İskelet Kası progenitörlerin saflaştırılması

Özet

Enzimatik disosiasyon, fibro / adipogenic ve fare iskelet kası miyojenik atalarıdır flow sitometri ile yüzey etiketleme ve arıtma yöntemi.

Özet

İskelet kası, birden fazla farklı embriyonik kökenleri ve gelişim potansiyeli progenitör popülasyonlar içerir. Genellikle myofiber plazma membran ve ensheaths bu laminin zengin bazal membran arasında bir "uydu hücre pozisyonu" ikamet miyojenik progenitörlerle sadece miyojenik soy ^1,2 kararlıyız kendini yenileyen hücreler vardır. Biz, son zamanlarda, miyofibroblastlar ve verimli bir şekilde çoğalması girerek zarar yanıt ve ^doku rejenerasyonu 3,4 sırasında miyojenik hücrelere trofik destek sağlar beyaz adipositler üretebilir gemi ilişkili atalarıdır ikinci sınıf bir tarif var. Belirli bir hücre popülasyonu gelişimsel ve rejeneratif potansiyelini belirlemek için en güvenilir testlerin biri izolasyon ve ^5-7 nakli dayanmaktadır. Bu amaçla biz Biz bu makalede anahat enzimatik ayrışmış kas flow sitometri, protokolleri kendi temizlemesi için optimize var. Bu yöntemi kullanarak elde edilen popülasyonları miyojenik veya fibrotik / adipogenic koloni oluşturan hücreler de içerecektir: başka bir hücre tipleri, in vitro genişleyen veya in vivo teslim kalan yeteneğine sahiptir. Ancak, bu popülasyonların bir taze sıralaması altkümelerini, koloniler kurma veya alıcıların engrafting yeteneğinden yoksun diğer kirletici hücreleri içerebilir akılda tutmak gerekir moleküler analizi (örneğin QRT-PCR) için sıralama hemen sonra kullanılır.

Protokol

1. Doku Toplama:

1. 7 ile 12 hafta arasında farelerin kullanın. Genellikle, en az iki hayvan kullanılır: Biri, tazminat ve floresan-eksi izotip kontrol örnekleri için gerekli FACS tek renkli kontrolleri kurmaktır. Diğer sıralama için gerçek bir örnek.
2. CO ₂ inhalasyon fareler Euthanize ya da tercih edilen bir etik protokole göre. Fare kürk, bir kağıt havlu, yukarı bakacak, ve% 70 etanol ile sprey üzerine koyun fareler iyice bulaşmasını önlemek için.
3. Forseps ile karın bölgesindeki cilt kaldırın, sonra keskin bir makas ile küçük bir uzunlamasına kesilmiş.
4. Peel deri zıt yönlerde iki flep (yukarı ve aşağı) altında arka bacak kaslarını tamamen açığa çıkarmak için.
5. Tibia her iki tarafın birlikte makas ekleme ve uzatarak Vergi kas dokusu.
6. Kas dokusu ayıklamak için femur için de aynı işlemi tekrarlayın.
7. Her fare doku için bir çanak kullanarak, 60mm Petri-yemekler tüm eksize kas dokusu yerleştirin.
8. Tüm fareler için yukarıdaki işlemi tekrarlayın.

2. Into Enzimatik Sindirim Tek Hücreler Doku ayrıştırmaları:

Protokol bu bölümü boyunca, steril reaktifler ve araçları kullanmak ve steril koşullar altında çalışmak.

