그린 형광 단백질을 표현 레브 종속 Lentiviral 벡터를 사용하여 HIV - 1 양성 세포의 특정 마킹

요약

우리는 태트 - 응답성 LTR 이외에, 가지고 lentiviral 벡터를 개발, HIV - 1 태트 및 레브 종속적인 방식으로 기자의 유전자 발현을 조절 할 수 레브 - 반응 요소 (RRE). 벡터는 GFP의 표현을 통해 살아있는 세포에서 HIV 복제의 구체적인 검색을 허용합니다.

초록

HIV - 응답 표현 벡터의 대부분은 HIV의 발기인, 긴 터미널 반복 (LTR)을 기반으로합니다. 초기 HIV 단백질, 태트 대응 반면, LTR는 세포 활성화 상태와 통합이 발생 지역 염색질 활동으로 반응합니다. 이것은 높은 HIV 독립적인 활동의 결과 수 있으며, 마르크 HIV 양성 세포가 ^1,2,3에 LTR 기반 기자의 유용성을 제한하고 있습니다. 여기, 우리는 태트 - 응답 LTR, 레브 - 반응 요소와 HIV의 splicing 사이트 ^4,5,6를 포함 수많은 HIV의 DNA 시퀀스 이외에, 가지고 표현 lentiviral 벡터를 잽니다. 벡터는 살아있는 세포 집단에서 HIV의 복제 매우 구체적인 감지를 허용, lentiviral 기자 바이러스에 통합되었다. 벡터의 활동은 녹색 형광 단백질 (GFP)의 표현에 의해 측정되었다. 여기보고로 벡터의 응용 프로그램은 HIV - 양성 세포를 확인하기 위해 현장 PCR이나 HIV의 항원 얼룩과 같이 기존의 방법에 새로운 대안의 접근 방식을 제공합니다. 벡터는 또한 HIV - 양성 세포를 대상으로 기본 또는 임상 실험을위한 치료 유전자를 표현할 수 있습니다.

프로토콜

1. 레브 의존 Lentiviral 입자의 생산을위한 Plasmids의 Transfection

설정 : 레브 종속 GFP lentiviral 벡터, pNL - GFP - RRE - SA는, 이전 ^4,5,6 설명했다. 바이러스 입자로 조립하려면, 플라스미드는 HIV - 1 포장 구조, pCMVΔ8.2 (친절 박사 Dider Trono에서 제공)와 HEK293 T 세포에 contransfected 및 플라스미드는 VSV - G의 당단백질 (pHCMV - G)를 가지고 가던 중이었습니다 . transfection은 인산 칼슘 방법을 사용하여 실시되었다.

버퍼의 준비 : 10 X HBS는 (Hepes가 살린 버퍼) Hepes 5 G를 해소하여 준비했습니다 8 NaCl의 g, 100 ML에 나 ₂ HPO ₄ (무수)의 KCl, 덱스 트로 오스의 1g, 0.103 g의 0.37 g H ₂ O. 나누어지는 the10 X HBS의 한 ML의 aliquots에 버퍼와 -20 ° C.에 저장 transfection의 당시 H ₂ O (1 : 5 희석) 2 X HBS에 10 X HBS로 변환하고, 사이에 7.05로 산도를 조정 - 7.12. (10 ML 2 X HBS를 위해, 그것은 보통 1M NaOH의 약 50 μL가 필요합니다.) 0.22 μm의 Millipore 필터를 통과하여 2X HBS 버퍼를 소독 필터. CaCl _{2 버퍼는} 최종 농도 2M 10 MM의 Hepes에 CaCl _2를 용해하여 만들어졌다. 5.8으로 산도를 조절, 4에서 버퍼와 저장소를 소독 필터 ° C.를

절차 :

