Marcação específica de HIV-1 células positivas utilizando um Vector Rev-dependente Lentivirus Expressando a Proteína Verde Fluorescente

Resumo

Nós desenvolvemos um vetor lentiviral que possui, além da LTR Tat-responsivo, o elemento Rev-resposta (RRE), que pode regular a expressão do gene repórter de uma forma HIV-1 Tat e Rev-dependente. O vetor permite a detecção específica de HIV replicar em células vivas através da expressão da GFP.

Resumo

A maioria dos vetores de HIV-responsive expressão são baseados no promotor do HIV, a repetições terminais longas (LTR). Enquanto resposta a uma proteína HIV cedo, Tat, a LTR também é sensível aos estados de ativação celular e à atividade da cromatina locais onde a integração ocorreu. Isso pode resultar em atividade HIV-independentes de alto, e restringiu a utilidade do LTR baseado repórter às células marca HIV positivo ^1,2,3. Aqui, construímos um vetor de expressão lentiviral que possui, além da LTR Tat-responsiva, inúmeras sequências de DNA do HIV que incluem o elemento Rev-resposta e os locais de emenda HIV ^4,5,6. O vetor foi incorporado um vírus repórter lentiviral, permitindo a detecção altamente específico de HIV replicação em populações de células vivas. A atividade do vetor foi medida pela expressão da proteína fluorescente verde (GFP). A aplicação deste vector como o aqui relatado oferece uma abordagem nova alternativa aos métodos existentes, tais como PCR in situ ou a coloração do antígeno HIV, para identificar o HIV de células positivas. O vetor também pode expressar genes terapêuticos para a experimentação básica ou clínica para alvejar HIV-positivos células.

Protocolo

1. Transfecção de plasmídeos para Produção de Partículas do Rev-dependente Lentivirus

Set up: The Rev-dependente GFP vector lentiviral, PNL-GFP-RRE-SA, foi descrita anteriormente ^4,5,6. Para montar em uma partícula viral, o plasmídeo foi contransfected em HEK293 células T com um HIV-1 construção de embalagens, pCMVΔ8.2 (gentilmente cedido pelo Dr. Dider Trono), e um plasmídeo carregando a glicoproteína VSV-G (pHCMV-G) . A transfecção foi realizada usando o método de fosfato de cálcio.

Preparação de tampões: 10 X HBS (Hepes Buffered Saline) foi preparada pela dissolução de 5 g de Hepes, 8 g de NaCl, 0,37 g de KCl, 1 g de Dextrose, 0,103 g de Na ₂ HPO ₄ (anidro) em 100 mL de H ₂ O. Alíquota the10 X tampão HBS em 1 mL alíquotas e armazenar a -20 ° C. No momento da transfecção, converter o 10 X 2 X HBS para HBS com H ₂ O (1: 5 de diluição), e ajustar o pH entre 7,05-7,12. (Para 10 mL 2 X HBS, que normalmente necessita de aproximadamente 50 mL de NaOH 1M). Filtro de esterilizar o tampão HBS 2X passando por um filtro Millipore 0,22 mM. CaCl tampão ₂ foi feita pela dissolução CaCl ₂ em 10 mM Hepes a uma concentração de 2M final. Ajustar o pH para 5,8, filtro de esterilizar o buffer e armazenar a 4 ° C.

Procedimento:

1. Um dia antes da transfecção, as sementes de 2 x 10 ⁶ células HEK293T em um prato de Petri de 100 mm, e cultivar células durante a noite em 10 mL DMEM + 10% FBS a 37 ° C, 5% de CO _2.
2. No dia seguinte, retire o sobrenadante das células e substituir com 5 mL fresco DMEM + 10% FBS, as células continuamente cultura por 4 horas.
3. Em um tubo de poliestireno 5 mL, adicionar 480 mL 2X tampão HBS.
4. Em um segundo tubo de poliestireno 5 mL, adicionar 60 mL 2M CaCl ₂ buffer, o DNA do plasmídeo, e transfecção tampão TE (1 mM Tris, 25 mM EDTA, pH 8.0) para um volume total de 480 mL. Para cada placa de Petri, plasmídeos deve ser adicionado na proporção de 10 mg de PNL-GFP-RRE-SA, 7,5 mg de pCMVΔR8.3, e 2,5 mg de pHCMV-G.
5. Adicione o plasmídeo DNA-CaCl ₂ mistura gotas ao tubo de 2 HBS X, e incubar em temperatura ambiente por 30 minutos. A multa será precipitar formulário.
6. Adicione a 960 mL da mistura de gotas, com uma pipeta para as células. Incubar a 37 ° CO C, 5% ₂ durante a noite.
7. No dia seguinte, remover o sobrenadante e adicionar 10 mL fresco DMEM + 10% FBS, e continuamente incubar as células a 37 ° CO C, 5% ₂ durante a noite.
8. Menos 48 horas após a transfecção colheita, o vírus através da remoção do sobrenadante e transferindo-o para 50 mL tubos estéreis. Adicionar 10 mL fresco fresco FBS DMEM + 10% em cada Placa de Petri e continuar a cultura durante a noite. Armazenar o sobrenadante vírus a 4 ° C.
9. Continuar a colheita em 72 horas após a transfecção, recolhendo o sobrenadante. Combine todos os sobrenadantes e centrifugar o sobrenadante a 500 xg por 15 minutos para pellet e remover restos celulares.
10. O sobrenadante foram coletadas e filtradas por um filtro Millipore 0,22 mM. O vírus foi mais concentrado através de tamanho-exclusão colunas.

2. Concentre-se partículas virais e Determine título viral

1. Partículas virais foram concentrados por uma coluna de tamanho-exclusão (100.000 MW cortado, Centricoin). Sobrenadante viral foi carregado na coluna e centrifugado a 6000 xg, a 4 ° C por 15 minutos.
2. Sobrenadante viral concentrado foi coletadas, aliquotado e armazenado a -80 ° C.
3. O título viral foi determinada por infecção de uma TNF-tratadas, HIV-1 linha celular positiva Jacket, J1.1 7. As células foram cultivadas em uma placa de 96 poços de 2,5 x 10 ⁵ células por mL (100 mL de volume total), e infectados com 100 mL de serialmente diluída VNL-GFP-RRE-SA por uma semana. O título (TCID50) da partícula foi estimado pela contagem dos poços GFP positivas seguindo o método de Reed e Muench 8.

3. Marcação HIV-1 células positivas com o Particle Lentivirus, VNL-GFP-RRE-SA

Set up: um ser humano de células T CD4 linha, CEM-SS, foi o primeiro infectado com HIV-1. Menos 48 horas após a infecção, as células foram superinfected com as partículas lentiviral, VNL-GFP-RRE-SA. Seguintes superinfecção por mais dois dias, a GFP células positivas foram analisadas por citometria de fluxo. Como controle, não infectados pelo HIV-1 CEM-SS células foram infectadas com idêntica VNL-GFP-RRE-SA. Somente o HIV-1-infected CEM-SS células deram origem a células GFP positivas, mas não o HIV-1 não infectados CEM SS-células.

Procedimento:

1. Duas horas antes da infecção, adicione polybrane para uma concentração final de 4 mg / mL. Contagem de células e tomar 2 x 10 ⁵ células para cada infecção. Infectar as células com 200 ng (p24) do HIV-1 _NL4-3 para 2 horas.
2. Lavar as células por centrifugação a 300 xg por 10 minutos, ressuspendercélulas em 2 x 10 ⁵ células / mL, e da cultura a 37 ° C por 48 horas.
3. Contagem de células e tomar 2 x 10 ⁵ células por infecção com VNL-GFP-RRE-SA. Adicione 100 ml de VNL-GFP-RRE-SA e incubar a 37 ° C durante a noite. Lavar e ressuspender as células em 2 x 10 ⁵ células / mL.
4. Realizar análises de citometria de fluxo em 48 horas após a superinfecção. Células infectadas foram peletizadas e ressuspenso em 500 mL paraformaldehede 1%, incubadas em temperatura ambiente por 20 minutos, e então analisados ​​em um analisador FACScan (Becton Dickinson).

