Reinigung von Vorläufern aus Skelettmuskeln

Zusammenfassung

Verfahren zur enzymatischen Dissoziation Oberfläche Kennzeichnung und Reinigung mittels Durchflusszytometrie von fibro / adipogene und myogenen Vorläuferzellen aus murinen Skelettmuskel.

Zusammenfassung

Skelettmuskulatur enthält mehrere Vorläuferzellen Populationen unterschiedlicher embryonaler Herkunft und Entwicklungspotenzial. Myogenen Vorläuferzellen, in der Regel mit Wohnsitz in einem "Satelliten-Zell-Position" zwischen den myofiber Plasmamembran und der Laminin-rich Basalmembran, dass ensheaths es sind selbst erneuernden Zellen, die sich ausschließlich auf die myogenen Linie ^1,2 begangen werden. Wir haben kürzlich eine zweite Klasse des Schiffes verbundenen Vorläuferzellen, die Myofibroblasten und weiße Fettzellen, die durch die effiziente Eingabe Proliferation Schäden reagiert und bietet trophische Unterstützung myogenen Zellen während der Geweberegeneration ^3,4 erzeugen kann beschrieben. Eines der am meisten vertraut Assays auf die Entwicklungs-und regenerative Potential einer gegebenen Zellpopulation bestimmen stützt sich auf ihre Isolation und Transplantation ^5-7. Zu diesem Zweck haben wir Protokolle für deren Reinigung mittels Durchflusszytometrie aus enzymatisch gespalten Muskeln, die wir in diesem Artikel skizziert werden optimiert. Die Bevölkerung erhält mit dieser Methode enthält entweder myogene oder fibro / adipogenen Kolonie-bildenden Zellen: keine andere Zelltypen sind in der Lage die Expansion in vitro oder in vivo überleben Lieferung. Wenn jedoch diese Populationen unmittelbar nach der Art der molekularen Analyse (zB qRT-PCR) eine im Auge behalten müssen, dass die frisch sortiert Teilmengen können andere Schadstoffe Zellen, die die Fähigkeit zur Bildung von Kolonien oder Pfropfung Empfänger Mangel enthalten, verwendet.

Protokoll

1. Tissue Collection:

1. Verwenden Mäusen zwischen 7 und 12 Wochen alt. In der Regel werden mindestens zwei Tiere verwendet: Die eine ist die Einrichtung der FACS einfarbige Kontrollen für Entschädigung und für die Fluoreszenz-minus-eins Isotypkontrolle Proben erforderlich. Die andere ist die eigentliche Probe für die Sortierung.
2. Euthanize die Mäuse durch CO _2-Inhalation oder nach einer Ethik-Protokoll der Wahl. Legen Mäuse auf einem Papiertuch, nach oben und Spray mit 70% Ethanol gründlich, um eine Kontamination mit der Maus Fell zu verhindern.
3. Heben Sie die Haut in der Bauchregion mit einer Pinzette, dann machen Sie einen kleinen Längsschnitt mit einer scharfen Schere.
4. Peel die beiden Hautlappen in entgegengesetzte Richtungen (oben und unten) vollständig aussetzen Hinterbein darunter liegenden Muskeln.
5. Excise das Muskelgewebe durch das Einfügen und Erweiterung der Schere an beiden Seiten der Tibia.
6. Wiederholen Sie diesen Vorgang für den Oberschenkelknochen, um das Muskelgewebe zu extrahieren.
7. Legen Sie alle herausgeschnitten Muskelgewebe in 60mm Petrischalen, mit einer Schale für das Gewebe von jeder Maus.
8. Wiederholen Sie die oben für alle Mäuse.

2. Distanzieren Tissue in einzelne Zellen durch enzymatische Verdauung:

In diesem Abschnitt des Protokolls, verwenden Sie sterile Reagenzien und Instrumente und Arbeiten unter sterilen Bedingungen.