9. Her Petri-çanak, 2 kollajenaz II mL (Sigma, kedi # 6885, 500u / ml) ve 250mm _CaCl 2 stokunun 20 mcL ekleyin .
10. Kadar kirlenmiş çıkarmak ve atmak için dikkat iki forseps (tek dişli, 2 diş Güzel Bilim Araçlar, kedi # 11.051-10, 11.154-10) ile küçük parçalar (yaklaşık 1 mm ^3), kas dokusu içine Gözyaşı mümkün olduğunca olmayan kas dokusu.
11. Petri-yemekleri Kapak ve 30 dakika boyunca 37 santigrat derece kuluçkaya yatmaktadır.
12. Petri-yemekleri Al ve tam olarak mash doku parçaları 3 ml'lik bir şırınga pistonu kullanabilirsiniz. Bulaşmayı önlemek için her bir örnek için bir piston kullanın.
13. Her Petri yemek (~ 5 ml) steril soğuk PBS (gerekli tüm doku kurtarmak için Petri-bulaşık durulama) ekleyin ve 50 ml Falcon tüp içine doku çamur transferi
14. Falcon tüp şiddetle Sarsıntı, PBS ile tüp doldurmak, santrifüj @ 800rpm x 5 dakika (Eppendorf tezgah üstü Model: 5810R), ve supernatant aspire (tekrar 3 defa)
15. 37 derece sıcaklıkta inkübe edin, her tüp ve CaCl ₂ 10μL (250mm): 1 ml kollajenaz D karışımı (Roche, Kedi # 11088882001, 1.5u / ml) / Dispase II (04942078001, 2.4u / ml Roche, Kedi #) ekleyin bir saat boyunca dönme ile Santigrat.
16. Soğuk, steril PBS, vortex ve doku homojenize iyice pipet 5-10 ml ekleyin.
17. PBS ile tüpler kadar doldurun ve iyice karıştırın.
18. Sıvı, doku kalan büyük parça süzmek için 50 ml Falcon tüp üstüne yerleştirilir 40μm hücre süzgecinden aktarın. Eşit üç 50ml Falcon tüpleri içine her bir örnek bölün. PBS, 5 dakika sonra 8 santigrat derece @ 1600rpm santrifüj tüpleri her doldurun.
19. Süpernatantı atın ve boyama hücreleri toplamak.

3. Antikor Boyama ve sıralama:

Protokol bu bölümü boyunca, steril FACS ve toplama tamponlar ve steril koşullar altında çalışmak. Ticari antikorlar, eğer uygun bir biçimde ve genellikle steril olarak kabul edilir.

20. Tek renk ve izotip kontrol numuneleri için, 1 ml FACS tampon örnek tekrar süspansiyon ve dokuz 1.5mL ön etiketli Eppendorf tüpleri (100 mcL her tüp) askıya hücreleri bölmek.
    1. Aşağıdaki tabloya göre ayarlayın tek renk boyama karışımları:
       DİKKAT: leke izotip kontrol antikorların nihai konsantrasyonu, onlar için kontrol birincil antikor uymalıdır . Örneğin, anti-Sca-1 1 μg/10 ⁶ hücreleri için kullanılan, ilgili izotip aynı konsantrasyonda olması gerekir.
       

       Tüp #	Tüp Adı	Şirket	Kedi #	klon	izotip	seyreltme
       1	Sigara-boya
       2	Hoechst33342	sigma	B2261			2-5ug/ml
       3	PI	sigma	P4864			1ug/ml
       4	CD31-FITC CD45-FITC	ebioscience	11-0311-85	390	Rat IgG2a	500
       		House yapımı		I3 / 2	Rat IgG2b	500
       5	SCA1-PECY7	ebioscience	25-5981-82	D7	Rat IgG2a	5000
       6	α-7 APC	House yapımı		R2F2	Rat IgG2b	1000

    2. Izotip kontrol boyama aşağıdaki tabloyu kullanarak karışımları ayarlayın:
       

       Tüp #	Isim tüp	Hoechst	PI	CD31- FITC	CD45- FITC	Scal- PE-CY7	a-7- APC	Rat- IgG2b- APC	Rat- IgG2a- pecy7	Rat- IgG2a- FITC	Rat- IgG2b- FITC
       7	Izo CD31 / CD45	+	+	-	-	+	+	-	-	+	+
       8	Izo Scal- pecy7	+	+	+	+	-	+	-	+	-	-
       9	Izo α-7 APC	+	+	+	+	+	-	+	-	-	-