4. Resultados representante

Se os experimentos são realizados com sucesso, uma população considerável GFP será detectada em HIV-1-infected CEM-SS células pelo citômetro de fluxo, enquanto que, no controle, as células GFP positivas não será detectada em HIV-1 não infectados CEM-SS células.

Se os experimentos são realizados com sucesso, o vetor Rev-dependente lentiviral, VNL-GFP-RRE-SA, irá permitir a detecção altamente específico de HIV replicação em que vivem populações de células, através da medição da fluorescência verde expressão da proteína (GFP). Neste exemplo, colhidas CEM-SS células foram marcadas com um anticorpo de rato PE-rotulados monoclonais contra CD24 do mouse, HSA, em seguida, analisados ​​em um citômetro de fluxo para ambos HSA e expressão GFP.

Figura 1. Como mostrado aqui, uma população considerável GFP foi detectado em HIV-1 as células infectadas com superinfected VNL-GFP-RRE-SA (Figura 1c). Em contraste, as células GFP positivas não foram detectados em ambos os HIV-1 não infectados CEM SS-células sem superinfecção lentiviral (Figura 1a) ou HIV-1 células não infectadas com superinfecção lentiviral (Figura 1b).

Discussão

Como com o anteriormente desenvolvidos vetores Tat-dependente expressão, o sistema Rev aqui descrito é uma exploração de um processo de HIV evoluiu. A inclusão de Rev-dependência torna o vetor de expressão LTR baseado altamente dependente da presença de HIV se reproduza. A aplicação deste vector como aqui relatado, um vírus HIV repórter-dependente, oferece uma nova abordagem nova para identificar o HIV de células positivas. O vetor permite o exame de células vivas, podem expressar todo o gene para a experimentação básica ou clínica, e como um lentivírus pseudo-digitado tem acesso a maioria dos tipos de células e tecidos.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biosafety Cabinet
37°C 5%CO2 incubator
Flow cytometer		FACSCalibur
Centrifuge	Beckman Coulter Inc.	Allega®6KR
4°C regrigerator
-20°C refrigerator
-80°C refrigerator
Cell counter	Nexcelom Bioscience	Cellometer® AutoT4
HEK293T cell line	National Institutes of Health
CEM-SS cell line	National Institutes of Health
Jurkat cell line J1.1	National Institutes of Health
DMEM	Invitrogen	11965-118
RPMI 1640	Invitrogen	21870
HI FBS	Invitrogen	10438-018
HIV-1NL4-3			prepared by tranfsection of HeLa cells with cloned proviral DNA
pNL-GFP-RRE			copmlete deletion of all HIV ORFs of pNL4-3
pNL-GFP-RRE-SA			Insert HIV-1 A5 and D4 into pNL-GFP-RRE
pCMVΔ8.2			provided by Dr. Dider Trono
pHCMV-G
10 x HBS (Hepes Buffered Saline)	Invitrogen	11344-041
2M CaCl2 buffer	Invitrogen	S-013-154-10
1% paraformaldehy	Sigma-Aldrich	158127
Bleach
50ml Falcon tubes	BD Biosciences	358206
5ml round bottom tubes	BD Biosciences	352063
0.45μM Millipore filter	EMD Millipore	SLHA033SS
0.20μM Millipore filter	EMD Millipore	SLFG85000
100mm Petri-dish	Sigma-Aldrich	CLS430588
Size-exclusion column (100,000MW cut off)	Sartorius AG	VS2041
2ml frozen tube	Axygen Scientific	SCT-200
96-well plate	BD Biosciences	353227
1.7mL Microcentrifuge Tube	Axygen Scientific	MCT- 175-C