specie proteiche è stata molto impegnativa.

Uno dei passaggi più dispendiosi in termini di tempo per lo sviluppo di un circuito di classificazione cellulare è ottimizzare i livelli di espressione relativi dei singoli geni componenti, come sensori e fattori di elaborazione, all'interno del circuito. Per accelerare l'ottimizzazione dei circuiti e consentire la costruzione di circuiti più sofisticati, recenti lavori hanno utilizzato la modellazione matematica dei circuiti classificatori di celle e dei loro componenti per prevedere composizioni e topologie ottimali ^6,7. Mentre questo ha mostrato risultati potenti finora, l'analisi matematica è limitata dalla necessità di caratterizzare sistematicamente il comportamento input-output dei geni componenti nel circuito, che richiede tempo. Inoltre, una miriade di problemi dipendenti dal contesto possono emergere in circuiti genetici complessi, facendo sì che il comportamento di un circuito completo sfidi le previsioni basate sulle caratterizzazioni delle singole parti ^8,9.

Per sviluppare e testare più rapidamente circuiti complessi di mammiferi come i classificatori di stato cellulare, il nostro laboratorio ha sviluppato una tecnica chiamata poli-trasfezione¹⁰, un'evoluzione dei protocolli di co-trasfezione plasmidica. Nella co-trasfezione, più specie di DNA plasmidico sono complessate insieme con un reagente lipidico o polimerico caricato positivamente, quindi consegnate alle cellule in modo correlato (Figura 1A). Nella poli-trasfezione, i plasmidi sono complessati separatamente con il reagente, in modo tale che il DNA di ciascun complesso di trasfezione venga consegnato alle cellule in modo de-correlato (Figura 1B). Utilizzando questo metodo, le cellule all'interno della popolazione trasfettata sono esposte a numerose combinazioni di rapporti di due o più carichi utili di DNA che trasportano diversi componenti del circuito.

Per misurare i rapporti dei componenti del circuito consegnati a ciascuna cellula, ogni complesso di trasfezione all'interno di una poli-trasfezione contiene un reporter fluorescente costitutivamente espresso che funge da proxy per l'assorbimento cellulare del complesso. Il DNA di riempimento che non contiene alcun elemento attivo all'interno di una cellula di mammifero viene utilizzato per sintonizzare la quantità relativa del reporter fluorescente e dei componenti del circuito consegnati a una cellula in un singolo complesso di trasfezione e viene discusso più dettagliatamente nella discussione. Un esempio di DNA di riempimento utilizzato nel laboratorio Weiss è un plasmide contenente una sequenza di terminazione, ma nessun promotore, sequenza codificante, ecc. Le cellule con diversi rapporti di componenti del circuito possono quindi essere confrontate per trovare rapporti ottimali per la funzione del circuito genico. Questo a sua volta produce previsioni utili per la scelta di promotori e altri elementi del circuito per raggiungere livelli ottimali di espressione genica quando si combinano componenti del circuito in un singolo vettore per l'integrazione genetica (ad esempio, un lentivirus, un trasposone o una piattaforma di atterraggio). Pertanto, invece di scegliere i rapporti tra i componenti del circuito in base all'intuizione o tramite un processo di prova ed errore che richiede tempo, la poli-trasfezione valuta un'ampia gamma di stechiometrie tra le parti genetiche in una reazione a singolo piatto.

Nel nostro laboratorio, la poli-trasfezione ha permesso l'ottimizzazione di molti circuiti genetici, tra cui classificatori cellulari, controller di feedback e feedforward e motivi bistabili. Questo metodo semplice ma potente accelera significativamente i cicli di progettazione per circuiti genetici complessi nelle cellule di mammifero. Da allora la poli-trasfezione è stata utilizzata per caratterizzare diversi circuiti genetici per rivelare le loro funzioni di trasferimento input-output multidimensionale ad alta risoluzione 10, ottimizzare una topologia circuitale alternativa per la classificazione dello stato cellulare¹¹ e accelerare vari progetti pubblicati^12,13 e in corso.

Qui descriviamo e rappresentiamo il flusso di lavoro per l'utilizzo della poli-trasfezione per ottimizzare rapidamente un circuito genetico (Figura 2). Il protocollo mostra come generare dati di poli-trasfezione di alta qualità ed evitare diversi errori comuni nel protocollo di poli-trasfezione e nell'analisi dei dati (Figura 3). Viene quindi illustrato come utilizzare la poli-trasfezione per caratterizzare semplici componenti del circuito e, nel processo, confrontare i risultati della poli-trasfezione con la co-trasfezione (Figura 4). Infine, i risultati della poli-trasfezione mostrano l'ottimizzazione del circuito del classificatore del cancro (Figura 5).

