Alineación de datos sincronizados de series temporales utilizando el modelo de caracterización de la pérdida de sincronía del ciclo celular para comparaciones entre experimentos

Resumen

Un desafío de analizar experimentos sincronizados de series de tiempo es que los experimentos a menudo difieren en la duración de la recuperación de la sincronía y el período del ciclo celular. Por lo tanto, las mediciones de diferentes experimentos no pueden analizarse en conjunto o compararse fácilmente. Aquí, describimos un método para alinear experimentos para permitir comparaciones específicas de fase.

Resumen

La investigación del ciclo celular a menudo depende de la sincronización de las poblaciones celulares para medir varios parámetros en una serie de tiempo a medida que las células atraviesan el ciclo celular. Sin embargo, incluso en condiciones similares, los experimentos replicados muestran diferencias en el tiempo requerido para recuperarse de la sincronía y atravesar el ciclo celular, evitando así las comparaciones directas en cada punto de tiempo. El problema de comparar mediciones dinámicas entre experimentos se exacerba en poblaciones mutantes o en condiciones de crecimiento alternativas que afectan el tiempo de recuperación de sincronía y / o el período del ciclo celular.

Hemos publicado previamente un modelo matemático paramétrico llamado Caracterización de la pérdida de sincronía del ciclo celular (CLOCCS) que monitorea cómo las poblaciones sincrónicas de células se liberan de la sincronía y progresan a través del ciclo celular. Los parámetros aprendidos del modelo se pueden usar para convertir puntos de tiempo experimentales de experimentos sincronizados de series temporales en una escala de tiempo normalizada (puntos de línea de vida). En lugar de representar el tiempo transcurrido en minutos desde el inicio del experimento, la escala de línea de vida representa la progresión desde la sincronía hasta la entrada del ciclo celular y luego a través de las fases del ciclo celular. Dado que los puntos de la línea de vida corresponden a la fase de la célula promedio dentro de la población sincronizada, esta escala de tiempo normalizada permite comparaciones directas entre experimentos, incluidos aquellos con períodos y tiempos de recuperación variables. Además, el modelo se ha utilizado para alinear experimentos de ciclo celular entre diferentes especies (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae y Schizosaccharomyces pombe), permitiendo así la comparación directa de las mediciones del ciclo celular, que pueden revelar similitudes y diferencias evolutivas.

Introducción

Las mediciones de series temporales realizadas en poblaciones sincronizadas de células a medida que progresan a través del ciclo celular es un método estándar para investigar los mecanismos que controlan la progresión del ciclo celular 1,2,3,4,5,6,7,8 . La capacidad de hacer comparaciones entre experimentos de series temporales de sincronía / lanzamiento es vital para nuestra comprensión de estos procesos dinámicos. El uso de experimentos replicados para corroborar los hallazgos puede aumentar la confianza en la reproducibilidad de las conclusiones. Además, las comparaciones entre las condiciones ambientales, entre mutantes e incluso entre especies pueden descubrir muchos nuevos conocimientos sobre la regulación del ciclo celular. Sin embargo, la variabilidad interexperimental en la recuperación de la sincronía y en la velocidad de la progresión del ciclo celular afecta la capacidad de hacer comparaciones de punto a punto de tiempo entre réplicas o entre experimentos con tiempo alterado del ciclo celular. Debido a estos desafíos, las réplicas a menudo no se incluyen para la serie de tiempo completo (por ejemplo, Spellman et ^al.4). Cuando se recopilan réplicas para toda la serie temporal, los datos no se pueden analizar en conjunto, sino que se utiliza una sola réplica para el análisis, y otras réplicas a menudo se relegan a cifras suplementarias (por ejemplo, Orlando et ^al.8). Además, las comparaciones entre experimentos con diferentes características de recuperación o progresión del ciclo celular son difíciles. Las mediciones de intervalos más pequeños entre un evento de interés y un punto de referencia del ciclo celular (por ejemplo, emergencia de brotes, entrada en fase S o inicio en anafase) pueden ayudar a reducir los errores si se realiza un seguimiento de estos eventos de referencia 1,2,3,9,10,11,12. Sin embargo, las diferencias sutiles pero importantes pueden permanecer sin ser detectadas u ocultas utilizando estos métodos ad hoc. Finalmente, los análisis de células individuales permiten analizar la progresión del ciclo celular sin depender de la sincronización o la alineación¹³, aunque las mediciones a gran escala en estudios de células individuales pueden ser desafiantes y costosas.

