Очистка прародителей из скелетных мышц

Резюме

Метод ферментативной диссоциации, маркировка поверхности и очистки с помощью проточной цитометрии фиброзно / адипогенной и миогенной прародителей из мышиных скелетных мышцах.

Аннотация

Скелетная мышца состоит из нескольких популяций предшественников различных эмбрионального происхождения и потенциала развития. Миогенный прародителей, как правило, проживающих в "спутниковые позиции ячейки" между мембраной myofiber плазмы и ламинин богатых базальной мембраны, что ensheaths это, говорят сами за себя обновление клеток, которые являются исключительно привержены миогенной ^1,2 линии. Мы недавно описал второго класса судна связанные прародителей, которые могут генерировать миофибробластов и белых адипоцитов, который реагирует на повреждения за счет эффективного ввода пролиферацию и обеспечивает трофическую поддержку миогенной клеток в процессе регенерации тканей ^3,4. Один из самых надежных тестов, чтобы определить области развития и регенеративный потенциал данной популяции клеток зависит от их изоляции и трансплантации ^5-7. С этой целью мы оптимизировали протоколов для их очистки с помощью проточной цитометрии из ферментативно диссоциированных мышцы, которые мы будем наброски в этой статье. Популяций полученные с помощью этого метода будет содержать либо миогенной или фиброзно / адипогенной колониеобразующих клеток: никаких других типов клеток, которые способны расширять в пробирке или выживания в естественных условиях доставки. Однако, когда эти группы населения используются сразу после сортировки для молекулярного анализа (например, QRT-PCR) необходимо иметь в виду, что только что сортируются подмножества может содержать и другие загрязнения клетки, которые не имеют возможности формирования колоний или прививка получателей.

протокол

1. Ткани коллекции:

1. Используйте мышей от 7 до 12 недель. Обычно, по крайней мере двух животных используются: одна заключается в создании FACS одноцветных контроля, необходимых для компенсации и для флуоресцентных-минус один образцы изотипа контроля. Другой действительного образца для сортировки.
2. Усыпить мышей CO ₂ ингаляции или в соответствии с протоколом этики выбора. Место мышей на бумажное полотенце, лицом вверх, и спрей с 70% этанола тщательно, чтобы предотвратить загрязнение с помощью мыши меха.
3. Поднимите кожи в области живота щипцами, а затем сделать небольшой продольный разрез с острыми ножницами.
4. Пил двух створок кожи в противоположных направлениях (вверх и вниз), чтобы полностью разоблачить задних мышц конечностей под ними.
5. Акцизный мышечной ткани, вставив и расширение ножницы по обеим сторонам голени.
6. Повторите тот же процесс для бедренной кости для извлечения мышечной ткани.
7. Поместите все вырезали мышечной ткани в 60 мм чашках Петри, используя одно блюдо для ткани от каждой мыши.
8. Повторите выше для всех мышей.

2. Диссоциируют ткани в отдельных клеток от ферментативного пищеварения:

В этой части протокола, используйте стерильные реактивы и инструменты и работать в стерильных условиях.