Protocollo

NOTA: la Tabella 1 e la Tabella 2 fungono da riferimenti significativi per questo protocollo. La Tabella 1 mostra il ridimensionamento del reagente per le reazioni, e la Tabella 2 mostra l'aritmetica del rapporto DNA per un esempio di poli-trasfezione descritta nel protocollo (metà superiore) e per un possibile esperimento di follow-up (metà inferiore).

1. Preparare le cellule per la trasfezione

1. Assicurarsi che la coltura di cellule di rene embrionale umano (HEK293) sia confluente al 60% -80% prima di iniziare il protocollo. Per fare questo, seminare 1 x 10⁶ cellule in una coltura tissutale di 100 mm x 15 mm 2 giorni prima e incubare a 37 ° C con il 5% di CO₂.
   NOTA: Sebbene il nostro protocollo si concentri sulle cellule HEK293, altri tipi di cellule possono essere sostituiti.
2. Preparare i mezzi e le cellule per le trasfezioni come descritto di seguito.
   1. Preriscaldare almeno 20 mL di una soluzione di terreno di aquila modificato (DMEM) di Dulbecco con siero bovino fetale (FBS) al 10% e amminoacidi non essenziali (NEAA; vedere Tabella dei materiali) a 37 °C. Preriscaldare almeno 2,4 mL di tripsina e 2,4 mL di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) a 37 °C. Pre-caldo ridotto siero medio a ~16 °C.
      NOTA: Tutti i lavori di coltura tissutale devono essere eseguiti con cura in un armadio di biosicurezza.
3. Risospendere le celle nella soluzione DMEM come descritto di seguito.
   1. Aspirare e smaltire i supporti attuali. Erogare 2 ml di PBS sulla coltura cellulare HEK293 per lavare le cellule. Aspirare e smaltire il PBS.
   2. Erogare 2 mL di tripsina sulla coltura cellulare HEK293. Porre la capsula di Petri in un'incubatrice a 37 °C per 3 minuti o fino a quando le cellule non aderiscono più alla capsula. Riportare il piatto nell'armadio di biosicurezza e diluire la soluzione cellulare erogando 8 ml di soluzione DMEM nella piastra.
   3. Mescolare la soluzione pipettando delicatamente su e giù più volte. Aspirare tutti i fluidi e posizionarli in un tubo conico da 15 ml.
4. Centrifugare le celle a 300 x g per 3 minuti per pellettizzarle. Aspirare il mezzo (facendo attenzione a non aspirare le cellule) e scartarlo. Risospendere le cellule in 5 mL di soluzione DMEM, mescolando delicatamente pipettando su e giù.
5. Stimare la concentrazione attuale di celle utilizzando un contatore automatico di celle (elencato nella tabella dei materiali). Semina sei pozzetti (in questo esempio) in una piastra da 24 pozzetti con 1 x 10⁵ celle (per una densità di semina di 50.000 cellule / cm²).
6. Aggiungere la soluzione DMEM fino a 500 μL (aggiungere prima la soluzione DMEM ai pozzetti), quindi etichettare un pozzetto per trattamento come segue: nessun controllo del colore, controllo mKO2, controllo TagBFP, controllo NeonGreen, controllo di tutti i colori e poli-trasfezione 1. I pozzetti di controllo TagBFP, mKO2 e NeonGreen sono controlli a colore singolo per tutte le proteine fluorescenti incluse nella poli-trasfezione.