9. Geben Sie 2 ml Collagenase II (Sigma, Kat. Nr. 6885, 500U / ml) und 20 ul von 250mm CaCl ₂ Lager zu jedem Petri-Schale.
10. Reißen Sie das Muskelgewebe in kleine Stücke (ca. 1 mm ³⁾ mit zwei Pinzetten (eine gezackte, eins mit 2 Zähnen, von Fine Science Tools, cat # 11051-10, 11154-10), aufmerksam zu entfernen und zu entsorgen, wie viel kontaminiertes Nicht-Muskelgewebe wie möglich.
11. Decken Sie die Petrischalen und inkubieren sie bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten.
12. Rufen Sie die Petri-Schalen und ein 3-ml-Spritze Kolben gründlich Maische die Gewebestücke. Verwenden Sie einen Stempel für jede Probe, um Kontaminationen zu vermeiden.
13. Fügen Sie einige (~ 5 ml) sterilen kalten PBS zu jeder Petrischale und Transfer des Gewebes Schlamm in einen 50 mL Falcon-Röhrchen (spülen Sie die Petri-Schale bei Bedarf alle Gewebe zu erholen)
14. Shake the Falcon Röhrchen kräftig, füllen Sie das Röhrchen mit PBS, Zentrifuge @ 800rpm x 5 Minuten (Eppendorf Tischgerät Modell: 5810R), und saugen Sie den Überstand (3 Mal wiederholen)
15. 1ml Mischung von Collagenase D (Roche, Kat. Nr. 11088882001, 1,5 HE / ml) / Dispase II (Roche, Kat. Nr.: 04942078001, 2.4u / ml) und 10 &mgr; l von CaCl ₂ (250mm) in jedes Röhrchen, bei 37 Grad Celsius mit Rotation für eine Stunde.
16. Fügen Sie 5-10 ml kalte, sterile PBS, Wirbel und Pipette gründlich, um das Gewebe zu homogenisieren.
17. Füllen Sie Rohre mit PBS und gut mischen.
18. Übertragen Sie die Flüssigkeit in einen 40 um Zellsieb auf einem 50 mL Falcon-Röhrchen platziert, um herauszufiltern, die übrigen große Stücke von Gewebe. Teilen Sie jede Probe gleichmäßig in drei 50 mL Falcon-Röhrchen. Füllen Sie jedes der Röhrchen mit PBS zentrifugieren @ 1600rpm für 5 Minuten bei 8 Grad Celsius.
19. Überstand verwerfen und sammeln Zellen für die Färbung.

3. Antikörper-Färbung und Sortierung:

In diesem Abschnitt des Protokolls, mit sterilen FACS und Sammlung Puffer und Arbeit unter sterilen Bedingungen. Kommerzielle Antikörper sind in der Regel als steril, wenn sie richtig gehandhabt.

20. Für einzelne Farb-und Isotyp-Kontroll-Proben, resuspendieren der Probe in 1 ml FACS-Puffer und teilen die suspendierten Zellen in neun 1,5 ml pre-markierten Eppendorf-Röhrchen (100 ul pro Röhre).
    1. Richten Sie einfarbige Färbung mischt nach der folgenden Tabelle:
       ACHTUNG: Die endgültige Konzentration von Isotyp-Kontroll-Antikörper in der Fleck sollte, dass der primäre Antikörper sind sie die Kontrolle für übereinstimmen. Zum Beispiel, wenn anti-Sca-1 für 1 μg/10 ⁶ Zellen verwendet wird, muss der entsprechende Isotyp in der gleichen Konzentration eingesetzt werden.
       

       Tube #	Name der Röhre	Firma	Cat #	Klon	Isotyp	Verdünnung
       1	Non-Fleck
       2	Hoechst33342	sigma	B2261			2-5ug/ml
       3	PI	sigma	P4864			1ug/ml
       4	CD31-FITC CD45-FITC	eBioscience	11-0311-85	390	Rat IgG2a	500
       		Haus gemacht		I3 / 2	Rat IgG2b	500
       5	SCA1-PECY7	eBioscience	25-5981-82	D7	Rat IgG2a	5000
       6	α-7 APC	Haus gemacht		R2F2	Rat IgG2b	1000

    2. Set up Isotypkontrolle Färbung mischt anhand der folgenden Tabelle:
       

       Tube #	Name von Rohr	Hoechst	PI	CD31- FITC	CD45- FITC	Sca- PE-CY7	A-7- APC	Rat- IgG2b- APC	Rat- IgG2a- pecy7	Rat- IgG2a- FITC	Rat- IgG2b- FITC
       7	Iso- CD31 / CD45	+	+	-	-	+	+	-	-	+	+
       8	Iso- Sca- pecy7	+	+	+	+	-	+	-	+	-	-
       9	Iso- α-7-APC	+	+	+	+	+	-	+	-	-	-