Para superar estas dificultades, desarrollamos el modelo Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony (CLOCCS) para ayudar al análisis de las mediciones de series temporales realizadas en poblaciones sincronizadas^14,15. CLOCCS es un modelo matemático flexible que describe la distribución de células sincronizadas a través de las fases del ciclo celular a medida que se liberan de la sincronía y progresan a través del ciclo celular. El marco del proceso de ramificación permite que el modelo tenga en cuenta las cualidades asimétricas de las células madre e hija después de la división, como se observa en S. cerevisiae, sin dejar de ser útil para organismos que se dividen por fisión, como S. pombe. El modelo puede tomar entradas de un conjunto diverso de tipos de medición para especificar la fase del ciclo celular. Puede ingerir datos de fase del ciclo celular en ciernes, que incluyen mediciones del porcentaje de células gemadas a lo largo del tiempo, lo que permite la estimación del número de células fuera de la fase G1 no brotada^14,15. El modelo también puede ingerir datos citométricos de flujo que miden el contenido de ADN, lo que permite la evaluación de transiciones históricas de G1 a S, S a G2 y M a G1¹⁵. Los marcadores morfológicos fluorescentes también se pueden utilizar para identificar la fase del ciclo celular. El marcado fluorescente de los anillos, núcleos y cuerpos de polo fusiforme (SPB) de miosina se puede utilizar para determinar la fase del ciclo celular, y estos se incorporaron al modelo^{CLOCCS 11}; Sin embargo, estas mediciones no se describirán en este protocolo. Además, el índice de septación se utilizó como entrada para modelar datos de S. pombe¹⁴. Por lo tanto, el modelo se puede utilizar para análisis del ciclo celular en una variedad de organismos y se puede ampliar aún más.

CLOCCS es un modelo paramétrico que permite la inferencia bayesiana completa de múltiples parámetros a partir de los datos de entrada (por ejemplo, porcentaje de gemación, contenido de ADN). Estos parámetros incluyen el tiempo de recuperación de la sincronía, la duración del período del ciclo celular (estimado por separado para las células madre e hija) y la posición promedio del ciclo celular de las células en cada punto de tiempo. Estos parámetros representan el comportamiento de la célula promedio en la población, lo que permite al investigador mapear cada punto de tiempo a una posición del ciclo celular expresada como un punto de línea de vida. La conversión a puntos de línea de vida depende de los parámetros lambda (λ) y mu0 (μ₀)^14,15 de CLOCCS. El parámetro λ corresponde al período promedio del ciclo celular de las células madre. Sin embargo, debido al retraso madre-hija^14,15, este no es el período promedio del ciclo celular de toda la población que incluye tanto las células madre como hija. CLOCCS también infiere el parámetro delta (δ), que corresponde al retraso madre-hija y, por lo tanto, permite el cálculo del período promedio del ciclo celular de toda la población. Finalmente, debido a que cada experimento comienza después de la liberación de la sincronización del ciclo celular, el tiempo requerido para recuperarse del método de sincronización se representa mediante el parámetro CLOCCS μ₀. CLOCCS ajusta un modelo a los datos de fase del ciclo celular de entrada y luego infiere estos parámetros utilizando un algoritmo de Monte Carlo de cadena de Markov aleatorio^14,15. Al mapear múltiples experimentos a una escala de tiempo común de la línea de vida del ciclo celular, se pueden hacer comparaciones directas específicas de fase entre réplicas o experimentos donde el tiempo de recuperación o los períodos del ciclo celular no son idénticos 8,14,15.

Como las poblaciones sincronizadas pierden sincronía a cierto ritmo en el transcurso de la serie temporal^14,15,16,17, la variabilidad en la tasa de pérdida de sincronía también puede impedir las comparaciones cuantitativas entre experimentos. Al identificar la ubicación de las poblaciones y la varianza en sus distribuciones, CLOCCS explica las diferencias en las tasas de pérdida de sincronía. Esta poderosa herramienta permite comparaciones específicas y detalladas entre experimentos, proporcionando así la capacidad de hacer directamente comparaciones relevantes no solo entre réplicas sino también entre condiciones ambientales, mutantes e incluso especies que tienen un tiempo de ciclo celular dramáticamente diferente^14,15.