2. Esecuzione della trasfezione

1. Preparare provette per ogni aggregato di DNA. Mettere da parte i tubi di microcentrifuga da 1,5 ml ed etichettare i tubi come: nessun controllo del colore, controllo mKO2, controllo TagBFP, controllo NeonGreen, controllo di tutti i colori, mix di politrasfezione 1 e mix di politrasfezione 2.
   1. Aggiungere 36 μL di mezzo sierico ridotto al controllo senza colore, al controllo mKO2, al controllo TagBFP, al controllo NeonGreen e a tutti i tubi di controllo del colore. Aggiungere 18 μL di mezzo sierico ridotto a ciascuna delle provette della miscela di politrasfezione 1 e della miscela di politrasfezione 2.
      NOTA: Si presume che le concentrazioni di plasmide siano 150 ng/μL.
   2. Aggiungere 600 ng di plasmide di riempimento al tubo di controllo senza colore. Aggiungere 300 ng di mKO2 e 300 ng di plasmide di riempimento al tubo di controllo del colore mKO2. Aggiungere 300 ng di TagBFP e 300 ng di plasmide di riempimento al tubo di controllo del colore TagBFP.
   3. Aggiungere 300 ng di plasmide NeonGreen costitutivo e 300 ng di plasmide di riempimento al tubo di controllo del colore NeonGreen. Aggiungere 100 ng ciascuno di mKO2, TagBFP e NeonGreen costitutivo, nonché 300 ng di plasmide di riempimento, al tubo di controllo di tutti i colori.
   4. Aggiungere 150 ng di mKO2 al tubo di mix 1 di poli-trasfezione. Aggiungere 75 ng di plasmide NeonGreen reporter e 75 ng di plasmide di riempimento al tubo di mix 1 di poli-trasfezione.
   5. Aggiungere 150 ng di TagBFP al tubo della miscela 2 di politrasfezione. Aggiungere 75 ng di plasmide L7ae e 75 ng di plasmide di riempimento al tubo di miscela 2 di poli-trasfezione.
2. Creare la miscela master di trasfezione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL combinando 216 μL di mezzo sierico ridotto con 9,48 μL di reagente di trasfezione (vedere Tabella 1 per i rapporti dei reagenti e il ridimensionamento della reazione). Mescolare bene pipettando su e giù e mettere da parte.
3. Aggiungere 1,58 μL di reagente enhancer a ciascuno dei tubi di controllo del colore senza colore, controllo del colore singolo e tutti i tubi di controllo del colore. Aggiungere 79 μL di reagente enhancer a ciascuno dei tubi di miscela di poli-trasfezione. Mescolare ogni tubo singolarmente pipettando energicamente.
4. Aggiungere la miscela master di trasfezione a ciascuna provetta contenente DNA.
   1. Aggiungere 37,58 μL di master mix di trasfezione a ciascuno dei tubi senza controllo colore, controllo colore singolo e tutti i tubi di controllo colore. Mescolare ogni tubo singolarmente pipettando energicamente.
   2. Aggiungere 18,79 μL di master mix di trasfezione a ciascuno dei tubi di mix di politrasfezione. Mescolare ogni tubo singolarmente pipettando energicamente.
5. Erogare le miscele di trasfezione nei pozzetti.
   1. Pipettare 65,97 μL di ogni miscela di trasfezione per i controlli senza colore, colore singolo e tutti i colori nei pozzetti corrispondenti.
   2. Pipetta 32,98 μL della poli-trasfezione mescolare 1 nel pozzetto di poli-trasfezione e ruotare la piastra rapidamente ma delicatamente in un modello a otto figure stretto lungo una superficie piana per distribuire efficacemente i complessi. Quindi, pipettare 32,98 μL della poli-trasfezione mescolare 2 nello stesso pozzo di poli-trasfezione e ruotare la piastra nello stesso modo.
6. Porre la piastra in un incubatore a 37 °C, con il 5% di CO₂ e senza agitare, per un periodo di 48 ore.
   NOTA: Per aumentare la vitalità cellulare, i mezzi cellulari possono essere sostituiti ogni 6 ore dopo la trasfezione (anche se questo non è sempre necessario, e con le cellule HEK293 e i suoi derivati, bisogna fare attenzione a non staccare le cellule dalla piastra quando si cambia il supporto).

Reagente	Importo			Scalata
Mezzo sierico ridotto per la miscela di DNA	36 μL per tubo di controllo, 18 μL per tubo di politrasfezione			0,05 μL Riduzione del terreno sierico/ng DNA per provetta, con il 10-20% di volume extra per tenere conto del pipettaggio
DNA	300-600 ng per tubo
P3000	1,58 μL per tubo di controllo, 0,79 μL per tubo di poli-trasfezione			0,0022 μL P3000/ng DNA per provetta, con il 10-20% in più
Mezzo sierico ridotto per Lipo master mix	36 μL per tubo di controllo, 18 μL per tubo di politrasfezione			0,05 μL di terreno sierico ridotto/ng DNA totale, con il 10-20% di volume extra per tenere conto del pipettaggio
Reagente di trasfezione e potenziatore	1,58 μL per tubo di controllo, 0,79 μL per tubo di poli-trasfezione			0,0022 μL di Lipofectamine 3000/ng DNA, con il 10-20% in più

Tabella 1: Ridimensionamento del reagente per le trasfezioni. La tabella indica il corretto rapporto di reagente da includere per la quantità di DNA inclusa in un singolo pozzetto. Questo può essere usato per scalare le reazioni in modo efficace e formare master mix. Le quantità di reagente sono state scalate per includere un eccesso del 20%.