9. Добавить 2 мл коллагеназы II (Sigma, кошка # 6885, 500U / мл) и 20 мкл 250 мм CaCl ₂ акции каждый Петри-блюдо.
10. Слеза мышечную ткань на мелкие кусочки (около 1 мм ³⁾ с двумя щипцами (один зубчатые, одна с 2 зуба, от изобразительных инструментов науки, кот # 11051-10, 11154-10), обращая внимание на удалить и уничтожить столько загрязненных не-мышечной ткани, как это возможно.
11. Обложка чашках Петри и инкубировать их на 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
12. Получить чашках Петри и использовать 3 мл шприца тщательно пюре ткани штук. Используйте один поршень для каждого образца, чтобы избежать загрязнения.
13. Добавьте немного (~ 5 мл) стерильной холодном PBS каждому Петри блюдо и передачи ткани шлама в 50 мл трубки Falcon (полоскание Петри блюдо, если необходимо, чтобы восстановить все ткани)
14. Встряхните трубки Сокол энергично, заполнить трубу с PBS, центрифуга @ 800rpm х 5 минут (Эппендорфа Настольная модель: 5810R), и аспирата супернатант (повторите 3 раза)
15. Добавить 1 мл смеси Коллагеназа D (Roche, Cat # 11088882001, 1,5 U / мл) / Dispase II (Roche, Cat #: 04942078001, 2.4u / мл) и 10 мкл из CaCl ₂ (250 мм) в каждую пробирку, инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия с вращением в течение одного часа.
16. Добавить 5-10 мл холодной, стерильные PBS, вихря и пипеткой тщательно гомогенизации ткани.
17. Заполнение трубы с PBS и хорошо перемешать.
18. Передача жидкости 40 мкм сито ячейка помещается в верхней части трубки 50 мл Сокол, чтобы отфильтровать оставшиеся крупные куски ткани. Разделите каждый образец равномерно на три 50 мл пробирки Falcon. Заполнение каждой из труб с PBS затем центрифуги @ 1600rpm в течение 5 минут на 8 градусов по Цельсию.
19. Удалите супернатант и сбора клеток для окрашивания.

3. Окрашивание антител и сортировка:

В этой части протокола, используйте стерильные FACS и сбор буферов и работать в стерильных условиях. Коммерческая антител, как правило, считается стерильным, если надлежащим образом.

20. Для одного цвета и образцы изотипа контроля, ресуспендируют образца в 1 мл буфера FACS и разделить приостановлено клетки в девяти 1,5 мл предварительно помечены труб Эппендорф (100 мкл каждой трубки).
    1. Настройка одного цвета окраски смеси в соответствии со следующей таблицей:
       ВНИМАНИЕ: конечная концентрация антител изотипа контроля в пятно должно совпадать с первичными антителами их управления. Например, если анти-ССС-1 используется для 1 μg/10 ^{6 ячеек,} соответствующий изотипа должны использоваться в той же концентрации.
       

       Труба #	Название трубки	Компания	Cat #	клон	изотипа	разбавление
       1	Номера для окраски
       2	Hoechst33342	сигма	B2261			2-5ug/ml
       3	П. И.	сигма	P4864			1ug/ml
       4	CD31-FITC CD45-FITC	ebioscience	11-0311-85	390	Крыса IgG2a	500
       		Дома сделаны		I3 / 2	Крыса IgG2b	500
       5	SCA1-PECY7	ebioscience	25-5981-82	D7	Крыса IgG2a	5000
       6	α-7 APC	Дома сделаны		R2F2	Крыса IgG2b	1000

    2. Настройка изотипа контроль окрашивания смесей с помощью следующей таблицы:
       

       Труба #	Имя труб	Hoechst	П. И.	CD31- FITC	CD45- FITC	SCAL- PE-CY7	-7- APC	Крыса- IgG2b- APC	Крыса- IgG2a- pecy7	Крыса- IgG2a- FITC	Крыса- IgG2b- FITC
       7	Iso- CD31 / CD45	+	+	-	-	+	+	-	-	+	+
       8	Iso- SCAL- pecy7	+	+	+	+	-	+	-	+	-	-
       9	Iso- α-7-APC	+	+	+	+	+	-	+	-	-	-

