Yeşil Floresan Protein ifade Rev-bağımlı lentiviral Vector kullanarak HIV-1 Olumlu Hücreler Özgül İşareti

Özet

Biz Tat duyarlı LTR ek olarak, bu tür bir lentiviral vektör geliştirdik, HIV-1 Tat ve Rev-bağımlı bir moda muhabiri gen ekspresyonu düzenleyen Rev-yanıt elemanı (RRE). Vektör GFP ifadesi üzerinden canlı hücreler kopyalayan HIV özel algılama izin verir.

Özet

HIV duyarlı ifade vektörlerin çoğu HIV organizatörü, uzun terminal tekrar (LTR) dayanmaktadır. LTR erken HIV protein, Tat duyarlı iken, hücresel aktivasyon devletler ve entegrasyonu oluştu yerel kromatin aktivite duyarlı. Bu yüksek HIV bağımsız aktivite neden olabilir ve işareti HIV pozitif hücreler ^1,2,3 LTR-tabanlı muhabiri yararlılığı sınırlı. Burada, Tat duyarlı LTR, Rev-yanıt elemanı ve HIV ekleme siteleri ^4,5,6 olmak üzere pek çok HIV DNA dizilerinin yanı sıra, sahip bir ifade lentiviral vektör inşa edilmiştir. Vektör yaşayan hücre popülasyonlarının kopyalayan HIV son derece özel bir algılama izin lentiviral bir muhabir virüs içine dahil oldu. Vektör aktivitesi yeşil floresan proteininin (GFP) ifadesi ile ölçüldü. Burada bildirilen bu vektör uygulama, HIV-pozitif hücreleri belirlemek için mevcut yöntemlere in situ PCR veya HIV antijeni boyama gibi bir roman alternatif bir yaklaşım, sunuyor . Vektör aynı zamanda HIV-pozitif hücreleri hedef için temel veya klinik deneyler için terapötik genleri ifade edebilir.

Protokol

1. Rev-bağımlı lentiviral Parçacıklar üretimi için Plazmidler, Transfeksiyon

Set up: Rev-bağımlı GFP lentiviral vektörü, PNL-GFP-RRE-SA, daha önce ^açıklanan 4,5,6 . Viral bir parçacık içinde bir araya getirmek için, HIV-1 ambalaj inşa, pCMVΔ8.2 (kibarca Dr Diğer Trono tarafından sağlanan) HEK293 T hücrelerinin içine plazmid contransfected ve VSV-G glikoprotein (pHCMV-G) taşıyan bir plazmid . Transfeksiyon kalsiyum fosfat yöntemi kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

Tamponlar Hazırlanması: 10 X HBS (HEPES Tamponlu Salin) HEPES 5 g eriterek tarafından hazırlanan, 8 g NaCl, Na ₂ HPO ₄ (susuz) 100 ml KCl Dekstroz 1 g, 0.103 g, 0.37 g H ₂ O Kısım the10 X HBS 1 ml alikotları içine tampon ve -20 ° C'de saklayın Transfeksiyon zaman, H ₂ O (1: 5 seyreltme), 2 X HBS 10 X HBS dönüştürmek ve pH ayarlamak arasında 7.05 - 7.12 . (10 ml 2 X HBS, genellikle 1M NaOH yaklaşık 50 mcL gerektirir). Filtre 0.22 mcM Millipore filtre geçerek 2X HBS tampon sterilize. CaCl ₂ tampon, nihai konsantrasyonu 2M 10 mM HEPES _CaCl 2 eriterek yapıldı . PH 5.8 ayarlayın, 4 tampon ve mağaza sterilize filtre ° C

Prosedür:

1. Bir gün önce transfeksiyon, tohum 2 x 10 ⁶ HEK293T 100 mm Petri-çanak hücreleri, ve 37 ° 10 ml DMEM +% 10 FBS geceleme hücrelerin büyümesine ° C,% 5 CO _2.
2. Ertesi gün, hücreleri süpernatant kaldırmak ve 5 ml taze DMEM +% 10 FBS, 4 saat boyunca sürekli olarak kültür hücreleri ile değiştirin.
3. 5 ml polistiren tüp, 480 mcL 2X HBS tampon ekleyin.
4. Ikinci bir 5 ml polistiren tüp, 480 mcL toplam hacmi 60 mcL 2M CaCl ₂ tampon, plazmid DNA ve transfeksiyon TE tamponu (1 mM Tris, 25 mM EDTA, pH 8.0) ekleyin. Her Petri yemek için plazmidler PNL-GFP-RRE-SA, pCMVΔR8.3, 7.5 mg, 2.5 mg ve pHCMV-G 10 mikrogram oranında ilave edilmelidir.
5. 2 X HBS tüp damla damla plazmid DNA CaCl ₂ karışımı ekleyin ve 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. A fine çökelti oluşacaktır.
6. Pipet tarafından hücrelere damla damla karışım 960 mcL ekleyin. Bir gecede 37 ° C,% 5 CO ₂ inkübe edin.
7. Ertesi gün, süpernatantı kaldırmak ve 10 ml taze DMEM +% 10 FBS eklemek ve hücrelerin sürekli olarak 37 ° C,% 5 CO ₂ gece boyunca inkübe edin.
8. 48 saat transfeksiyon anda, hasat süpernatantı kaldırılması ve 50 ml steril tüpler içine transfer virüs. 10 ml taze taze DMEM +% 10 FBS her Petri yemek ve gece boyunca kültür devam. 4 virüs süpernatant Mağaza ° C.
9. Süpernatantı toplayarak 72 saat transfeksiyon hasat devam edin. Süpernatantlar birleştirin ve pelet ila 15 dakika boyunca 500 xg'de süpernatantlar santrifüj ve hücre artıkları çıkarın.
10. Süpernatant 0.22 mcM Millipore filtre aracılığıyla toplanan ve süzülür. Bu virüs, daha fazla boyut dışlama sütun yoluyla konsantre oldu.

2. Viral Parçacıklar Konsantre ve Viral titresi tespit

1. Viral parçacıkların bir boyut dışlama sütun (100.000 MW kesti, Centricoin) yoğunlaşmıştır. Viral süpernatant sütuna yüklenen ve 4 ° C 15 dakika boyunca 6.000 xg'de santrifüj edildi.
2. Konsantre viral süpernatant, toplanan aliquoted ve -80 ° C'de saklanır oldu
3. Viral titresi TNF tedavi, HIV-1 pozitif Ceket hücre hattı, J1.1 7 enfeksiyon tespit edildi. Hücreler 96 plaka ml başına 2.5 x 10 ⁵ hücreleri (100 ml toplam hacim) kültür ve bir hafta boyunca seri olarak seyreltilmiş VNL-GFP-RRE-SA 100 ml ile enfekte edildi. Reed ve Muench 8 yöntemi takip GFP pozitif kuyu sayarak parçacığın titresi (TCID50) tahmin edilmiştir.

3. Markalama HIV-1 lentiviral Tane Pozitif Hücreler, VNL-GFP-RRE-SA

Set up: bir insan CD4 T hücre hattı, CEM-SS, ilk HIV-1 ile enfekte oldu. 48 saat enfeksiyonu, hücreler lentiviral parçacıklar, VNL-GFP-RRE-SA ile süperenfekte. Bir iki gün süperenfeksiyonu sonra, GFP pozitif hücreler flow sitometri ile analiz edildi. Kontrol olarak, HIV-1 enfekte olmamış CEM-SS hücreleri aynı VNL-GFP-RRE-SA ile enfekte edildi. Sadece HIV-1 ile enfekte CEM-SS hücreleri, HIV-1 enfekte olmamış CEM-SS hücreleri GFP pozitif hücreler doğurdu değil.

Prosedür:

1. Enfeksiyon iki saat önce, nihai konsantrasyonu 4 mg / ml polybrane ekleyin. Hücre sayımı ve her enfeksiyon için 2 x 10 ⁵ hücreleri alır. 2 saat boyunca 200 ng (p24), HIV-1 _NL4-3 hücreleri enfekte.
2. Tekrar süspansiyon, 10 dakika boyunca 300 xg'de santrifüj hücreleri Yıkama37 2 x 10 ⁵ hücre / mL ve kültür içine hücreleri ° C 48 saat boyunca.
3. Hücre sayımı ve VNL-GFP-RRE-SA ile enfeksiyon başına 2 x 10 ⁵ hücre almak. ° C gecede 37 VNL-GFP-RRE-SA ve inkübe 100 ml ekleyin. Hücreleri yıkayın ve 2 x 10 ⁵ hücre / ml içine tekrar süspansiyon.
4. 48 saat yazılan süperenfeksiyon flow sitometri analizi gerçekleştirin. Enfekte hücrelerin pelet ve 20 dakika oda sıcaklığında inkübe 500 ml% 1 paraformaldehede, içine yeniden süspanse edildi ve daha sonra bir FACScan analizörü (Becton Dickenson) analiz.