3. Preparazione delle cellule per la citometria a flusso

1. Preriscaldare almeno 4,2 mL della soluzione DMEM a 37 °C. Preriscaldare almeno 4,2 mL di tripsina e 4,2 mL di PBS a 37 °C. Conservare la soluzione tampone di selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) a 4 °C fino al momento dell'uso.
2. Risospendere le cellule nella soluzione tampone FACS (PBS integrato con 1% BSA, 5 mM di acido etilendiamminotetraacetico [EDTA] e 0,1% di azoturo di sodio [NaN₃], per ridurre l'aggregazione; vedere Tabella dei materiali) come descritto di seguito.
   1. Aspirare e smaltire il fluido corrente in ciascun pozzetto. Erogare 5 ml di PBS in ciascun pozzetto per lavare le cellule. Aspirare e smaltire il PBS.
   2. Erogare 5 mL di tripsina in ciascun pozzetto. Posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 °C per 3 minuti o fino a quando le celle non aderiscono più al piatto. Riportare la piastra nell'armadio di biosicurezza e diluire le soluzioni cellulari erogando 5 ml di soluzione DMEM in ciascun pozzetto.
   3. Per ogni pozzetto, mescolare la soluzione pipettando delicatamente su e giù più volte. Per ogni pozzetto, aspirare tutti i mezzi e posizionarli in un tubo conico da 15 ml.
3. Centrifugare le celle a 300 x g per 3 minuti per pellettizzarle. Aspirare il mezzo, facendo attenzione a non aspirare le cellule e scartarlo. In ogni provetta, risospendere le cellule in 5 mL di soluzione tampone FACS, mescolando delicatamente pipettando su e giù.
4. Far passare ogni soluzione di sospensione cellulare attraverso un filtro (per rimuovere i grumi) in tubi conici di citometria a flusso separati. Tenere questi tubi sul ghiaccio per non più di 1 ora ed eseguire la citometria a flusso il prima possibile.

4. Esecuzione della citometria a flusso

NOTA: l'utilizzo di un citometro a flusso richiede una formazione adeguata e la conoscenza dei compiti necessari. Poiché il software e le apparecchiature possono variare e gli utenti devono essere formati in generale, questa sezione fa riferimento a operazioni specifiche che sono utili da eseguire.

1. In primo luogo, esaminare le cellule trasfettate con il controllo plasmidico di riempimento (nessun controllo del colore) per selezionare le caratteristiche della cella ed evitare anomalie (inclusi aggregati, detriti, ecc.). Sebbene esistano molte combinazioni di parametri per distinguere le celle, utilizzare le tre opzioni generali seguenti come un buon modo per visualizzare le caratteristiche distintive.
   1. Osservate l'area di dispersione laterale (scala logaritmica o lineare per preferenza/tipo di cella) rispetto all'area di dispersione diretta (scala lineare).
   2. Osservate l'altezza di dispersione laterale (scala logaritmica) rispetto alla larghezza di dispersione laterale (scala lineare).
   3. Osservate la larghezza di dispersione in avanti (scala lineare) rispetto all'altezza di dispersione in avanti (scala lineare).
2. Quindi, guarda i controlli a colore singolo. Utilizzare il controllo all color per sintonizzare le tensioni dello strumento, in modo tale che i segnali provenienti da ciascuna proteina fluorescente siano normalizzati in unità arbitrarie equivalenti (u.a.) di fluorescenza. Quindi, eseguire i controlli a colore singolo per ciascuna proteina fluorescente, che vengono utilizzati per impostare la matrice di compensazione, consentendo la correzione del bleed-through.
   NOTA: Idealmente, dovrebbe essere visibile l'intera gamma dinamica dei valori di fluorescenza. Un'ulteriore normalizzazione dei segnali proteici fluorescenti può essere effettuata tramite conversione in unità standardizzate (ad esempio, molecole di fluoresceina equivalente [MEFL; vedi Beal et ^al.15]). Per consentire la conversione MEFL durante l'analisi, eseguire le perle di calibrazione arcobaleno. Tale calibrazione è utile anche per ridurre la variazione del segnale da strumento a strumento e da giorno a giorno¹⁶.
3. Eseguire la provetta di campionamento di poli-trasfezione.
   NOTA: Dove possibile, si consiglia di eseguire celle di 1.000 x 10^ (^ = miscele), poiché le poli-trasfezioni di dimensione superiore devono essere suddivise in più contenitori durante l'analisi e ogni contenitore ha bisogno di celle sufficienti (idealmente >10) per fare confronti statisticamente significativi.

