Marcatura specifica di HIV-1 Cellule positive con un Rev-dipendente Vector lentivirali Esprimendo la proteina fluorescente verde

Riepilogo

Abbiamo sviluppato un vettore lentivirale che possiede, oltre alla Tat-reattiva LTR, l'Ap-risposta elemento (RRE) che possono regolare l'espressione genica giornalista in modo da HIV-1 Tat e Rev-dipendente. Il vettore consente l'individuazione specifica di replicare l'HIV nelle cellule viventi attraverso l'espressione di GFP.

Abstract

La maggior parte di HIV-reattiva vettori di espressione sono basati sul promotore di HIV, la ripetizione terminale lunga (LTR). Mentre risponde ad una proteina HIV in fase precoce, Tat, la LTR è anche sensibile agli stati di attivazione cellulare e per l'attività di cromatina locale dove l'integrazione è avvenuta. Questo può portare ad alta HIV-indipendente attività, e ha limitato l'utilità di LTR-reporter per marcare le cellule HIV positivi ^1,2,3. Qui, abbiamo costruito un vettore di espressione lentivirali che possiede, oltre alla Tat-reattiva LTR, numerose sequenze di DNA dell'HIV che includono l'Ap-risposta elemento e dei siti di splicing HIV ^4,5,6. Il vettore è stato incorporato in un virus giornalista lentivirale, consentendo il rilevamento altamente specifici di replicare l'HIV in popolazioni di cellule viventi. L'attività del vettore è stata misurata l'espressione della proteina fluorescente verde (GFP). L'applicazione di questo vettore come riportato qui offre un nuovo approccio alternativa ai metodi esistenti, come la PCR in situ o colorazione dell'antigene HIV, di identificare le cellule HIV-positive. Il vettore può anche esprimere geni terapeutici per la sperimentazione clinica o di base per indirizzare le cellule HIV-positive.

Protocollo

1. Trasfezione di plasmidi per la produzione delle particelle lentivirali Rev-dipendente

Set up: The Rev-dipendente GFP vettori lentivirali, PNL-GFP-RRE-SA, è stato descritto in precedenza ^4,5,6. Per assemblare in una particella virale, il plasmide è stato contransfected in cellule HEK293 T con HIV-1 costruire imballaggi, pCMVΔ8.2 (gentilmente fornito dal Dr. Didier Trono), e un plasmide porta la glicoproteina VSV-G (pHCMV-G) . La trasfezione è stata effettuata utilizzando il metodo di fosfato di calcio.

Preparazione di tamponi: 10 X HBS (Hepes Buffered Saline) è stata preparata sciogliendo 5 g di Hepes, 8 g di NaCl, 0,37 g di KCl, 1 g di destrosio, 0,103 g di Na ₂ HPO ₄ (anidro) in 100 ml di H ₂ O. Aliquota the10 X tampone HBS in 1 ml aliquote e conservare a -20 ° C. Al momento della transfezione, convertire il X 10 HBS a 2 x HBS con H ₂ O (1: 5 diluizione), e portare il pH compreso tra 7,05-7,12. (Per 10 ml 2 X HBS, che di solito richiede circa 50 ml di NaOH 1M). Filtro sterilizzare il tampone HBS 2X passando attraverso un filtro Millipore 0,22 mM. CaCl tampone ₂ è stata preparata sciogliendo CaCl ₂ in 10 mm ad un Hepes 2M concentrazione finale. Regolare il pH a 5,8, filtro sterilizzare il buffer e conservare a 4 ° C.

Procedimento:

1. Un giorno prima della transfezione, semi di 2 x 10 ⁶ cellule HEK293T in un 100 mm Petri-piatto, e far crescere le cellule durante la notte in 10 ml di DMEM + 10% FBS a 37 ° C, 5% di CO _2.
2. Il giorno dopo, togliere surnatante dalle cellule e sostituirlo con 5 ml fresca DMEM + 10% FBS, continuamente le cellule di coltura per 4 ore.
3. In un tubo di polistirene da 5 ml, aggiungere 480 microlitri di buffer HBS 2X.
4. In un secondo tubo 5 ml in polistirolo, aggiungere 60 microlitri 2M CaCl ₂ buffer, il DNA plasmidico e trasfezione di buffer TE (1 mM Tris, 25 mM EDTA, pH 8,0) per un volume totale di 480 microlitri. Per ogni Petri-piatto, plasmidi deve essere aggiunto nella proporzione di 10 mcg di PNL-GFP-RRE-SA, 7,5 mcg di pCMVΔR8.3, e 2,5 mg di pHCMV-G.
5. Aggiungere il plasmide DNA CaCl ₂ miscela goccia a goccia nella provetta 2 X HBS, e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Un precipitato bene si formerà.
6. Aggiungere il 960 microlitri della miscela goccia a goccia dalla pipetta per le cellule. Incubare a 37 ° C, 5% CO ₂ durante la notte.
7. Il giorno successivo, rimuovere il supernatante e aggiungere 10 ml di fresca DMEM + 10% FBS, e continuamente incubare le cellule a 37 ° C CO, 5% ₂ durante la notte.
8. A 48 ore dopo la transfezione, raccogliere il virus eliminando il supernatante e trasferirlo in 50 mL sterile. Aggiungere 10 ml fresca fresca FBS DMEM + 10% in ogni Petri-piatto e continuare a cultura durante la notte. Conservare il supernatante virus a 4 ° C.
9. Continuare a raccogliere a 72 ore dopo la trasfezione raccogliendo il sopranatante. Unire tutti i surnatanti, e centrifugare il surnatante a 500 xg per 15 minuti per far sedimentare e rimuovere i detriti cellulari.
10. Il supernatante sono stati raccolti e filtrata attraverso un filtro Millipore 0,22 mM. Il virus si è ulteriormente concentrata nella dimensione-esclusione colonne.

2. Concentrare le particelle virali e determinare titolo virale

1. Particelle virali si sono concentrati da una dimensione di esclusione colonna (100.000 MW tagliati fuori, Centricoin). Surnatante virale è stato caricato in colonna, e centrifugati a 6.000 xga 4 ° C per 15 minuti.
2. Surnatante concentrato virale è stato raccolto, frazionare e conservati a -80 ° C.
3. Il titolo virale è stata determinata da infezione di un TNF-trattati, l'HIV-1 positivi linea cellulare Jacket, J1.1 7. Le cellule sono state coltivate in una piastra da 96 pozzetti a 2,5 x 10 ⁵ cellule per ml (100 ml in totale), e infettati con 100 ml di diluito serialmente VNL-GFP-RRE-SA per una settimana. Il titolo (TCID50) della particella è stata stimata contando i pozzi GFP positivo seguendo il metodo di Reed e Muench 8.

3. Marcatura di HIV-1 Cellule positive con la particella lentivirali, VNL-GFP-RRE-SA

Set up: un essere umano linea di cellule T CD4, CEM-SS, per la prima volta infettati con HIV-1. A 48 ore dopo l'infezione, le cellule sono state superinfezione con le particelle lentivirali, VNL-GFP-RRE-SA. A seguito di una superinfezione per altri due giorni, GFP-positive cellule sono state analizzate mediante citometria di flusso. Come controllo, l'HIV-1 non infette CEM-SS cellule sono state infettate con identico VNL-GFP-RRE-SA. Solo l'HIV-1-infetti le cellule CEM-SS ha dato luogo a cellule GFP positive ma non l'HIV-1 non infette CEM-SS cellule.

Procedimento:

1. Due ore prima dell'infezione, aggiungere polybrane ad una concentrazione finale di 4 mg / ml. Contare le celle e prendere 2 x 10 ⁵ cellule per ogni infezione. Infettare le cellule con 200 ng (p24) del virus HIV-1 _NL4-3 per 2 ore.
2. Lavaggio cellule centrifugare a 300 xg per 10 minuti, risospenderecellule in 2 x 10 ⁵ cellule / ml, e la cultura a 37 ° C per 48 ore.
3. Contare le celle e prendere 2 x 10 ⁵ cellule per infezione da VNL-GFP-RRE-SA. Aggiungere 100 ml di VNL-GFP-RRE-SA e incubare a 37 ° C durante la notte. Lavare le cellule e risospendere in 2 x 10 ⁵ cellule / ml.
4. Effettuare analisi di citometria a flusso a 48 dopo una superinfezione ore. Cellule infette sono state pellettato e risospese in 500 ml paraformaldehede 1%, incubate a temperatura ambiente per 20 minuti, e poi analizzati in un analizzatore FACScan (Becton Dickinson).