    3. Pipettieren der einzelnen Farb-und Isotopen-Kontrollfärbung mischt (wir normalerweise passen Sie die Konzentration von Antikörpern, so dass zwischen 5 und 10 l Färbung Mix zu jeder Probe hinzugefügt werden) in die entsprechenden Eppendorf-Röhrchen aus Schritt 20. Gut mischen und auf Eis inkubieren für 1 Stunde.
21. Stain Zellen von Probe-Maus mit 800μL der Antikörper-Cocktail (unten) für FACS cell sorting. Gut mischen und auf Eis inkubieren für 1 Stunde.
    Antikörper-Cocktail: Hoechst, PI, CD31-FITC, CD45-FITC, SCA1-PECY7, α-7 APC
    ACHTUNG: Das optimale Verhältnis von Antikörpern gegen Zellen müssen durch individuelle Titration jeder Antikörper, da erhebliche Unterschiede zwischen den Chargen gibt bestimmt werden kann. Die optimale Menge an Antikörper verwendet werden sollte in μgs Antikörper pro 10 ⁶ Target-Zellen exprimiert und konstant gehalten werden, wenn mit der gleichen Charge des Antikörpers. Klar, wenn die Zahl der Zielzellen nicht signifikant ändert zwischen den Experimenten, oder wenn die Färbung Band mit der Anzahl der Zellen skaliert wird, eine feste Verdünnung von jeder Antikörper können ebenfalls verwendet werden.
22. Wash: In ca. 1 ml FACS-Puffer zu jedem der 9 Röhren, fügen Sie etwa 20 mL FACS-Puffer, um das Probenröhrchen.
23. Zentrifugieren Sie die Eppendorf-Röhrchen @ 3000rpm für 5 Minuten (Eppendorf Tischzentrifuge, Modell: 5417C). Centrifuge das Probenröhrchen @ 1600rpm für 5 Minuten (Eppendorf Tischzentrifuge, Modell: 5810R).
24. Absaugen und den Überstand verwerfen aus allen Rohren.
25. Die Zellen in der FACS-Puffer (1 ml für jede der Steuerungen, 4ml für die Sortierung Probe), um Pipette Zellen in "FACS-Röhrchen" durch die Zelle Sieb Kappe (BD Falcon cat # 352235, 40 um Porengröße) zu entfernen restlichen Klumpen, kann Einfluss auf die Durchflusszytometer.
26. Richten Sie die FACS-Sorter mit einfarbigem Kontrollen und Isotypkontrollen.
27. Sammeln sortierten Zellen nach der folgenden Tabelle in einer 3,5-ml-Collection-Puffer (95% DMEM, 5% FBS) getrennt. Normalerweise, wenn die Ernte beide Hinterbeine, könnte ein einzelner Wildtyp-Maus ungefähr 150.000 myogenen Vorläuferzellen oder 100.000 adipogenen Vorläuferzellen, die Lebensfähigkeit von über 95%, wie von reanalyzing sortierten Zellen durch FACS gemessen am Ende des Verfahrens (Abbildung 1 Ertrag )
    Definition von myogenen und adipogenen Vorfahren auf Oberflächenbeschmutzung Basis
    

    Antikörper / Fleck	Myogenen Vorläuferzellen (MP)	Adipogene Vorläuferzellen (AP)
    Hoechst	+	+
    PI	-	-
    CD31-FITC	-	-
    CD45-FITC	-	-
    SCA1-PECY7	-	+
    α-7 APC	+	-

4. Transplantation:

28. Centrifuge sortierten Zellen @ 1500rpm für 5 Minuten, entfernen Sie den Überstand und Transfer Zellen autoklaviert Eppendorf-Röhrchen (1,5 ml), spülen Zellen mit 500 ul sterilem PBS (Serum-freien!), Dann Zentrifuge @ 3000rpm für 5 Minuten. Unter Beibehaltung aller Reagenzien unter sterilen Bedingungen und Arbeiten in einer Gewebekultur Kapuze, resuspendieren myogenen Vorläuferzellen in PBS oder adipogenen Vorläuferzellen in Matrigel (BD cat # 354234) bei ca. 10 ⁶ Zellen / ml.
29. Transplant myogenen Vorläuferzellen oder adipogenen Vorläuferzellen zu Empfängermäuse.
    1. Betäuben die Maus mit isoflouran nach Ihrer Institution Politik.
    2. Shave das Haar um die Injektion Region, dann sterilisieren der Haut durch Reiben mit 70% Ethanol
    3. Inject 20 &mgr; l von myogenen Vorläuferzellen oder adipogenen Vorläuferzellen (= 20k-Zellen) mit einem 3 / 10 CC Insulinspritze (BD cat # 309300).
30. Nach einer angemessenen Zeit (3 Wochen funktioniert gut, aber Muskelfasern Ausdruck Spender stammenden transgenen Marker sind in der Regel innerhalb einer Woche nach der Transplantation deutlich), betäuben den Empfänger Mäuse aus Schritt 29 durch intraperitoneale Injektion von 400 ul Avertin (Sigma Cat # T04840-2, 25 mg / mL), dann transkardial perfuse mit 50 ml PBS (enthält 10 uM EDTA) zuerst, gefolgt von 15 ml 4% PFA gefolgt. Sammeln Zielgewebe, post-fix mit 4% PFA über Nacht, wenn erforderlich, dann Transfer bis 20% Saccharose über Nacht. Embed in OCT, Gefrier-und Gefrier.