5. Esecuzione di analisi post-esperimento

1. Inizialmente, utilizzare i dati dei controlli (e, se applicabile, delle perline) per garantire risultati accurati. Utilizzare uno degli strumenti software disponibili per eseguire il gating cellulare sotto tensione (utilizzando i gate descritti sopra), la compensazione e la correzione dell'autofluorescenza.
   NOTA: In genere utilizziamo codice MATLAB personalizzato (ad esempio, https://github.com/jonesr18/MATLAB_Flow_Analysis o Cytoflow¹⁷), che ha sia un'interfaccia utente grafica che una libreria python adatta per la fase di pre-elaborazione e per l'analisi della poli-trasfezione.

Metodo	Complesso	ng Marcatore fluorescente	ng L7ae (frazione)	ng Reporter (frazione)	ng DNA di riempimento (frazione)	Totale (ng)
Poli-trasfezione 1						600
→	1	150	75 (½)		75 (½)	300
→	2	150		75 (½)	75 (½)	300
Poli-trasfezione 2						600
→	1	150	25 (1/6)		125 (5/6)	300
→	2	150		125 (5/6)	25(1/6)	300

Tabella 2: quantità di DNA per la poli-trasfezione dimostrate nel protocollo e un esempio di esperimento di follow-up con rapporti plasmidici sintonizzati. La metà superiore della tabella mostra la composizione dei plasmidi utilizzati in un semplice esperimento di poli-trasfezione. La metà inferiore mostra la composizione di un esperimento aggiornato che regola i rapporti plasmidi per sottocampionare meglio uno spazio di concentrazione ipotetico, in cui il modulatore dell'espressione genica è ad un rapporto 1: 5 più ottimale rispetto al suo reporter, producendo più cellule trasfettate da campionare intorno a questo rapporto.

Risultati

Nella Figura 1, confrontiamo la co-trasfezione con la poli-trasfezione. In una co-trasfezione, tutti i plasmidi vengono consegnati nello stesso mix di trasfezione, con conseguente alta correlazione tra la quantità di ciascun plasmide che ogni singola cellula riceve (Figura 1A). Mentre il numero di plasmidi totali consegnati a ciascuna cellula varia in modo significativo, la fluorescenza delle due proteine reporter nelle singole cellule in tutta la popolazione ?...

Discussione

I metodi di prototipazione rapida come la progettazione assistita da computer (CAD), il breadboard e la stampa 3D hanno rivoluzionato le discipline meccaniche, elettriche e di ingegneria civile. La capacità di cercare rapidamente tra molte possibili soluzioni a una determinata sfida accelera notevolmente i progressi in un campo. Riteniamo che la poli-trasfezione sia una tecnologia analoga per l'ingegneria biologica, che consente la prototipazione rapida dei circuiti genetici. Inoltre, altre tecnologie di prototipazione ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
15mL Corning Falcon conical tubes	ThermoFisher Scientific	14-959-53A
24-well petri dish	Any company of choice		(Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free)
Bovine serum albumin	NEB	B9000S
Centrifuge	Any company of choice		Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf
Countess 3 Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific	AMQAX2000
Countess Cell Counting Chamber Slides	ThermoFisher Scientific	C10228
Cytoflow	Non-commercial software package		https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/#
DMEM	VWR	10-013-CV	Use the correct media for your cell type
EDTA	ThermoFisher Scientific	03690-100ML
Fetal bovine serum	Sigma Aldrich	F4135
HEK cells	ATCC	CRL-1573	Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently.
HeLa cells	ATCC	CRL-12401	Use the relevant cell type for your experiments.
Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer	ThermoFisher Scientific	L3000001	Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent
LSRFortessa flow cytometer	BD Biosciences	N/A
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050
Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL	Any company of choice
Opti-MEM	ThermoFisher Scientific	31985070	reduced serum medium
Phosphate buffered saline	ThermoFisher Scientific	70011044
Rainbow calibration beads	Spherotech	URCP-100-2H
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002
Trypsin	VWR	25-053-CI