Este documento describe un método que utiliza CLOCCS para estimar parámetros ajustando datos de experimentos de series temporales de sincronía / liberación, mapear los datos a una escala de línea de vida común y luego hacer comparaciones relevantes entre réplicas o experimentos. La alineación de la línea de vida permite comparaciones directas específicas de fase a través de estos experimentos, lo que permite la agregación y comparación de réplicas y para hacer comparaciones más relevantes entre experimentos con diferentes tiempos de recuperación y períodos de ciclo celular.

Protocolo

1. Recopilación de datos experimentales y de fase del ciclo celular

1. Sincronizar las células con respecto al ciclo celular utilizando el método de sincronización deseado (por ejemplo, elutriación centrífuga como se describe en Leman et al.18 o detención de feromonas de apareamiento como se describe en Rosebrock 19; tanto Leman et al.18 como Rosebrock¹⁹ también incluyen métodos para la liberación de la sincronía). Comience el muestreo a lo largo de la serie temporal, asegurándose de que la serie temporal tenga al menos dos períodos completos de ciclo celular de duración, y de manera óptima, recoja al menos 10 muestras por ciclo celular. En cada punto de tiempo, recoja una muestra para los datos de fase del ciclo celular (citometría de gemación o flujo) y una muestra para los datos experimentales, como se describe a continuación.
2. Si utiliza datos de gemación como datos de fase del ciclo celular, recopile datos sobre gemación para la alineación de CLOCCS.
   1. Muestra a lo largo de la serie temporal. Para cada punto de tiempo, recolecte células y fíjelas mezclando 200 μL de cultivo celular sonicado con 200 μL de solución fijadora, como se describe en Leman et ^al.18.
   2. Para la gemación estándar, cuente al menos 200 células por punto de tiempo usando un microscopio de luz transmitida con un objetivo 40x y un hemocitómetro. Añadir la muestra de células del paso 1.2.1 al hemocitómetro y diluir si la densidad impide el recuento. Registre el número de celdas con y sin budds en cada punto de tiempo. Calcule el porcentaje de celdas en gemación y trace cada punto de tiempo en una curva en ciernes.
      NOTA: Hay disponibles otros métodos para especificar la información de fase del ciclo celular, pero no se describen en este protocolo. Los otros métodos se describen en el archivo léame de CLOCCS y en un trabajo anterior¹¹.
3. Si utiliza datos de contenido de ADN por citometría de flujo como datos de fase del ciclo celular, recopile datos de tinción de ADN de citometría de flujo para la alineación CLOCCS de citometría de flujo.
   1. Muestra a lo largo de la serie temporal. Para cada punto de tiempo, recopile celdas y corríjalas como se describe en Haase y Reed²⁰.
   2. Manchar el ADN y analizar mediante el análisis citométrico de flujo estándar. Un protocolo de tinción recomendado para S. cerevisiae se describe en Haase y Reed²⁰.
4. Recopilar ómicas asociadas o datos experimentales relacionados. Para obtener datos transcriptómicos estándar, recopilar como se describe en Leman et ^al.18 y Kelliher et ^al.21,22. Asegúrese de que los datos estén asociados con puntos de tiempo que contengan datos de fase del ciclo celular para permitir la alineación posterior. Para una alineación óptima, asegúrese de que cada punto de tiempo que contenga datos experimentales también tenga datos de fase asociados.
   NOTA: Los datos experimentales pueden tomar muchas formas. Tradicionalmente, utilizamos el método de alineación descrito para alinear experimentos transcriptómicos de series temporales. Sin embargo, cualquier tipo de datos asociados con puntos de tiempo puede alinearse (es decir, proteómica²²).

2. Instalación del software requerido

NOTA: En esta sección se supone que Conda, Java 19 y Git ya están instalados (tabla de materiales).