5. Repräsentative Ergebnisse:

Wenn MP in Maus-Skelettmuskel transplantiert werden, sie leicht mit bereits vorhandenen Muskelfasern verschmelzen. Daher ist jede genetische Label in der Spenderzellen wird leicht erkennbar in den Fasern, die sie erhalten haben. Abbildung 2 zeigt ein Beispiel, wo die transplantierten Zellen exprimierten humanen alkalischen phostphatase zeigte histochemisch.

Wenn AP transplantiert sind das Ergebnis hängt stark von der Umgebung der Transplantation Ort: bei transplantierten subkutan diese Zellen Herkunft geben Adipozyten und Myofibroblasten (siehe Abbildung 2). In vielen anderen Standorten, einschließlich Muskeln, sie nicht überleben, wenn Verfettung hat ³ induziert worden.

Abbildung 1. Sorting-Strategie zur Isolierung von Vorläuferzellen Populationen aus Muskelfleisch (A) Sorting Strategie:. Lebende Zellen wurden auf der Grundlage Vorwärtsstreuung und side scatter identifiziert. Hoechst-Färbung wurde verwendet, um kernlosen Schutt und Propidiumiodid (PI)-Färbung auszuschließen, um tote Zellen auszuschließen. Hämatopoetischen (CD45) und Endothelzellen (CD31)-Zellen wurden aus der Sortierweichen ausgeschlossen. Die α7 ⁺ Hoechst ⁺ PI ^- CD45 ^- CD31 ^- Scal ^- Teilmenge enthält alle myogenen Vorläuferzellen (MP). Die Scal ⁺ Hoechst ⁺ PI ^- CD45 ^- CD31 ^- α7 ^- Bevölkerung enthält adipogenen Vorläuferzellen (AP). (B) Fluoreszenz-minus-eins (FMO) Isotypkontrollen bestätigen die Spezifität der Färbung. (C) Reinheit überprüft der MP-und AP-Teilmengen nach dem Sortieren.

Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse nach MP-und AP-Transplantation. AP wurden subkutan (oberes Feld) transplantiert und MP intramuskulär (unten). In beiden Fällen entstand Spenderzellen aus einer Maus zum Ausdruck transgene menschliche alkalische Phosphatase, durch die braune Färbung identifiziert.

Diskussion

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine vernünftige Balance zwischen hohen Ausbeuten und hoher Rentabilität des gereinigten Zellen zu schlagen. Der wichtigste Schritt bei der Sicherstellung, dass gesunde Zellen gewonnen werden, ist, wie vorherzusehen war, die enzymatische Spaltung des Ausgangsmaterials Gewebe. Die Handhabung des Gewebes sollte besonders schonende, das ist schwer zu beweisen oder zu schätzen, auch in ein audiovisuelles Format. Ein weiterer Schlüsselfaktor ist die Länge des Verfahrens. Je länger es dauert, bis aus dem Spender zum Empfänger Tier gehen, desto geringer die Rentabilität und damit das Anwachsen Effizienz. Sollte es irgendwelche Fragen zu Wirtschaftlichkeit, die nicht sofort, indem man die Häufigkeit der PI positives Ereignis in der gereinigten Zellproben nach der Sortierung beantwortet, empfehlen wir, dass ein Grenzverdünnung Assay clonogenicity Maßnahme ³ durchgeführt wird. Typische Arten aus unbeschädigten Muskel routinemäßig Ertrag etwa 1 in 15-20 Zellen in der Lage zu initiieren myogene oder fibro / adipogenen Kolonien in vitro. Während praktisch 100% der Kolonien von Abgeordneten initiiert differenzierte Myotuben enthalten, enthalten nur etwa ein Drittel der Bienenvölker aus FAPs erhalten Adipozyten neben smooth muscle actin positive Myofibroblasten.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
Collagenase II	Sigma-Aldrich	C-6885,	500 U / ml
Collagenase D	Roche	11088882001	1,5 U / ml
Displace II	Roche	04942078001	2,4 U / ml
Zellsieb	BD	352340	40 mu m
Tube mit Zellsieb	BD	352235	40 mu m
Hoechst33342	Sigma-Aldrich	B2261	2-5 ug / ml
CD31-FITC	Ebiosciences	11-0311-85	Klon 390
CD45-FITC	Hausgemachte		Klon I3 / 2
SCA1-PECY7	Ebiosciences	25-5981-82	Klon D7
α-7-Integrin-APC	Hausgemachte	Erkundigen Sie sich bei Rossi Labor	R2F2