Построение ячеек с использованием стратегии Магнитного Архимеда

Резюме

Этот протокол описывает метод создания высокопроизводительных ячеек без чернил, меток, не зависящий от субстрата, основанный на эффекте магнитного Архимеда.

Аннотация

Клеточный паттерн, позволяющий точно контролировать их расположение, представляет собой уникальное преимущество в изучении поведения клеток. В этом протоколе представлена стратегия формирования ячеек на основе эффекта Магнитного Архимеда (Mag-Arch). Такой подход позволяет точно контролировать распределение ячеек без использования красящих материалов или частиц этикетки. При введении парамагнитного реагента для повышения магнитной восприимчивости среды клеточной культуры клетки отталкиваются магнитами и выстраиваются в структуру, дополняющую наборы магнитов, расположенные под микрофлюидной подложкой.

В данной статье подробно описаны процедуры формирования ячеек с использованием стратегии, основанной на Mag-Arch. Предложены методы структурирования одноклеточных типов, а также множественных типов клеток для экспериментов с кокультурами. Кроме того, предоставляются подробные инструкции по изготовлению микрофлюидных устройств, содержащих каналы для формирования клеточных структур. Достижение этой функции с помощью параллельных методов является сложной задачей, но может быть выполнено упрощенным и экономичным способом. Использование клеточного паттерна на основе Mag-Arch дает исследователям мощный инструмент для исследований in vitro .

Введение

Определение клеточных структур превращается в интуитивно понятную и мощную технологию для исследований in vitro ¹. Манипулируя положением клеток в культуральных планшетах, он предоставляет решения для различных экспериментов, включая миграцию клеток², биомиметическую многоклеточную кокультуру³, сборку органоидов⁴, исследования биоматериалов⁵ и многое другое. В большинстве ситуаций для нанесения рисунка клеток предпочтительнее метод без чернил и этикеток, поскольку он обеспечивает простоту эксплуатации и высокую жизнеспособность клеток для последующих исследований.

Эффект Mag-Arch — это физическое явление, при котором диамагнитные объекты в парамагнитных жидкостях имеют тенденцию двигаться к областям со слабыми магнитными^полями. Живые клетки по своей природе диамагнитны, в то время как питательные среды для клеточных культур можно сделать парамагнитными, добавив растворимые парамагнитные элементы, такие как гадопентетат димеглумин (Gd-DTPA), обычно используемый внутривенно в ядерной магнитно-резонансной томографии в качестве контрастного вещества⁷. Следовательно, ожидается, что клетки будут отталкиваться от окружающей парамагнитной среды и двигаться в области, где магнитные^{поля слабее}. Паттернированное магнитное поле может быть легко сгенерировано с помощью набора неодимовых магнитов. В идеале клеточные узоры собираются в противовес магнитным узорам. Технически этот метод определяется как метод без меток, потому что единственный дополнительный реагент, Gd-DTPA, остается во внеклеточной среде и не связывается с клетками. Таким образом, потенциального влияния на последующую культуру клеток можно легко избежать, заменив питательную среду. По сравнению с другими методами 1,3,9,10, стратегия^, основанная на Mag-Arch, не требует компонентов биочернил или нанесения специфических частиц для положительной маркировки клеток. Кроме того, было показано, что он работает на нескольких субстратах для клеточной адгезии и способен создавать высокопроизводительные клеточные паттерны⁴.

В этой статье представлен подробный протокол формирования структуры ячеек с использованием метода на основе Mag-Arch, охватывающий все, от изготовления устройства до корректировки структуры ячеек. В дополнение к шаблонам, которые мы продемонстрировали, пользователи могут легко создавать различные узоры ячеек с помощью магнитов и решения Gd-DTPA. Кроме того, предоставляются протоколы для сборки сложных шаблонов кокультур и манипулирования клетками в вложенных микрофлюидных чипах.