    3. Внесите один элемент управления цветом и изотопного окрашивания смесей (мы обычно регулировать концентрацию антител, так что от 5 до 10 мкл окрашивании смесь добавляются к каждому образцу) в соответствующие трубки Эппендорф с шага 20. Хорошо перемешать и инкубировать на льду в течение 1 часа.
21. Пятно клетки от образца мышь с 800μL антитела коктейль (см. ниже) для сортировки ячейки СУИМ. Хорошо перемешать и инкубировать на льду в течение 1 часа.
    Антитела коктейль: Hoechst, PI, CD31-FITC, CD45-FITC, SCA1-PECY7, α-7 APC
    ВНИМАНИЕ: оптимальное соотношение антител к клеткам должна определяться индивидуально титрования каждого антитела, так как значительные различия могут существовать между партиями. Оптимальное количество антител, которые будут использоваться должны быть выражены в μgs антител на 10 ⁶ клеток-мишеней и поддерживается постоянным при использовании той же самой партии антител. Ясно, что если число клеток-мишеней существенно не изменяется между экспериментами, или, если окрашивание объема масштабируется с числом клеток, фиксированных разбавления каждого антитела также могут быть использованы.
22. Вымойте: Добавить примерно 1 мл FACS буфера для каждого из 9 труб контроля; добавить около 20 мл буфера FACS в пробирку.
23. Центрифуга Eppendorf труб @ 3000rpm в течение 5 минут (Эппендорфа настольной центрифуге, Модель: 5417C). Центрифуга пробирку @ 1600rpm в течение 5 минут (Эппендорфа настольного центрифуг, модель: 5810R).
24. Аспирацию и отбросить супернатант из всех труб.
25. Ресуспендируют клеток в буфер FACS (1 мл для каждого из элементов управления, 4 мл для сортировки выборки), пипетки клеток в "трубах FACS" через ячейки сетчатого фильтра крышку (кошки BD Сокол # 352235, размер пор 40 мкм), чтобы удалить оставшиеся сгустки, которые могут влияют цитометр.
26. Настройка сортировщика FACS с одним управления цветом и изотип управления.
27. Сбор сортируются клетки в соответствии со следующей таблицей в 3,5 буфера коллекции мл (95% DMEM, 5% ЭТС) по отдельности. Как правило, при уборке обе задние конечности, один дикий тип мыши может принести около 150000 миогенной клеток-предшественников или 100000 адипогенной клеток-предшественников, с жизнеспособность выше 95%, если судить по reanalyzing отсортированных клеток FACS в конце процедуры (рис. 1 )
    Определение миогенной и адипогенной прародителей на поверхностных окрашивание
    

    Антитела / пятно	Миогенный предшественников (МП)	Адипогенной предшественников (AP)
    Hoechst	+	+
    П. И.	-	-
    CD31-FITC	-	-
    CD45-FITC	-	-
    SCA1-PECY7	-	+
    α-7 APC	+	-

4. Пересадка:

28. Центрифуга отсортированные клетки @ 1500rpm в течение 5 минут, удалить супернатант и передачи клеткам автоклавного Эппендорф труб (1,5 мл), промыть клетки с 500 мкл стерильной PBS (без сыворотки!), То центрифуги @ 3000rpm в течение 5 минут. Поддержание всех реагентов в стерильных условиях и работающих в капот культуре тканей, ресуспендируют миогенной прародителей в ФСБ, или адипогенной предшественников в Матригель (BD кошка # 354234) примерно 10 ^{6 кл} / мл.
29. Пересадка миогенной прародителей или адипогенной предшественников получателю мышей.
    1. Анестезировать мышь с isoflouran в соответствии с вашим учреждением политики.
    2. Бритье волос вокруг области инъекции, затем стерилизовать кожу путем втирания с 70% этанола
    3. Inject 20 мкл миогенной прародителей или адипогенной прародителей (= 20к клетки) с использованием 3 / 10 CC инсулиновый шприц (BD кошка # 309300).
30. После соответствующего времени (три недели работает хорошо, но мышечные волокна выражения доноров полученных трансгенных маркеров обычно очевидны в течение одной недели после трансплантации), анестезировать получателя мышей с шага 29 на введении препарата в 400 мкл Avertin (Sigma Cat # T04840-2, 25 мг / мл), затем заливать transcardially с 50 мл PBS (содержит 10 мкМ ЭДТА) первым, а затем 15 мл 4% PFA. Сбор ткани-мишени, после исправления с 4% PFA на ночь, если требуется, а затем перенести до 20% сахарозы в одночасье. Добавить в октябре, заморозить и cryosection.

