Uitlijning van optische coherentietomografievezelgrammen in zichtbaar licht met confocale beelden van hetzelfde netvlies van de muis

Summary

Het huidige protocol schetst de stappen voor het in vivo uitlijnen van optische coherentietomografie-vezelgrafiebeelden (vis-OCTF) in vivo met ex vivo confocale beelden van hetzelfde netvlies van muizen met het oog op het verifiëren van de waargenomen morfologie van de axonbundel van retinale ganglioncellen in de in vivo beelden.

Abstract

In de afgelopen jaren is in vivo retinale beeldvorming, die niet-invasieve, real-time en longitudinale informatie over biologische systemen en processen biedt, steeds vaker toegepast om een objectieve beoordeling van neurale schade bij oogziekten te verkrijgen. Ex vivo confocale beeldvorming van hetzelfde netvlies is vaak nodig om de in vivo bevindingen te valideren, vooral in dieronderzoek. In deze studie demonstreerden we een methode om een ex vivo confocaal beeld van het netvlies van de muis uit te lijnen met de in vivo beelden. Een nieuwe klinische beeldvormingstechnologie, optische coherentietomografievezelgrafie met zichtbaar licht (vis-OCTF) genaamd, werd toegepast om in vivo beelden van het netvlies van de muis te verkrijgen. Vervolgens voerden we de confocale beeldvorming uit van hetzelfde netvlies als de "gouden standaard" om de in vivo vis-OCTF-beelden te valideren. Deze studie maakt niet alleen verder onderzoek van de moleculaire en cellulaire mechanismen mogelijk, maar legt ook de basis voor een gevoelige en objectieve evaluatie van neurale schade in vivo.

Introduction

Retinale ganglioncellen (RGC's) spelen een cruciale rol bij de visuele informatieverwerking, ontvangen synaptische input via hun dendritische bomen in de binnenste plexiforme laag (IPL) en verzenden de informatie via hun axonen in de retinale zenuwvezellaag (RNFL) naar de hersenen 1,2,3,4. Bij zieke aandoeningen zoals glaucoom kan vroege RGC-degeneratie leiden tot subtiele veranderingen in de RNFL, de ganglioncellaag (GCL), de IPL en de oogzenuw bij zowel patiënten als knaagdiermodellen 5,6,7,8,9....

Protocol

Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Virginia en voldoen aan de richtlijn voor het gebruik van dieren van het National Institute of Health (NIH). Zie de Materiaaltabel voor details met betrekking tot alle materialen, reagentia en instrumenten die in dit protocol worden gebruikt.

1. In vivo vs-OCT-beeldvorming

1. Het vis-OCT-systeem
   1. Stel de ogen van de muizen voor me.......

Discussion

Er zijn twee stappen in dit protocol die aandacht behoeven. Ten eerste is het noodzakelijk om ervoor te zorgen dat het dier onder diepe anesthesie is en dat hun ogen volledig verwijd zijn voordat ze OCT-beeldvorming zien. Als de muizen niet voldoende worden verdoofd, kan hun snelle ademhaling leiden tot onstabiele bewegingen van de en-face beelden, wat de kwaliteit van het fibergram nadelig kan beïnvloeden. Bovendien kan onvoldoende ontsluiting ook een negatieve invloed hebben op de beeldkwaliteit, aangezien de.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Halo 100	Opticent Health, Evanston, IL
Zeiss LSM800 microscope	Carl Zeiss
Drugs and antibodies
4% paraformaldehyde (PFA)	Santz Cruz Biotechnology, SC-281692		1-2 drops
Bovine serum albumin powder	Fisher Scientific, BP9706-100		1:10
Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dye	Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202		1:1,000
Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dye	Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209		1:1,000
Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL))	Covetrus, NDC 11695-4860-1		15.6 mg/mL
Ketamine	Covetrus, NADA043304		114 mg/kg
Mouse anti-Tuj1	A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia		1:200
Normal donkey serum(NDS)	Millipore Sigma, S30-100 mL		1:100
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4 (Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4)	Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K3		1:10
Rat anti-ICAM-2	BD Pharmingen, Cat#553325		1:500
Tropicamide drops	Covetrus, NDC17478-102-12
Triton X-100 (Reagent Grade)	VWR, CAS: 9002-93-1		1:20
Vectashield mounting medium	Vector Laboratories Inc. H2000-10
Xylazine	Covetrus, NDC59399-110-20		17 mg/kg