    3. Adım 20 uygun Eppendorf tüpe pipetleyin, tek renk ve izotop kontrol boyama karışımları (genellikle 5 ila 10 mcL karışımı boyama her numune eklenir böylece antikor konsantrasyonunu ayarlamak). İyice karıştırın ve 1 saat süreyle buz üzerinde kuluçkaya yatmaktadır.
21. FACS hücre sıralama için antikor kokteyli 800μL (aşağıda) ile örnek fare hücreleri Leke. İyice karıştırın ve 1 saat süreyle buz üzerinde kuluçkaya yatmaktadır.
    Antikor kokteyli: Hoechst, PI, CD31-FITC, CD45-FITC, SCA-1-PECY7, α-7 APC
    DİKKAT: partiler arasında önemli farklılıklar var, bireysel olarak her bir antikor titre hücrelerine antikor optimal oranı tespit edilmelidir . Kullanılmak üzere antikor optimal miktarı 10 ⁶ başına hedef hücreleri antikor μgs ifade ve aynı parti antikor kullanarak sabit tutulmalıdır. Açıkçası, hedef hücrelerin sayısı deneyler arasında önemli bir değişiklik yoksa, ya da boyama hacmi hücre sayısı ile ölçekli ise, her antikor sabit bir seyreltme de kullanılabilir.
22. Yıkama: 9 kontrol tüpleri her FACS tampon yaklaşık 1 ml ekleyin; örnek tüp FACS tampon yaklaşık 20ml ekleyin.
23. 5 dakika Eppendorf tüpleri @ 3000rpm (: 5417C Eppendorf masa üstü santrifüj, Model) santrifüjleyin. Örnek tüp @ 1600rpm (: 5810R Eppendorf masa üstü santrifüj, Model) 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
24. Aspire ve tüm tüpleri süpernatant atın.
25. FACS tampon (kontrollerin her biri için 1 ml, sıralama örnek 4ml) yeniden süspanse hücreleri, FACS tüpler "hücre süzgeç kapağı ile (BD Falcon kedi 352.235, gözenek boyutu 40μm) pipetlenir hücreleri olabilir kalan kümeleri kaldırmak için sitometresinin etkileyebilir.
26. Tek renk denetimleri ve izotipi kontrolleri ile FACS Sıralayıcısı ayarlayın.
27. 3.5 mL toplama tampon (% 95,% 5 DMEM FBS) ayrı ayrı aşağıdaki tabloda göre sıralanmış hücreleri toplayın. Normalde, her iki arka bacaklarda hasat, bir tek yabani tip fare prosedürün sonunda FACS lisansüstü sıralanmış hücreleri tarafından değerlendirilecek% 95 üstünde canlılığı ile 150.000 miyojenik progenitör hücreleri veya 100.000 adipogenic progenitör hücreler, (Şekil 1 hakkında getirebilimektedir )
    Yüzey boyama dayalı miyojenik ve adipogenic atalarıdır tanımı
    

    Antikor / leke	Miyojenik progenitör (MP)	Adipogenic progenitör (AP)
    Hoechst	+	+
    PI	-	-
    CD31-FITC	-	-
    CD45-FITC	-	-
    SCA1-PECY7	-	+
    α-7 APC	+	-

4. Nakli:

28. @ 1500rpm 5 dakika otoklava Eppendorf tüpleri (1,5 ml), süpernatant ve transfer hücreleri çıkarmak sıralanmış hücreler santrifüj, @ 3000rpm santrifüj 5 dakika sonra, steril PBS (serum serbest!) 500 mcL hücreleri durulayın. Steril koşullar tüm reaktifler bakımı ve doku kültürü kaputu çalışan, yaklaşık 10 ⁶ hücre / ml PBS içinde miyojenik progenitörlerle veya Matrigel adipogenic progenitör (BD kedi # 354.234) tekrar süspansiyon haline getirin.
29. Miyojenik atalarıdır veya alıcı farelere adipogenic progenitör nakli.
    1. Isoflouran kurumunuzun politikasına göre fare uyuşturan.
    2. Enjeksiyon bölgesi etrafında saç Tıraş, daha sonra% 70 etanol ile ovularak cilt sterilize
    3. 3 / 10 CC insülin enjektörü ile miyojenik atalarıdır veya adipogenic atalarıdır (= 20k hücreleri) 20μL (BD kedi # 309.300) enjekte edilir.
30. Uygun bir süre sonra (üç hafta iyi çalışır, ancak donör elde edilen transgenik belirteçlerinin ifade myofibers sonra bir hafta içinde nakli genellikle belirgindir), (Sigma Kedi # T04840-2, 400 mcL Avertin intraperitoneal adım 29 alıcı fareler uyuşturan 25 mg / ml), daha sonra 15 mL% 4 PFA tarafından takip 50ml PBS (10 mcM EDTA içeren), transcardially serpmek. Gerekirse bir gecede% 20 sakaroz transfer, sonra bir gecede% 4 PFA ile hedef doku, post-fix toplayın. OCT, dondurma ve cryosection Embed.