5. Представитель Результаты:

Когда депутат пересаживают в скелетных мышцах мышей, они с готовностью предохранитель с уже существующими мышечные волокна. Поэтому любые генетические этикетке присутствует в донорских клеток можно будет легко обнаружить в волокна, которые их получили. На рисунке 2 показан пример, когда пересаженные клетки человека выразил щелочной phostphatase, показал гистохимически.

Когда AP пересаживают результат очень сильно зависит от среды сайта трансплантации: при трансплантации этих клеток подкожно дать происхождение адипоциты и миофибробластов (см. рисунок 2). Во многих других сайтов, включая мышцы, они не выживет, если жировая дистрофия была индуцированных ^3.

Рисунок 1. Сортировка стратегии изоляции населения от предшественников скелетных мышцах () Сортировка стратегии:. Жизнеспособные клетки были определены на основе рассеяния вперед и боковые разброс. Hoechst окрашивания был использован, чтобы исключить безъядерные мусора и пропидий йодида (PI) окрашивание для исключения мертвых клеток. Гемопоэтических (CD45) и эндотелиальных (CD31) клеток были исключены из сортировки ворота. Α7 ⁺ Hoechst ⁺ PI ^- CD45 ^- CD31 ^- SCAL ^- подмножество содержит все миогенной прародителей (МП). SCAL ⁺ Hoechst ⁺ PI ^- CD45 ^- CD31 ^- α7 ^- популяция содержит адипогенной прародителей (AP). (B) Флуоресценция-минус один (FMO) контролирует изотипа подтверждения специфичности пятно. (C) Чистота проверки МП и А. П. подмножества после сортировки.

Рисунок 2. Представитель результаты следующие MP и AP трансплантации. AP были пересажены подкожно (верхняя панель) и депутат внутримышечно (нижняя панель). В обоих случаях донорские клетки происходит от выражения трансгенные мыши человека щелочной фосфатазы, выявленные коричневого окрашивания.

Обсуждение

Целью этого протокола является разумный баланс между высокой урожайностью и высокой жизнеспособности очищенные клетки. Наиболее важным шагом в обеспечении того, чтобы здоровые клетки восстанавливаются является, как ожидается, ферментативной диссоциации начиная ткани. Обработка ткани должны быть особенно нежными, которое трудно доказать или оценить даже в аудиовизуальном формате. Другим ключевым фактором является длина процедуры. Больше времени требуется, чтобы перейти от донора до реципиента животное, тем ниже жизнеспособность и поэтому приживления эффективности. В случае возникновения вопроса о жизнеспособности, что не сразу ответил, глядя на частоте П. И. положительным событием в очищенных образцов ячейки после сортировки, мы полагаем, что анализ предельного разбавления для измерения clonogenicity осуществляется ^3. Типичные виды из неповрежденной мышцы обычно выход у 1 из 15-20 клеток, способных инициировать миогенной или фиброзно / адипогенной колоний в пробирке. Хотя по существу, 100% от колонии инициированы депутатами содержат дифференцированные myotubes, только около одной трети колоний получены из ФАП содержат жировых клеток в дополнение к гладкой мускулатуре актина положительные миофибробластов.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
Коллагеназы II	Sigma-Aldrich	C-6885,	500 ед / мл
Коллагеназа D	Roche	11088882001	1,5 Ед / мл
Свернуть II	Roche	04942078001	2,4 Ед / мл
ячейки фильтра	BD	352340	40 мкм
Труба с сотовыми фильтр	BD	352235	40 мкм
Hoechst33342	Sigma-Aldrich	B2261	2-5 мкг / мл
CD31-FITC	Ebiosciences	11-0311-85	Клон 390
CD45-FITC	Домашний		Клон I3 / 2
SCA1-PECY7	Ebiosciences	25-5981-82	Клон D7
α-7 интегрин APC	Домашний	Запрос с Росси лаборатории	R2F2