1. 이전 transfection 한 일, 종자 2 X 10 ⁶ HEK293T 페트리 - 요리 100mm의 세포, 37 10 ML DMEM + 10% FBS에서 야간 세포를 성장 ° C, 5 % CO _2.
2. 그 다음날, 세포의 표면에 뜨는 제거 5 ML 신선한 DMEM + 10% FBS, 4 시간 동안 지속적으로 문화 전지로 교체하십시오.
3. 5 ML의 폴리스티렌 관에서 480 μL 2X HBS 버퍼를 추가합니다.
4. 두 번째 5 ML의 폴리스티렌 튜브에 480 μL의 총 부피 60 μL 2M CaCl ₂ 버퍼, 플라스미드 DNA 및 transfection TE 버퍼를 (1 MM 트리스, 25 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8.0)을 추가합니다. 각 페트리 - 요리, plasmids은 pNL - GFP - RRE - SA, pCMVΔR8.3의 7.5 μg, 그리고 pHCMV - G 2.5 MG 10 μg의 비율에 추가되어야합니다.
5. 2 X HBS 튜브에 dropwise 플라스미드 DNA - CaCl ₂ 혼합물을 추가하고 30 분 동안 상온에서 알을 품다. 좋은 침전물이 형성됩니다.
6. 세포에 피펫으로 dropwise 혼합물의 960 μL를 추가합니다. ° C, 5 % CO ₂ 밤새 37 알을 품다.
7. 다음날, 뜨는을 제거하고 10 ML 신선한 DMEM + 10% FBS를 추가하고, 지속적으로 37 ° C, 5 % CO ₂ 밤새에서 세포를 품어.
8. 48 시간 게시 transfection에서 수확 뜨는을 제거 50 ML 멸균 튜브에 전송하여 바이러스. 각 페트리 - 그릇에 신선한 10 ML 신선한 DMEM + 10% FBS를 추가하고 야간 문화를 계속합니다. 4 바이러스 뜨는을 저장 ° C.
9. 뜨는를 수집하여 72시간 게시물 transfection에 수확을 계속합니다. 모든 supernatants를 결합하고, 펠릿 15 분 500 XG에서 supernatants를 원심과 세포 잔해를 제거합니다.
10. 뜨는은 0.22 μm의 Millipore 필터를 통해 수집 및 필터링되었습니다. 바이러스는 더 크기 배제 컬럼을 통해 집중되었다.

2. 바이러스성 입자를 집중 바이러스성 Titer 결정

1. 바이러스성 입자는 크기 제외 열 (100,000 MW가 잘려, Centricoin)에 의해 집중되었다. 바이러스성 뜨는은 열에로드, 4 15 분 동안 ° C에서 6,000 XG에 centrifuged했다.
2. 집중 바이러스 뜨는가 수집 aliquoted하고, -80 ° C.에 저장된
3. 바이러스 titer는 TNF - 처리, HIV - 1 양성 재킷 세포 라인, J1.1 7 감염에 의해 결정되었다. 전지는 ML 당 2.5 X 10 ⁵ 셀 (100 ML 전체 볼륨)에서 96 접시에 잘 교양하고, 일주일 동안 순차적으로 희석 vNL - GFP - RRE - SA 100 ML에 감염되었습니다. 입자의 titer (TCID50)는 리드와 Muench 8 방법 다음과 같은 GFP 긍정적인 우물을 계산하여 추정되었다.

3. 마킹 HIV - 1 Lentiviral 입자와 함께 긍정적인 세포, vNL - GFP - RRE - SA

설정 : 인간의 CD4 T 세포 라인, CEM - SS는, 먼저 HIV - 1에 감염되었습니다. 48 시간 이후 감염에서, 세포는 lentiviral 입자 vNL - GFP - RRE - SA와 함께 superinfected되었습니다. 또 이틀 동안 superinfection 따라 GFP 양성 세포 유동세포계측법에 의해 분석되었다. 컨트롤로서, HIV - 1 감염되지 않은 CEM - SS 세포는 동일 vNL - GFP - RRE - SA에 감염되었습니다. 단지 HIV - 1에 감염된 CEM - SS 세포는 HIV - 1 감염되지 않은 CEM - SS 세포를 GFP 양성 세포에 상승했다지만.

절차 :

1. 감염 전에 두 시간은 최종 농도 4 MG / ML에 polybrane를 추가합니다. 세포를 카운트하고 각 감염 2 × 10 ⁵ 세포를 가져가라. 2 시간 동안 HIV - 1 _{NL4 - 3} 200 NG (p24)의 세포를 감염.
2. resuspend은 10 분 300 XG에서 원심 분리기에 의해 세포를 세척48 시간 37 2 X 10 ⁵ 세포 / ML, 문화에 세포 ° C.
3. 세포를 카운트하고 vNL - GFP - RRE - SA와 함께 감염 당 2 × 10 ⁵ 세포를 가져가라. ° C 야간 37 vNL - GFP - RRE - SA와 부화 100 ML을 추가합니다. 세포를 씻어 2 × 10 ⁵ 세포 / ML에 resuspend.
4. 48 시간 게시 superinfection에서 유동세포계측법 분석을 수행합니다. 감염된 세포는 pelleted 20 분 실온에서 incubated 500 ML 1 % paraformaldehede로 resuspended되었고, 다음 FACScan 분석기 (백톤 디컨슨)에서 분석했다.