1. Descargue el repositorio de CLOCCS_alignment introduciendo el siguiente comando en el terminal:
   Git Clone Git Clone https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
2. Cree un entorno de Conda utilizando el archivo conda_req.yml introduciendo el siguiente comando en el terminal en la carpeta donde se clonó el repositorio de CLOCCS_alignment:
   conda env create -f conda_req.yml

3. Uso de CLOCCS para parametrizar los experimentos

1. Haga doble clic en el archivo cloccs_v2023.jar en la carpeta CLOCCS en el repositorio de CLOCCS_alignment y espere a que se abra una interfaz gráfica de usuario. Esta pantalla permite ingresar opciones para la ejecución de CLOCCS y muestra los resultados una vez ejecutada.
2. Introduzca la configuración general.
   1. Establezca Sim Anneal, Burn In e Iterations escribiendo en los cuadros de entrada de texto asociados. Sim Anneal (recocido simulado) identifica buenos valores de parámetros iniciales, Burn In busca modos posteriores y la etapa final permite extraer todas las inferencias posteriores. Los valores más altos aumentan el tiempo de ejecución, pero también aumentan la precisión.
   2. Ingrese las condiciones experimentales especificando la temperatura en grados Celsius y el método de sincronización utilizando el cuadro de texto etiquetado Temperatura y el menú desplegable Sincro. Método, respectivamente.
   3. Opcionalmente, configure los ajustes avanzados en el menú Configuración avanzada. La configuración avanzada permite establecer priores para cada uno de los parámetros ("mu0", "sigma0", "sigmav", "lambda", "bud.start", "bud.end").
      NOTA: Puede encontrar más información sobre la configuración avanzada en el archivo léame.txt en la carpeta CLOCCS del repositorio de CLOCCS_alignment.
3. Introduzca la configuración para usarla con los datos en ciernes.
   1. Elija la selección adecuada en el menú desplegable Tipo de modelo . La opción predeterminada Bud es para información de gemación estándar para levadura en ciernes.
      NOTA: También existen otras opciones más avanzadas en el menú desplegable: Mutante para información de gemación para mutantes que experimentan múltiples ciclos de gemación sin división, BudSSLSMR para información de gemación e información adicional sobre el cuerpo del polo del huso y el anillo de miosina, y BudNucDivNeck para información sobre gemación e información adicional sobre núcleos divisorios y de cuello de brotación. Estas opciones avanzadas se describen en el archivo léame de CLOCCS y en trabajos anteriores^11,14,15.
   2. Importe los datos mediante el panel Importación de datos escribiendo en los cuadros de entrada de texto o cargando un archivo haciendo clic en el botón Seleccionar archivo . La primera columna especifica los puntos de tiempo. Las dos columnas restantes especifican los datos de gemación y pueden tomar cualquiera de las siguientes opciones: el número de celdas sin gemación (Sin brote), el número de celdas en gemación (Bud) o el número total de celdas (Total).
4. Introduzca los ajustes para utilizarlos con los datos citométricos de flujo. Para cada experimento , ejecute el paso 3.3 o el paso 3.4.
   NOTA: Los datos citométricos de flujo y los datos de gemación se pueden usar juntos. Aunque anteriormente describimos ejecutarlos juntos¹⁵, para esta herramienta, deben ejecutarse de forma independiente y luego compararse.
   1. Convierta los archivos .fcs al formato de entrada CLOCCS correcto para citometría de flujo siguiendo las instrucciones del archivo complementario 1 (también se encuentra en el repositorio de CLOCCS_alignment como CLOCCS/flow_cytometry_conversion_instructions.txt).
   2. Seleccione la selección Flujo en el menú desplegable Tipo de modelo .
   3. Importe los datos mediante el panel Importación de datos. Haga clic en Seleccionar archivo y seleccione el archivo generado en el paso 3.4.1.
   4. Seleccione los puntos de tiempo para los que se debe trazar un ajuste CLOCCS de citometría de flujo seleccionando los puntos de tiempo en el cuadro Tiempos de ajuste .
5. Una vez que se hayan seleccionado todas las entradas para la citometría de gemación o de flujo, haga clic en el botón Aplicar y luego haga clic en el botón Muestra en la parte superior de la pantalla.
6. Vea la curva de gemación o los gráficos de citometría de flujo con los ajustes previstos seleccionando la pestaña Ajustes previstos . Esta pestaña se abre de forma predeterminada inmediatamente después del paso anterior.
7. Para ver los histogramas de parámetros para cada parámetro, seleccione la pestaña Histogramas de parámetros y, a continuación, seleccione la subpestaña que corresponde al parámetro de interés entre las siguientes opciones: mu0, delta, sigma0, sigmav, lambda, bud.start, bud.end, etc.
8. Para ver la gráfica de puntuación posterior, seleccione la ficha Puntuación posterior .
9. Vea la configuración y modifíquela seleccionando la pestaña Configuración ; para ver el registro de las ejecuciones anteriores, seleccione la ficha Registro .
10. Obtenga los parámetros CLOCCS del ajuste seleccionando la ficha Parámetros posteriores . La tabla resultante tendrá la siguiente forma: cada fila consta de un parámetro, siendo la última fila la posterior. Las columnas consisten en el parámetro previsto para la media, el intervalo de confianza inferior del 2,5%, el intervalo de confianza superior del 97,5% y la tasa de aceptación.
    1. Registre los parámetros utilizados para la alineación de cada experimento: el tiempo de recuperación de la sincronía (μ₀) y el período promedio del ciclo celular de las células madre (λ).
    2. Calcule el período del ciclo celular calculando el promedio del período de la célula madre (λ) y el período de la célula hija (λ + δ), donde δ es el retraso específico de la hija.
       NOTA: Repita la sección 3 con todos los experimentos que se incluirán en las comparaciones.