5. Temsilcisi Sonuçlar:

MP fare iskelet kas içine nakledilen zaman, onlar hemen öncesi mevcut myofibers ile kaynaşıyor. Bu nedenle donör hücreleri genetik etiket varsa onları alınan lifler kolayca tanınabilir olacaktır. Şekil 2 nakledilen hücreler, insan alkalin phostphatase ifade histokimyasal ortaya bir örnek gösterir.

AP nakledilen sonucu nakli sitenin çevreye son derece bağlıdır: subkutan bu hücreler (bkz. Şekil 2) adipositlerde ve miyofibroblastlar kökenleri vermek nakledilen zaman. Yağlı dejenerasyon ³ olusup sürece kas dahil pek çok diğer siteler, hayatta yok.

Şekil 1. Iskelet kası progenitör popülasyonlarının izolasyonu için strateji Sıralama (A) Sıralama strateji: Canlı hücreler, forward scatter ve yan dağılım dayalı tespit edildi . Hoechst boyama ölü hücreleri hariç anuclear enkaz ve propidium iyodür (PI) boyama dışlamak için kullanıldı. Hematopoetik (CD45) ve endotelyal (CD31) hücreleri sıralama kapıları çıkarıldı. Α7 ⁺ Hoechst ^{+ PI-CD45 -} CD31 ^- scal ^- alt kümesi tüm miyojenik atalarıdır (MP) içerir. Scal ⁺ Hoechst ^{+ PI-CD45 -} CD31 ^- α7 ^- Nüfus adipogenic atalarıdır (AP) içerir. (B) Floresan-eksi-one (FMO) izotip kontrolleri leke özgüllüğü onaylayın. (C) Saflık sıralama sonra MP ve AP altkümelerini denetler.

Şekil 2. MP ve AP nakli AP Temsilcisi sonuçları subkutan nakledilen (üst panel) ve MP intramüsküler (alt panel). Her iki durumda da, donör hücreleri kahverengi lekelere tarafından tespit edilen transgenik insan alkalen fosfataz ifade eden bir fare, kaynaklanmıştır.

Tartışmalar

Bu protokolün amacı, yüksek verim ve yüksek saflaştırılmış hücrelerinin canlılığı arasında makul bir denge. Sağlıklı hücreleri kurtarıldı olduğunu sağlanmasında en önemli adım, tahmin edilebileceği gibi, başlangıç ​​doku enzimatik ayrılma. Doku taşıma göstermek ya da görsel-işitsel bir formatta bile takdir etmek zordur, özellikle nazik olmalıdır. Bir diğer önemli faktör, prosedürün uzunluğu. Uzun bu nedenle düşük canlılığı ve engraftman verimliliği donörden alıcı hayvan gitmek için alır. PI sıralama sonra saflaştırılmış hücre örneklerinde pozitif olay sıklığı bakarak hemen cevap değildir canlılığı ile ilgili herhangi bir soru olmalı mıdır, biz clonogenicity ölçmek için bir sınırlayıcı seyreltme tahlil ³ yapılır öneririz. Hasarsız kas tipik bir türlü rutin in vitro miyojenik veya fibrotik / adipogenic koloniler başlatma yeteneğine sahip 15-20 hücreleri yaklaşık 1 verim. Milletvekilleri başlatılan kolonilerin aslında% 100 farklılaştırılmış myotubes içerirken, FAPS elde edilen koloniler, sadece yaklaşık üçte biri, düz kas aktini pozitif miyofibroblastlar ek adipositler içerir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifin Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Kollajenaz II.	Sigma-Aldrich	C-6885,	500 u / ml
Kollajenaz D	Roche	11088882001	1.5 u / ml
II çekilin	Roche	04942078001	2.4 u / ml
hücre süzgecinden	BD	352340	40 mikron
Tüp hücre süzgecinden	BD	352235	40 mikron
Hoechst33342	Sigma-Aldrich	B2261	2-5 ug / ml
CD31-FITC	Ebiosciences	11-0311-85	Klon 390
CD45-FITC	Ev yapımı		Klon I3 / 2
SCA1-PECY7	Ebiosciences	25-5981-82	Klon D7
α-7 integrin APC	Ev yapımı	Rossi laboratuar ile Inquire	R2F2