4. Rappresentante Risultati

Se gli esperimenti vengono eseguiti con successo, una popolazione consistente GFP sarà rilevata in HIV-1-infetti le cellule CEM-SS dal citometro a flusso, mentre, nel controllo, le cellule GFP positive non verranno rilevati in HIV-1 non infette CEM-SS cellule.

Se gli esperimenti vengono eseguiti con successo, il Rev-dipendente vettori lentivirali, VNL-GFP-RRE-SA, permetterà la rilevazione altamente specifici di replicazione HIV in popolazioni di cellule viventi, attraverso la misurazione della proteina verde fluorescente (GFP) espressione. In questo esempio, raccolte CEM-SS cellule sono state colorate con un PE-anticorpo marcato topo topo monoclonale contro CD24, HSA, e quindi analizzati su un citometro di flusso sia per HSA e di espressione della GFP.

Figura 1. Come si vede qui, una popolazione GFP consistente è stata rilevata in HIV-1-cellule infettate con superinfezione VNL-GFP-RRE-SA (Figura 1c). Al contrario, le cellule GFP positive non sono state rilevate in entrambi i non infetti da HIV-1 CEM-SS cellule senza superinfezione lentivirali (figura 1a) o di HIV-1 le cellule non infette con superinfezione lentivirali (Figura 1b).

Discussione

Come per il precedente sviluppato Tat-dipendente vettori di espressione, il sistema Rev qui descritto è uno sfruttamento di un processo evoluto HIV. L'inclusione di Rev-dipendenza rende l'LTR-based vettore di espressione altamente dipendente dalla presenza di replicazione dell'HIV. L'applicazione di questo vettore come riportato qui, un dipendente del virus HIV-reporter, offre un approccio nuovo romanzo di identificare le cellule HIV-positive. Il vettore consente di esame delle cellule viventi, può esprimere qualsiasi gene per la sperimentazione clinica o di base, e come uno pseudo-digitato lentivirus ha accesso alla maggior parte dei tipi di cellule e tessuti.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biosafety Cabinet
37°C 5%CO2 incubator
Flow cytometer		FACSCalibur
Centrifuge	Beckman Coulter Inc.	Allega®6KR
4°C regrigerator
-20°C refrigerator
-80°C refrigerator
Cell counter	Nexcelom Bioscience	Cellometer® AutoT4
HEK293T cell line	National Institutes of Health
CEM-SS cell line	National Institutes of Health
Jurkat cell line J1.1	National Institutes of Health
DMEM	Invitrogen	11965-118
RPMI 1640	Invitrogen	21870
HI FBS	Invitrogen	10438-018
HIV-1NL4-3			prepared by tranfsection of HeLa cells with cloned proviral DNA
pNL-GFP-RRE			copmlete deletion of all HIV ORFs of pNL4-3
pNL-GFP-RRE-SA			Insert HIV-1 A5 and D4 into pNL-GFP-RRE
pCMVΔ8.2			provided by Dr. Dider Trono
pHCMV-G
10 x HBS (Hepes Buffered Saline)	Invitrogen	11344-041
2M CaCl2 buffer	Invitrogen	S-013-154-10
1% paraformaldehy	Sigma-Aldrich	158127
Bleach
50ml Falcon tubes	BD Biosciences	358206
5ml round bottom tubes	BD Biosciences	352063
0.45μM Millipore filter	EMD Millipore	SLHA033SS
0.20μM Millipore filter	EMD Millipore	SLFG85000
100mm Petri-dish	Sigma-Aldrich	CLS430588
Size-exclusion column (100,000MW cut off)	Sartorius AG	VS2041
2ml frozen tube	Axygen Scientific	SCT-200
96-well plate	BD Biosciences	353227
1.7mL Microcentrifuge Tube	Axygen Scientific	MCT- 175-C