протокол

1. Сборка комплектов магнитов

1. Соберите наборы магнитов для узоров полосок.
   1. Выберите плоские прямоугольные магниты, как показано на рисунке 1A. Размеры прямоугольных магнитов, используемых для этой демонстрации, составляют 1,5 мм × 10 мм × 35 мм (толщина × высота × длина) (см. Таблицу материалов). Толщина магнитов определяет зазоры между полосами ячеек.
   2. Силиконовые пластины толщиной 2 мм (см. Таблицу материалов) разрежьте на прямоугольники диаметром 2 мм × 8 мм × 30 мм. Убедитесь, что последние два размера этих силиконовых пластин немного меньше, чем у прямоугольных магнитов, упомянутых выше, чтобы оптимизировать сборку. Толщина силиконовых пластин определяет ширину полос ячеек.
   3. Соберите прямоугольные магниты и силиконовые пластины слой за слоем, как показано на рисунке 1A. Каждый набор магнитов состоит из 4 магнитов и 3 силиконовых пластин. Убедитесь, что полюса каждого соседнего магнита противоположны, чтобы наборы магнитов могли автоматически выровняться из-за собственной силы притяжения.
   4. Стерилизуйте магниты перед использованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется промыть магнитные наборы чистой водой, а затем погрузить их в 75% этанол на 10 минут. Габаритные размеры этих магнитных наборов составляют 12 мм × 10 мм × 35 мм, предназначенных для установки стандартных 6-луночных планшетов для клеточных культур.
2. Соберите наборы магнитов для точечных массивов
   1. Выбирайте миниатюрные цилиндрические магниты, как показано на рисунке 1B. Размеры цилиндрических магнитов, используемых для этой демонстрации, составляют Φ1,5 мм × 10 мм (диаметр × высота), намагниченных в осевом направлении.
   2. Соберите цилиндрические магниты, как показано на рисунке 1B. Убедитесь, что каждый набор магнитов состоит из 36 цилиндрических магнитов, расположенных в сетке 6 × 6. Кроме того, убедитесь, что полюса каждого соседнего магнита противоположны, чтобы наборы магнитов автоматически выравнивались за счет собственной силы притяжения.
   3. Перед использованием простерилизуйте магниты, выполнив ту же процедуру, что и в шаге 1.1.4. Габаритные размеры этих магнитных наборов составляют 9 мм × 10 мм × 9 мм, предназначены для установки стандартных 6-луночных планшетов для клеточных культур.

2. Рисунок ячеек на предметных стеклах

1. Подготовьте устройство для культивирования клеток.
   1. Используйте силиконовые пластины толщиной 2 мм для создания силиконовых форм. Используйте дырокол, чтобы создать прямоугольное отверстие в пластине размером 1 см × 1 см. Обрежьте силиконовую пластину вокруг отверстия, чтобы создать круглую форму (диаметр = 25 мм) с отверстием в центре, как показано на рисунке 1C.
   2. Тщательно очистите силиконовые формы с помощью ультразвукового очистителя. Стерилизуйте формы, промывая их чистой водой в течение 10 мин, а затем заменив воду на 75% этиловый спирт еще на 10 минут. Наконец, высушите формы в стерилизаторе при температуре 65 °C в течение 60 минут.
   3. Прикрепите стерилизованную силиконовую форму к предметному стеклянному предметному стеклу диаметром 25 мм и осторожно прижмите его, чтобы силикон прилип к стеклу, как показано на рисунке 1C. Полученное устройство для культивирования клеток будет иметь стеклянную нижнюю сторону и полость для культивирования на 200 мкл. Размеры устройства составляют Φ25 мм × 2,15 мм, что делает его пригодным для стандартных 6-луночных планшетов для клеточных культур.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Описанное выше устройство для культивирования клеток может быть заменено другими чашками Петри с нижней стороной тоньше 0,5 мм, например, конфокальными чашками.
   4. Поместите наборы магнитов на 6-луночную пластину. Для удобства работы рекомендуется использовать немагнитный пинцет.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все последующие этапы должны выполняться в стерильных условиях, начиная с этого момента и до наблюдения за клеточным рисунком.
   5. Расположите устройство для культивирования клеток поверх магнита, установленного в лунке 6-луночного планшета. Убедитесь, что устройство для культивирования клеток расположено горизонтально, а нижняя сторона находится в тесном контакте с набором магнитов.
2. Приготовьте питательную среду для клеток, содержащую Gd-DTPA
   1. Готовят имеющиеся в продаже инъекции Gd-DTPA (см. Таблицу материалов), обычно с концентрацией 500 мМ. Разбавьте инъекцию, добавив 30 мкл инъекции Gd-DTPA к 470 мкл полной питательной среды для клеток до достижения целевой концентрации 30 мМ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от местных нормативных актов и наличия других контрастных веществ на основе гадолиния (GBCA) с той же целевой концентрацией могут давать аналогичные результаты¹¹.
3. Создайте шаблоны ячеек.
   1. Заготавливаем клетки для выкройки. В этой демонстрации для создания рисунка были использованы эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC, см. таблицу материалов) (рис. 2). Центрифугируют клетки в течение 5 мин при 200 x g (при комнатной температуре), чтобы извлечь их из суспензии и повторно суспендировать в среде, содержащей Gd-DTPA. Подсчитайте плотность клеток.
   2. Отрегулируйте плотность клеток примерно до ~2 × 10⁵ клеток/мл с помощью среды, содержащей Gd-DTPA. Аккуратно перемешайте клеточную суспензию и добавьте 200 мкл в полость каждой формы для клеточной культуры, чтобы создать жидкую поверхность до краев.
   3. Осторожно переложите планшет в инкубатор клеточных культур и инкубируйте в течение 3-6 ч до тех пор, пока клетки хорошо не прилипнут к субстрату. Избегайте захлопывания дверцы инкубатора, чтобы не мешать сборке клеточных узоров. Для клеток с низкой степенью адгезии ночное лечение GBCA, как правило, безопасно¹².
   4. Формирование клеточного рисунка считается завершенным, когда клетки прилипают ко дну полости клеточного культурального устройства. Замените среду, содержащую Gd-DTPA, на полную питательную среду.
   5. Извлеките устройство для культивирования клеток из набора магнитов. Можно либо наблюдать за клеточным рисунком сразу, либо переносить устройство в новую культуральную планшет для дальнейшего культивирования.