4. Conversión de puntos de tiempo a puntos de línea de vida utilizando las funciones de conversión de Python y los parámetros CLOCCS

NOTA: La conversión entre puntos de tiempo y puntos de línea de vida requiere dos fórmulas de conversión²¹. Una implementación de Python para la conversión y la visualización de datos está disponible en el repositorio de CLOCCS_alignment y se describe a continuación.

1. Active el entorno Conda introduciendo el siguiente comando en el terminal: conda activate CLOCCS_alignment
2. Abra un bloc de notas interactivo de Python escribiendo el siguiente comando en el terminal: Jupyter Notebook
3. Cree un nuevo bloc de notas de Python en la carpeta deseada.
   NOTA: Se ha incluido un bloc de notas de ejemplo para demostrar el uso estándar y se puede encontrar en Alignment/JOVE_example.ipynb en el repositorio de alineación de CLOCCS_.
4. Importe el archivo de Python que contiene las funciones de alineación ejecutando el siguiente comando en la primera celda:
   %run path_to_repo/cloccs_alignment/Alignment/utilities.py
   1. Sustituya la ruta de acceso al repositorio de CLOCCS_alignment por path_to_repo.
5. Si utiliza datos de gemación como datos de fase de ciclo de celda, importe un marco de datos que contenga el porcentaje de budded en cada punto de tiempo ejecutando el siguiente comando en una celda nueva:
   budding_df = pd.read_csv("path_to_folder/budding_filename.tsv", sep ="\t", index_col=0)
   1. Sustituya la ruta de archivo y el nombre de archivo adecuados. Si el archivo es un archivo .csv, quite sep ="\t"
6. Si utiliza datos de gemación como datos de fase del ciclo celular, alinee los datos de gemación con una escala de tiempo de punto de línea de vida introduciendo la siguiente función en una nueva celda:
   aligned_budding_df = df_conversion_from_parameters(budding_df, puntos temporales, param_mu0, param_lambda)
   1. Para los puntos de tiempo, sustituya una lista de los puntos de tiempo para que sea el índice del marco de datos budding_df.
   2. Para param_mu0 y param_lambda, sustituya el experimento por los parámetros aprendidos de la ejecución de CLOCCS en ciernes en la sección 3.
7. Si utiliza datos de citometría de flujo, importe los datos de citometría de flujo ejecutando el siguiente comando en una celda nueva:
   flow_samples = flow_cytometry_import(flow_input_folder)
   1. Para obtener flow_input_folder, sustituya la ruta de acceso adecuada a la carpeta que contiene los archivos .fcs de citometría de flujo.
8. Si utiliza datos de citometría de flujo, genere una tabla de conversión entre los puntos de tiempo y los puntos de línea de vida para cada experimento escribiendo el siguiente comando en una nueva celda:
   flow_converter = convert_tp_to_ll(puntos de tiempo, param_mu0, param_lambda)
   1. Para los puntos de tiempo, sustituya una lista de los puntos de tiempo de los datos de citometría de flujo.
   2. Para param_mu0 y param_lambda, sustituya el experimento por los parámetros aprendidos de la citometría de flujo CLOCCS ejecutada en la sección 3.
9. Importe el marco de datos que contiene los datos experimentales en el bloc de notas ejecutando el siguiente comando en una celda nueva:
   data_df = pd.read_csv("path_to_folder/exp_data_filename.tsv", sep ="\t", index_col=0)
   1. Sustituya la ruta de archivo y el nombre de archivo adecuados. Si el archivo es un archivo .csv, elimine sep ="\t".
      NOTA: Esto se puede hacer para cualquier dato tabular. Los datos experimentales simplemente deben tener los puntos de tiempo como columnas o el índice del marco de datos. Los datos de ejemplo se pueden encontrar en el repositorio CLOCCS_alignment.
10. Alinee los datos experimentales con una escala de tiempo de punto de línea de vida introduciendo la siguiente función en una nueva celda:
    lifeline_aligned_df = df_conversion_from_parameters(data_df, timepoints, param_mu0, param_lambda, interpolate, lowerll, upperll)
    1. Para los puntos de tiempo, sustituya una lista de los puntos de tiempo como el índice o las columnas de la data_df experimental del paso anterior.
    2. Para param_mu0 y param_lambda, sustituir los valores obtenidos en la sección 3 de CLOCCS.
       NOTA: Los parámetros pueden provenir de cualquier ejecución CLOCCS realizada en cualquiera de los tipos de datos de fase de ciclo celular aceptados.
    3. Opcionalmente, sustituya interpolar por True o False, o deje en blanco (el valor predeterminado es False).
       NOTA: Cuando se establece en False, los datos no se interpolarán. Cuando se establece en True, los puntos de la línea de vida se redondearán e interpolarán para rellenar los valores entre los puntos de la línea de vida, de modo que haya un punto por entero en el rango de los puntos de la línea de vida. Esto permite una mejor comparación entre conjuntos de datos.
    4. Opcionalmente, sustituya lowerll y upperll por None o valores enteros.
       NOTA: Cuando se establece en Ninguno, se mantienen todos los puntos de la línea de vida después de la interpolación. Cuando se suministran enteros , esto trunca los datos para que los puntos de la línea de vida oscilen entre el nivel inferior y el superior. Esto permite la comparación entre conjuntos de datos con un lowerll o upperll diferente.
11. Descargue el conjunto de datos alineado con la línea de vida escribiendo el siguiente comando en una nueva celda: lifeline_aligned_df.to_csv("path_to_desired_location/name_of_file.tsv", sep = "\t")
12. Repita los pasos 4.5-4.11 con todos los experimentos que se incluirán en las comparaciones.

