Гипоксически-ишемической энцефалопатии Модель перинатальной ишемии

Резюме

Послеродовые модели крыс для гипоксически-ишемической травмы головного мозга является устоявшейся модели человеческого неонатальной гипоксической ишемической энцефалопатией (ГИЭ). В этой статье мы опишем модель HIE в послеродовой крысят.

Аннотация

Гипоксически-ишемическая энцефалопатия (ГИЭ) является следствием системных асфиксии, происходящих при рождении. Двадцать пять процентов новорожденных с ГИЭ развиваются тяжелые и постоянные нейропсихологических последствий, в том числе умственная отсталость, церебральный паралич и эпилепсия. Результаты HIE являются разрушительными и постоянные, делая его критическим для определения и разработки терапевтических стратегий снижения повреждения мозга у новорожденных с ГИЭ. С этой целью новорожденных модели крыс для гипоксически-ишемического повреждения головного мозга была разработана для модели этого человека. HIE модель была впервые подтверждена Ваннуччи и др. ¹ и с тех пор широко используется для выявления механизмов повреждения мозга в результате перинатальной гипоксии-ишемии ² и для проверки потенциального терапевтического вмешательства ^3,4. HIE модель состоит из двух этапов и включает в себя перевязки левой общей сонной артерии последующим воздействием гипоксической среде. Церебрального кровотока (CBF) в полушарии ипсилатерального к лигируют сонной артерии не уменьшается из-за потока крови через залога круга Уиллиса, однако с меньшим напряжения кислорода, БФК в ипсилатеральной полушарии значительно уменьшается, что приводит к односторонним ишемического повреждения . Использование 2,3,5-triphenyltetrazolium хлорида (ТТК) для окрашивания и выявить ишемические ткани мозга была первоначально разработана для взрослых моделей грызунов ишемии головного мозга ^5, и используется для оценки степени мозгового infarctin на ранних моментов времени до 72 часов после ишемического события ^6. В этом видео, мы демонстрируем гипоксически-ишемического повреждения модель в постнатальном мозге крыс и оценки размера инфаркта использованием ТТС окрашивания.

протокол

Этот протокол был одобрен Институциональные уходу и использованию животных комитета в Стэнфордском университете и соблюдает Национального института здоровья руководящих принципов для использования подопытных животных.

Новорожденных модель HIE Крыса

1. Сообщение день рождения (PND) 7 Sprague-Dawley крысят (Charles River Laboratories, Inc, Уилмингтон, Массачусетс), полностью анестезировали изофлуран (Aerrane, Baxter, Дирфилд, штат Иллинойс, 3-4% для индукции и 1-2% для обслуживание).
2. Небольшой надрез в области шеи (дополнительная Тонкие Ирис Ножницы # 14088-10, Точная наука Инструменты Inc, Foster City, CA), чтобы выставить левой общей сонной артерии (ССА).
3. ОСО лигируют с 5-0 шелковых шва (5-0 шелк, Ethicon, Somer, Нью-Джерси).
4. Разрез закрыт с цианакрилатного клея (Элмерс Products Inc, Колумбус, Огайо). Разрез покрыта лентой и анестезия остановился. Щенки вернулись в свои плотины и позволило восстановиться в течение 1-2 часов.
5. Щенки затем помещаются в гипоксической камере, которая содержит 8% кислорода сбалансированы с 92% азота в течение 100 минут при температуре 37 ° C. 8% oxygen/92% азота (Airgas, Сакраменто, Калифорния) потока через трубку в клетку мышь оснащена пластиковой крышкой. Крышка сделана в соответствии с клеткой и имеет два отверстия диаметром 2 см, один из которых на получение трубка подключена к 8% кислородный баллон газа, а другой позволяет газа в flowout. Камера помещается в ванну с водой и подогревается до использования и термометр внутри него должны зарегистрировать 37 ° С до начала гипоксии.
6. В конце 100 минут гипоксии, щенки снова вернулся к своей плотины для восстановления.
7. 24 часов после окончания гипоксии, щенки эвтаназии глубоким наркозом с изофлуран. Мозговая ткань является перфузии с холодным физиологическим раствором, после чего решение холодного 1% ТТС в фосфатном буферном растворе, рН 7,4 (Sigma Chemical Co, Сент-Луис, Миссури). TTC должны храниться в защищенном от света.
8. Мозги удаляются и охлаждается в течение 1-2 минут на льду, и четыре короны разделах 3 мм друг от друга (уровни 1-4) обрезаются, начиная рострально на уровне opticchiasm и воронки, соответствующие брегмы 1,8 ~ 2,0 мм уровне взрослом мозге мыши.
9. Мозг ломтиками погружены в раствор ТТК и инкубировали при 37 ° С в течение 8 минут, а затем фиксация в 4% параформальдегид / PBS в течение ночи. Потому что ТТС светочувствительные, держать ломтиками вдали от света в это время.
10. Разделы TTC окрашенных сканируются и оцифровываются. Использование изображения J (NIH, Bethesda, MD), следующие измеряются для каждого уровня: площадь миокарда (неокрашенных район), площадь ипсилатерального полушария, а площадь контралатерального полушария. Процентов инфаркта площади на срез вычисляется по формуле: (площадь инфаркта / область ипсилатерального полушария) или _{1, 2, 3} и _4. Процентов объема инфаркта рассчитывается как сумма ₍₁ + ₂ + ₃ + ₄₎ * 3 мм. Области коры или полосатой травма также может быть отдельно количественно в подобной манере.

Представитель Результаты

Рисунок 1. Представитель HIE корональных уровней 1-4 окрашивали ТТК.

TTC окрашенных корональные разделы демонстрируют области миокарда (в белом).

Обсуждение

Грызун послеродовой модель HIE является признанным модель, которая повторяет гипоксии мозга, происходящих в перинатальной периоде у новорожденных. Обширные гистологических и иммуноцитохимического исследования характеристик показал, что на 7 дней старый грызун имеет аналогичные зрелости мозга к...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprague-Dawley Rat Pups	Animal	Charles River Laboratories
Isoflurane	Surgery	Baxter Internationl Inc.
8% Oxygen/ 92% Nitrogen Gas	Surgery	Airgas
2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride	Reagent	Sigma-Aldrich	T8877
Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4	Reagent	GIBCO, by Life Technologies
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	P6148