3. Совместное культивирование с помощью магнита сбоку: изготовление движущегося шаблона

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура представлена для того, чтобы воспользоваться преимуществами создания ячеистых шаблонов на основе Mag-Arch и изучить возможность большего количества применений.

1. Подготовьте устройство к нанесению узора полосатых ячеек в соответствии с шагами 1 и 2. Тем не менее, уменьшите плотность ячеек до 1 × 10⁵ ячеек/мл и замените силиконовые пластины, разделяющие магниты, на более тонкие, сделав каждый полосатый узор ячеек тоньше.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это обеспечивает достаточную площадь для укладки нескольких ячеек в виде полос. В качестве ориентира мы предлагаем использовать силиконовые пластины толщиной 1 мм вместо 2 мм для разделения магнитов.
2. Создайте первый тип клеток, как показано на шагах 2.2-2.3. На этом этапе также требуется 3-6 часов для прикрепления клетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы различать различные типы клеток в системе совместного культивирования, пользователи могут помечать клетки флуоресцентными красителями, такими как DiI, DiD, или клеточными трекерами (CMTPX, CMFDA, CMAC и т. д.) перед нанесением узора. Например, для окрашивания DiI и DiD добавьте 1 мкл исходного раствора (10 мМ) (см. таблицу материалов) на 1 мл среды, не содержащей FBS, и хорошо перемешайте до получения рабочего раствора. Замените питательную среду рабочим раствором, чтобы покрыть адгезивные клетки. После инкубации в течение 30 минут и трехкратной промывки PBS приступают к забору клеток.
3. После создания образца клеток первого типа переместите устройство для культивирования клеток на 1 мм от магнитов ниже вправо, как показано на рисунке 3Aii.
4. Аккуратно промойте предметные стекла 200 мкл PBS дважды. Не допускайте высыхания слайдов.
5. Сформируйте ячейки второго типа таким же образом, как показано на шагах 2.2-2.3.
6. Переместите устройство для культивирования клеток на 1 мм от магнитов внизу вправо, как показано на рисунке 3Aiii, и снова промойте предметные стекла 200 мкл PBS. Выстройте третий тип клеток таким же образом, как показано на шагах 2.2-2.3.
7. После создания рисунка всех типов клеток осторожно промойте предметные стекла 200 мкл PBS дважды и замените полной питательной средой для клеток.
8. Извлеките устройство для культивирования клеток из набора магнитов. Затем можно наблюдать за клеточным рисунком или переносить устройство на новую культуральную планшет для дальнейшего культивирования.

4. Совместное культивирование путем регулировки концентрации Gd-DTPA

ПРИМЕЧАНИЕ: GBCA не оказывают существенного влияния на адгезию клеток или последующий рост при рабочих концентрациях (≤75 мМ). Кроме того, концентрация Gd-DTPA влияет на структуру клеток: более высокие концентрации приводят к более мелким/тонким клеточным структурам. Таким образом, можно создавать системы совместного культивирования, просто регулируя концентрацию Gd-DTPA. В этом примере демонстрируется создание шаблонов для концентрических круговых массивов.