5. Comparación de curvas de gemación y datos de citometría de flujo

1. Trazar las curvas de gemación antes de la alineación utilizando la función de utilidades de Python introduciendo el siguiente comando en una nueva celda:
   plot_budding_curves(list_of_budding_curves, list_for_legend = leg_list, point_type = str_type, título = str_title)
   1. Sustituya una lista que contenga los marcos de datos de todas las curvas en ciernes deseadas para trazar list_of_budding_curves-[bud_df1, bud_df2, bud_df3].
   2. Sustituya una lista de las etiquetas por la leyenda [Experimento 1, Experimento 2, Mutante] por leg_list si lo desea. En caso contrario, excluya o sustituya Ninguno.
   3. Sustituya el tiempo por str_type.
   4. Sustituya el título de una cadena Comparison Budding Curves por str_title si lo desea. Si no es así, sustituya Ninguno o excluya.
2. Trazar las curvas de gemación después de la alineación utilizando la función de utilidades de Python siguiendo las instrucciones del paso 5.1, pero con una lista de curvas de gemación alineadas sustituidas por list_of_budding_curves y con línea de vida para point_type en lugar de tiempo.
3. Para trazar los datos de citometría de flujo, trace los datos asociados de los archivos .fcs en los puntos de línea de vida correspondientes utilizando el convertidor generado en el paso 4.8.
4. Convierta los puntos de la línea de vida a la fase del ciclo de celda utilizando la tabla del convertidor (Tabla 1).
   NOTA: Esto también se puede trazar siguiendo las instrucciones del paso 5.1, pero con fase para point_type en lugar de tiempo.

