マウス骨格筋の未分画バルク培養によるニッチおよび幹細胞の静止を再現

要約

骨格筋は、常在幹細胞を含む複数の細胞タイプで構成されており、それぞれが筋肉の恒常性と再生に特別な貢献をしています。ここでは、生理学的、in vivo、および環境的特性の多くを保持するex vivo環境での筋幹細胞および筋細胞ニッチの2D培養について説明します。

要約

骨格筋は体の中で最大の組織であり、運動から体温調節まで、複数の機能を果たします。その機能と損傷からの回復は、多数の細胞タイプと、コア筋細胞(筋繊維、筋幹細胞)とそのニッチの間の分子シグナルに依存しています。ほとんどの実験環境では、この複雑な生理学的微小環境は維持されず、筋幹細胞にとって重要な細胞状態である休止状態のex vivo 研究も許可されていません。ここでは、ニッチの細胞成分を持つ筋幹細胞の ex vivo 培養のためのプロトコルが概説されています。筋肉の機械的および酵素的分解を通じて、細胞タイプの混合物が得られ、それは2D培養に入れられます。免疫染色は、1週間以内に、筋線維、そして重要なことに、静止筋幹細胞の特徴を示すPax7陽性細胞とともに、複数のニッチ細胞が培養中に存在することを示しています。これらの独特な特性はこのプロトコルに基本的で、translational質問に演説するのに使用することができる静止そっくりの幹細胞の細胞拡大そして生成のための強力な用具をする。

概要

運動、呼吸、代謝、姿勢、体温の維持はすべて骨格筋に依存しており、骨格筋の機能不全は衰弱性の病状(ミオパチー、筋ジストロフィーなど)を引き起こす可能性があります。¹.骨格筋は、その本質的な機能と豊富さから、正常な筋肉機能をサポートし、治療標的として役立つ重要な側面を理解しようと努力する世界中の研究機関の注目を集めています。さらに、骨格筋は、主にその常在幹細胞2により、健康な筋肉が完全な損傷や変性の後に完全に自己修復できるため、再生と^{幹細胞機能}を研究するために広く使用されているモデルです。これらはサテライト細胞とも呼ばれ、筋線維³の周辺の基底層の下に局在している。

成人の骨格筋の中核となる細胞は、筋線維(長い合胞体多核細胞)とサテライト細胞(筋原性を有する幹細胞で、損傷によって活性化されるまで静止している)です。後者の細胞は筋肉再生の中心細胞であり、このプロセスはそれらがない場合には起こり得ません^4,5,6,7。その身近な微小環境には、複数の....

プロトコル

すべての実験は、Institut Mondor de Recherche Biomédicale(INSERM U955)のフランスおよびEUの動物規制、特に指令2010/63/UEに準拠しています。動物は、認証番号A94、028、379およびD94-028-028の動物施設で管理され、充実した環境で飼育されました。それらは許可された研究者と動物の世話人によってのみ取り扱われ、動物飼育施設の職員によって目視検査が行われ、生涯にわたって不快感の兆候がないか確認されました。彼らは解剖前に子宮頸部脱臼によって安楽死させられた。動物の生涯の間に介入処置は行われなかった。したがって、倫理委員会とフランス高等教育研究イノベーション省から手続きの承認を得る必要はありませんでした。実際、指令2010/63/UEによると、安楽死と死後解剖には倫理的クリアランスは必要ありません。本稿で発表した結果は、野生型C57BL/6NRj系統( 材料表参照)とトランスジェニック Tg:Pax7-nGFP 系統¹²(我々のチームで作製)によるものです。プロトコルは、8〜12週齢の雄および雌のマウスに適用されました。

1. 試薬および装置調製、前消化

1. 解剖器具(直線および湾曲したハサミ、鉗子、 材料表を参照)に70%エタノール....

結果

このプロトコルは内生ニッチから衛星細胞そしてほとんどのセルを維持している間筋肉細胞培養を可能にする。図 2 はプロトコルの主なステップをまとめたもので、図 1 は解剖と消化の重要な部分を示しています。後肢の筋肉組織の解剖が推奨されます(図1A-C)、この筋肉群はよく研究されており、発.......

ディスカッション

成人の骨格筋の機能は、精巧に調整された一連の細胞間相互作用と分子シグナルによって支えられています。ここでは、生理学的微小環境によく似た ex vivo 環境でこれらのパラメータの研究を可能にする方法を提示する。

いくつかのグループは、筋原性細胞を培養するためのin vitro法を報告しています。これらの方法は、サテライト細胞を単離して、その筋.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-CD31	BD	550274	dilution 1:100
anti-FOSB	Santa Cruz	sc-7203	dilution 1:200
anti-GFP	Abcam	ab13970	dilution 1:1000
anti-Ki67	Abcam	ab16667	dilution 1:1000
anti-MyHC	DSHB	MF20-c	dilution 1:400
anti-MYOD	Active Motif	39991	dilution 1:200
anti-MYOG	Santa Cruz	sc-576	dilution 1:150
anti-Pax7	Santa Cruz	sc-81648	dilution 1:100
anti-PDGFRα	Invitrogen	PA5-16571	dilution 1:50
b-FGF	Peprotech	450-33	concentration 4 ng/mL
bovine serum albumin (BSA) – used for digestion	Sigma Aldrich	A7906-1006	concentration 0.2%
BSA IgG-free, protease-free – used for staining	Jackson ImmunoResearch	001-000-162	concentration 5%
cell strainer 40 um	Dominique Dutscher	352340
cell strainer 70 um	Dominique Dutscher	352350
cell strainer 100 um	Dominique Dutscher	352360
Collagenase	Roche	10103586001	concentration 0.5 U/mL
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Euromedex	UD8050-05-A
Dispase	Roche	4942078001	concentration 3 U/mL
Dissection forceps size 5	Fine Science Tools	91150-20
Dissection forceps size 55	Fine Science Tools	11295-51
Dissection scissors (big, straight)	Fine Science Tools	9146-11	ideal for chopping
Dissection scissors (small, curved)	Fine Science Tools	15017-10
Dissection scissors (small, straight)	Fine Science Tools	14084-08
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	ThermoFisher	41966-029
EdU Click-iT kit	ThermoFisher	C10340
Fetal bovine serum – option 1	Eurobio	CVF00-01
Fetal bovine serum – option 2	Gibco	10270-106
Matrigel	Corning Life Sciences	354234	coating solution
Parafilm	Dominique Dutscher	090261	flexible film
Penicillin streptomycin	Gibco	15140-122
Paraformaldehyde – option 1	PanReac AppliChem ITW Reagents	211511.1209	concentration 4%
Paraformaldeyde – option 2	ThermoFisher	28908	concentration 4%
Shaking water bath	ThermoFisher	TSSWB27
TritonX100	Sigma Aldrich	T8532-500 ML	concentration 0.5%
Wild-type mice	Janvier	C57BL/6NRj