1. Создайте первый тип ячеек, как показано на шагах 2.2-2.3, используя миниатюрные цилиндрические магниты из шага 1.2. Перед сбором пометьте клетки флуоресцентными красителями, такими как DiI, DiD или клеточные трекеры (см. шаг 3), чтобы различать различные типы клеток в системе совместной культуры.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Потребуется более высокая концентрация Gd-DTPA (50 мМ вместо 30 мМ) и более низкая плотность клеток, примерно 1 × 10⁵ клеток/мл.
2. После создания рисунка первого массива ячеек осторожно промойте предметные стекла 200 мкл PBS дважды. Не допускайте высыхания предметных стекол.
3. Создайте второй тип клеток, выполнив ту же процедуру, что и раньше. Держите предметные стекла относительно неподвижными на магнитах, чтобы предотвратить смещение. Рекомендуется прикрепить силиконовую пластину с углублением, которое подходит для наборов магнитов, к нижней поверхности предметного стекла.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае потребуется более низкая концентрация Gd-DTPA (20 мМ вместо 30 мМ), чтобы ожидается, что вторые ячейки будут крупнее первых, как показано на рисунке 3B.
4. После создания рисунка всех типов клеток осторожно промойте предметные стекла 200 мкл PBS дважды и замените среду полной питательной средой для клеток.
5. Извлеките устройство для культивирования клеток из набора магнитов. Затем можно наблюдать за клеточным рисунком или переносить устройство на новую культуральную планшет для дальнейшего культивирования.

5. Формирование ячеистого рисунка в микрофлюидном чипе

ПРИМЕЧАНИЕ: В нашем предыдущем исследовании⁸ было продемонстрировано, что метод, основанный на Mag-Arch, работает в закрытых узких камерах. Ниже приведен пример построения массивов точек в микрофлюидном канале.

1. Изготовление микрофлюидного чипа
   1. Изготовьте пресс-формы из политетрафторэтилена (ПТФЭ) диаметром 40 мм × 75 мм × 20 мм (см. Таблицу материалов), содержащие прямоугольную полость 24 мм × 50 мм × 8 мм, как показано на рисунке 4A.
   2. Расплющите силиконовую пластину толщиной 0,5 мм. Разрежьте силиконовые пластины в соответствии с формой канала жидкости, который имеет прямоугольную полость 15 мм × 20 мм × 0,5 мм с треугольными буферными зонами как на входной, так и на выходной стороне, как показано на рисунке 4A, B.
   3. Изготовьте прямоугольные стеклянные пластины диаметром 40 мм × 75 мм. Очистите стеклянные пластины воздушной плазмой в течение 30 с.
   4. Сразу после воздушно-плазменной очистки накройте стеклянные пластины 0,5 мл имеющегося в продаже антиадгезионного буфера (см. Таблицу материалов) и дайте им высохнуть на воздухе. Вымойте стеклянные пластины один раз этиловым спиртом и дайте им высохнуть на воздухе.
   5. Надежно прикрепите силиконовую пластину, подготовленную на шаге 5.1.2, к середине стеклянной пластины, как показано на рисунке 4A.
   6. Приготовьте преполимер полидиметилсилоксана (ПДМС) в соответствии с инструкциями производителя (см. таблицу материалов). Для каждого чипа PDMS взвесьте 10 г основного компонента и 1 г укрепляющего агента в центрифужную пробирку объемом 50 мл.
   7. Тщательно перемешайте средства стеклянной палочкой для перемешивания до тех пор, пока мелкие пузырьки не будут равномерно распределены в коллоиде. Перемешивание занимает 5-10 мин, в зависимости от объема коллоида. Центрифугируйте коллоидный преполимер в течение 1 мин при 500 x g (при комнатной температуре) для удаления пузырьков.
   8. Медленно влейте ~10 мл преполимера в полость, чтобы заполнить форму из ПТФЭ.
   9. Осторожно поместите форму в вакуумный резервуар и держите ее горизонтально, чтобы преполимер не вытек.
   10. Удалите остаточные пузырьки воздуха из преполимера с помощью вакуумного насоса. Уборка пылесосом занимает 120-180 минут.
   11. При необходимости налейте больше преполимера, чтобы дополнительно заполнить полость формы. Пылесосьте еще 60 мин.
   12. Осторожно накройте форму из ПТФЭ стеклянной пластиной так, чтобы кварцевая сторона была обращена к полости, как показано на рисунке 4Bi.
   13. Убедитесь, что все пузырьки удалены. Переместите форму в сушильную печь с температурой 60 °C, чтобы преполимер затвердел в течение ночи.
   14. Достаньте форму из духовки. После охлаждения тщательно снимите затвердевшую крышку PDMS. Создайте входное и выходное отверстия с помощью иглопробивателя Φ1 мм.
   15. Вымойте крышку PDMS и салазки 24 мм × 50 мм в соответствии с шагом 2.1.2.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие действия в стерильных условиях.
   16. Прикрепите крышку PDMS и слайд крышки, чтобы создать микрофлюидный чип с проточным каналом высотой около ~500 мкм. Нижняя сторона должна состоять из стеклянной крышки толщиной ~0,15 мм, чтобы можно было создавать узоры ячеек с помощью стратегии, основанной на Mag-Arch.
2. Установите имеющиеся в продаже стерильные адаптеры как на входе, так и на выходе микрофлюидной микросхемы⁸.
3. Приготовьте 2%-ный (массовый, растворенный в PBS) буфер для желатиновой оболочки. Стерилизуйте буфер автоклавированием.
4. Введите буфер желатиновой оболочки в чип через входной адаптер с помощью шприца объемом 1 мл. Если пузырьки появляются, промойте их дополнительным буфером для покрытия.
5. Поместите чип в чашку для клеточной культуры диаметром 10 см. Добавьте 1 мл PBS на дно посуды, чтобы избежать высыхания. Перенесите чашку в инкубатор клеточных культур. Нанесение покрытия занимает 30 минут.
6. Промойте буфер покрытия 2 мл среды, содержащей Gd (30 мМ), через входное отверстие.
7. Осторожно ввести 1 мл клеточной суспензии, содержащей 30 мМ Gd-DTPA с помощью шприца объемом 1 мл.
8. Выкройте ячейки, как показано на шагах 2.2-2.3, используя миниатюрные цилиндрические магниты из шага 1.2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Тем не менее, рекомендуется прикрепить силиконовую пластину с углублением, которое подходит для наборов магнитов, к нижней поверхности предметного стекла, как показано на рисунке 4Ci.
9. После нанесения рисунка осторожно освежите среду, содержащую Gd-DTPA, 1 мл полной среды, промыв шприцем объемом 1 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс создания клеточного рисунка в микрофлюидике, начиная с этапов 5.7-5.9, занимает около 180 минут, что аналогично созданию клеточного рисунка на стандартных предметных стеклах.
10. Количественная оценка закономерностей под микроскопом. При необходимости подключите микрофлюидный чип к циркуляционному культивируемому устройству для дальнейшего культивирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: По нашему опыту, клетки способны расти в течение не менее 72 ч при поддержке простого устройства на основе микронасоса, которое обеспечивает микрофлюидику непрерывным потоком свежей питательной среды в клеточном инкубаторе⁸.