6. Comparación de los datos experimentales

1. Determinar la lista de genes que se trazará en los gráficos de líneas en función de la información de la literatura o los genes de interés para la investigación.
2. Utilice la plot_linegraph_comparison proporcionada en el archivo de utilidades de Python para realizar comparaciones de gráficos de líneas en el marco de datos original, alineado o alineado e interpolado escribiendo el siguiente comando en una nueva celda:
   plot_linegraph_comparison(list_of_dfs, list_for_legend, genelista, point_type = str_type, título = str_title)
   1. Sustituya list_of_dfs por una lista de los marcos de datos de los experimentos que se compararán.
      NOTA: Los marcos de datos pueden estar desalineados o alineados; Sin embargo, la point_type correspondiente debe introducirse en el paso 6.2.4.
   2. Sustituya una lista de títulos para cada marco de datos en el mismo orden que la lista de marcos de datos para list_for_legend.
   3. Sustituya una lista de los nombres de genes (que deben incluirse en el índice de los marcos de datos) para trazar por genelist.
   4. Sustituya el tipo de punto por str_type. Utilice la línea de vida (el valor predeterminado es la escala de punto de línea de vida) o la fase (la escala de línea de vida de fase del ciclo de celda) para las tramas de datos alineadas en el paso 6.2.1 o el tiempo para las tramas de datos no alineadas en el paso 6.2.1.
   5. Sustituya str_title por un título de cadena opcional.
3. Determine la lista de genes que se incluirán en el mapa de calor utilizando la literatura o los algoritmos para determinar los principales genes periódicos.
   NOTA: Para realizar comparaciones adecuadas de mapas de calor, los datos deben alinearse, interpolarse y ajustarse a la escala temporal en el paso 6.2; Debe tener el mismo valor de línea de vida inicial y final para cada experimento.
   1. Ejecutar algoritmos de periodicidad para determinar los principales genes periódicos^23,24, o utilizar los métodos alternativos deseados para determinar la lista de genes (es decir^, los resultados de la literatura).
   2. Importe un archivo de lista de genes .csv o .tsv en el bloc de notas mediante el siguiente comando en una celda nueva:
      sort_df = pd.read_csv("path_to_folder/sorting_filename.tsv", sep="\t", index_col=0)
   3. Sustituya la ruta de archivo y el nombre de archivo adecuados. Si el archivo es un archivo .csv, elimine sep="\t".
4. Utilice la función proporcionada plot_heatmap_comparison en el archivo de utilidades de Python para realizar una comparación de mapa de calor en el marco de datos alineado, interpolado y alineado por fase escribiendo el siguiente comando en una nueva celda:
   plot_heatmap_comparison(list_of_dfs, list_for_legend, genelista, título = str_title)
   1. Sustituya por list_of_dfs una lista de los marcos de datos alineados de los experimentos que se compararán.
   2. Sustituya una lista de títulos para cada marco de datos en el mismo orden que la lista de marcos de datos para list_for_legend.
   3. Sustituya una lista de los nombres de genes (que deben incluirse en el índice de los marcos de datos) para trazar por genelist.
   4. Sustituya str_title por un título de cadena opcional.
      NOTA: El primer marco de datos de la lista es el que se utilizará para ordenar los genes en el mapa de calor. Los genes se ordenarán por el máximo en el primer período para ese marco de datos, y se utilizará el mismo orden para los marcos de datos posteriores en la lista.

Resultados

Los pasos descritos en el protocolo anterior y en el flujo de trabajo de la Figura 1 se aplicaron a cinco experimentos de series temporales sincronizadas con ciclo celular para demostrar dos comparaciones representativas: entre réplicas con diferentes métodos de sincronía (feromona de apareamiento y elutriación centrífuga¹⁸) y plataformas de secuenciación (secuenciación de ARN [RNA-seq] y microarray), así como entre condiciones experimentales. Se realizaron m?...

Discusión

Este artículo presenta un método para evaluar de manera más precisa y cuantitativa los datos de experimentos de series temporales en poblaciones sincronizadas de células. El método utiliza parámetros aprendidos de CLOCCS, un modelo de inferencia bayesiana que utiliza datos de fase del ciclo celular de entrada, como datos de gemación y datos de contenido de ADN por citometría de flujo, para parametrizar cada experimento^14,15. CLOCCS utiliza los datos de fa...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2x PBS			For Fixative Solution. Described in Leman 2014.
4% formaldehyde			For Fixative Solution.
100% Ethanol			For flow cytometry fixation. Described in Haase 2002.
CLOCCS			https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
Flow Cytometer			For flow cytometry protocol.
Git			https://git-scm.com/
Java 19			https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19
Microscope			For counting cells and buds.
Miniconda			https://docs.conda.io/en/latest/
Protease solution			For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002.
RNAse A solution			For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002.
SYTOX Green Nucleic Acid Stain	Invitrogen	S7020	For flow cytometry staining. Described in Haase 2002.
Tris			pH 7.5