4. Temsilcisi Sonuçlar

Deneyleri başarıyla yapılmaktadır kontrolü, GFP pozitif hücreler, HIV-1 enfekte olmamış CEM-SS tespit edilebilir, ancak, kayda değer bir GFP nüfus, akış sitometresinin tarafından HIV-1 ile enfekte CEM-SS hücreleri tespit olacaktır hücreleri.

Deneyleri başarıyla yapılmaktadır, Rev-bağımlı lentiviral vektör, VNL-GFP-RRE-SA, yeşil floresan protein (GFP) ifade ölçümü yoluyla, hücre popülasyonlarının yaşayan kopyalayan HIV son derece özel bir algılama izin verecektir. Bu örnekte, hasat CEM-SS hücreleri fare CD24, HSA karşı PE-etiketli sıçan monoklonal antikor ile boyandı ve daha sonra HSA ve GFP ifade hem de bir akış sitometresinin analiz.

Şekil 1'de görüldüğü gibi, oldukça büyük bir GFP nüfus VNL-GFP-RRE-SA (Şekil 1c) süperenfekte HIV-1 ile enfekte olan hücreleri tespit edildi. Buna karşılık, GFP pozitif hücrelerin lentiviral süperenfeksiyon (Şekil 1a) veya HIV-1 enfekte olmamış hücrelerdeki lentiviral süperenfeksiyon (Şekil 1b). Olmadan ya HIV-1 enfekte olmamış CEM-SS hücreleri tespit edildi

Tartışmalar

Önceki gelişmiş Tat bağımlı ekspresyon vektörleri olduğu gibi, Rev sistemi gelişmiş bir HIV sürecinin bir sömürü burada anlatılan. Rev-bağımlılık dahil LTR tabanlı ifade vektör kopyalayan HIV varlığı son derece bağımlı hale getirir. Burada bildirilen bu vektör uygulama, HIV-bağımlı bir muhabir virüs, HIV-pozitif hücrelerin tanımlamak için yeni bir yeni bir yaklaşım sunuyor. Vektör canlı hücrelerin incelenmesine izin veren, temel veya klinik deneyler için herhangi bir gen ifade ve bir sözde-daktilo lentivirüs olarak, en hücre tipleri ve dokulara erişimi vardır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biosafety Cabinet
37°C 5%CO2 incubator
Flow cytometer		FACSCalibur
Centrifuge	Beckman Coulter Inc.	Allega®6KR
4°C regrigerator
-20°C refrigerator
-80°C refrigerator
Cell counter	Nexcelom Bioscience	Cellometer® AutoT4
HEK293T cell line	National Institutes of Health
CEM-SS cell line	National Institutes of Health
Jurkat cell line J1.1	National Institutes of Health
DMEM	Invitrogen	11965-118
RPMI 1640	Invitrogen	21870
HI FBS	Invitrogen	10438-018
HIV-1NL4-3			prepared by tranfsection of HeLa cells with cloned proviral DNA
pNL-GFP-RRE			copmlete deletion of all HIV ORFs of pNL4-3
pNL-GFP-RRE-SA			Insert HIV-1 A5 and D4 into pNL-GFP-RRE
pCMVΔ8.2			provided by Dr. Dider Trono
pHCMV-G
10 x HBS (Hepes Buffered Saline)	Invitrogen	11344-041
2M CaCl2 buffer	Invitrogen	S-013-154-10
1% paraformaldehy	Sigma-Aldrich	158127
Bleach
50ml Falcon tubes	BD Biosciences	358206
5ml round bottom tubes	BD Biosciences	352063
0.45μM Millipore filter	EMD Millipore	SLHA033SS
0.20μM Millipore filter	EMD Millipore	SLFG85000
100mm Petri-dish	Sigma-Aldrich	CLS430588
Size-exclusion column (100,000MW cut off)	Sartorius AG	VS2041
2ml frozen tube	Axygen Scientific	SCT-200
96-well plate	BD Biosciences	353227
1.7mL Microcentrifuge Tube	Axygen Scientific	MCT- 175-C