Результаты

Для создания ячеек в качестве демонстрации были выбраны прямоугольные (1,5 мм × 10 мм × 35 мм) и цилиндрические (Φ1,5 м × 10 мм) магниты. Пользователи могут изменять размер и форму магнитов или собирать их по-разному для создания разнообразных ячеек. На рисунке 1A,B магниты были со...

Обсуждение

Клеточный паттерн на основе Mag-Arch представляет собой удобное решение для большинства биомедицинских лабораторий. Этот метод развивается параллельно с символами без чернил, без этикеток, независимо от подложки и возможностью высокопроизводительного нанесения рисунков

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
A2780 ovarian cancer cells	Procell	CL-0013
Cell culture medium (DMEM, high glucose)	Gibco	11995040
Cover slides	Citotest Scientific	80340-3610	For fabricating microfluidics. Dimension: 24 mm × 50 mm
DiD	MedChemExpress (MCE)	HY-D1028	For labeling cells with red fluorescence (Ex: 640 nm)
DiI	MedChemExpress (MCE)	HY-D0083	For labeling cells with orange fluorescence (Ex: 550 nm)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biochannel	BC-SE-FBS07
Gadopentetate dimeglumine (Gd-DTPA)	Beijing Beilu Pharmaceutical	H10860002
Gelatin	Sigma Aldrich	V900863
Glass cell slides	Citotest Scientific	80346-2510	Diameter: 25 mm; thickness: 0.19-0.22 mm
Glass plates	PURESHI hardware store		For fabricating microfluidics. Dimension: 40 mm × 75 mm
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs)	Servicebio	STCC12103G-1
Neodymium-iron-boron magnets (N52)	Lalaci
Non-toxic glass plate coating (Gel Slick Solution)	Lonza	1049286	For convenience of demolding when fabricating microfluidics
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Servicebio	G4200
Plasma cleaner	SANHOPTT	PT-2S
Polydimethylsiloxane (PDMS) kit	DOWSIL	SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	For fabricating microfluidics
Polytetrafluoroethylene (PFTE) mold	PURESHI hardware store		Customized online, for fabricating microfluidics
Silicon plate	PURESHI hardware store
Smooth Muscle Cells (SMC)	Procell	CL-0517
Ultrasonic cleaner	Sapeen	CSA-02