4. 대표 결과

실험이 성공적으로 수행하는 경우에는 컨트롤에 GFP 양성 세포가 HIV - 1 감염되지 않은 CEM - SS에서 검색되지 않습니다, 반면, 상당한 GFP의 인구는, 흐름 cytometer에 의해 HIV - 1에 감염된 CEM - SS 세포에 감지됩니다 세포.

실험이 성공적으로 수행하는 경우, 레브 의존 lentiviral 벡터, vNL - GFP - RRE - SA는 녹색 형광 단백질 (GFP) 표현의 측정을 통해 세포 인구 생활의 복제 HIV의 매우 구체적인 검출을 허용합니다. 이 예제에서 수확 CEM - SS 세포는 마우스 CD24, HSA에 대한 PE - 라벨 쥐의 단클론 항체와 스테인드되었고, 다음 HSA 및 GFP의 표현 모두에 대해 흐름 cytometer에 분석했다.

그림 1. 여기 같이, 상당한 GFP의 인구가 vNL - GFP - RRE - SA (그림 1C)와 superinfected HIV - 1에 감염된 세포에서 발견되었다. 대조적으로, GFP 양성 세포는 lentiviral superinfection (그림 1A) 또는 HIV - 1 lentiviral superinfection (그림 1B)와 감염되지 않은 세포.없이도 HIV - 1 감염되지 않은 CEM - SS 세포에서 발견되지 않았습니다

토론

이전 개발 태트 종속적인 표현 벡터와 마찬가지로 수익 시스템은 진화 HIV 과정의 착취가 여기에 설명되어 있습니다. 레브 - 의존의 포함은 복제 HIV의 존재에 LTR 기반 발현 벡터가 매우 의존 렌더링. 여기보고로 벡터의 응용 프로그램 HIV에 의존 기자의 바이러스는 HIV - 양성 세포를 식별하는 소설 새로운 접근 방식을 제공합니다. 벡터는 살아있는 세포의 검사를 허용하는 기본 또는 임상 실험에 대한 유전자를 표현하고 의사 입력 lentivirus 같은 대부분의 세포 유형과 조직에 액세스할 수 있습니다 수 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biosafety Cabinet
37°C 5%CO2 incubator
Flow cytometer		FACSCalibur
Centrifuge	Beckman Coulter Inc.	Allega®6KR
4°C regrigerator
-20°C refrigerator
-80°C refrigerator
Cell counter	Nexcelom Bioscience	Cellometer® AutoT4
HEK293T cell line	National Institutes of Health
CEM-SS cell line	National Institutes of Health
Jurkat cell line J1.1	National Institutes of Health
DMEM	Invitrogen	11965-118
RPMI 1640	Invitrogen	21870
HI FBS	Invitrogen	10438-018
HIV-1NL4-3			prepared by tranfsection of HeLa cells with cloned proviral DNA
pNL-GFP-RRE			copmlete deletion of all HIV ORFs of pNL4-3
pNL-GFP-RRE-SA			Insert HIV-1 A5 and D4 into pNL-GFP-RRE
pCMVΔ8.2			provided by Dr. Dider Trono
pHCMV-G
10 x HBS (Hepes Buffered Saline)	Invitrogen	11344-041
2M CaCl2 buffer	Invitrogen	S-013-154-10
1% paraformaldehy	Sigma-Aldrich	158127
Bleach
50ml Falcon tubes	BD Biosciences	358206
5ml round bottom tubes	BD Biosciences	352063
0.45μM Millipore filter	EMD Millipore	SLHA033SS
0.20μM Millipore filter	EMD Millipore	SLFG85000
100mm Petri-dish	Sigma-Aldrich	CLS430588
Size-exclusion column (100,000MW cut off)	Sartorius AG	VS2041
2ml frozen tube	Axygen Scientific	SCT-200
96-well plate	BD Biosciences	353227
1.7mL Microcentrifuge Tube	Axygen Scientific	MCT- 175-C