Purificação de Progenitores do músculo esquelético

Resumo

Método para a dissociação enzimática, rotulagem superfície e purificação por citometria de fluxo de fibro / adipogénicos e progenitores miogênica de músculo esquelético murino.

Resumo

Músculo esquelético contém populações progenitoras múltiplas de diferentes origens embrionárias e potencial de desenvolvimento. Progenitores miogênicos, normalmente residente em uma "posição de células satélite" entre a membrana plasmática fibromuscular e da membrana basal laminina-rico que embainha-lo, são auto-renovação de células que é o único comprometido com a linhagem miogênica ^1,2. Descrevemos recentemente uma segunda classe de células progenitoras navio associados que podem gerar miofibroblastos e adipócitos brancos, que responde a danos causados ​​por entrar de forma eficiente a proliferação e fornece suporte tróficos para as células miogênicas durante a regeneração do tecido ^3,4. Um dos ensaios mais confiável para determinar o potencial de desenvolvimento e regeneração de uma população determinada célula depende de seu isolamento e transplante ^5-7. Para este fim temos protocolos otimizados para a sua purificação por citometria de fluxo a partir do músculo enzimaticamente dissociada, que vamos delinear neste artigo. As populações obtidas com este método irá conter células miogênicas colônia ou fibro / adipogénicos formando: não outros tipos de células são capazes de expansão in vitro ou sobrevivendo na entrega vivo. No entanto, quando essas populações são usadas imediatamente após a classificação para a análise molecular (por exemplo qRT-PCR) é preciso ter em mente que os subconjuntos recém-ordenados podem conter outras células contaminante que não têm a capacidade de formar colônias ou enxertando destinatários.

Protocolo

1. Coleta de tecido:

1. Use ratos entre 7 e 12 semanas de idade. Normalmente, pelo menos dois animais são utilizados: um é para configurar o FACS cor única controles necessários para compensação e de fluorescência-menos e uma amostras controle isotipo. A outra é a amostra real para a classificação.
2. Eutanásia os ratos por inalação de CO ₂ ou de acordo com um protocolo de ética de escolha. Camundongos lugar em uma toalha de papel, virada para cima, e pulverize com etanol 70% completamente para evitar a contaminação com a pele do rato.
3. Levante a pele da região abdominal com uma pinça, faça um pequeno corte longitudinal com tesouras afiadas.
4. Descasque as duas abas de pele em sentidos opostos (para cima e para baixo) para expor completamente os músculos dos membros posteriores por baixo.
5. O tecido muscular especiais de consumo, inserindo e ampliando a tesoura ao longo de ambos os lados da tíbia.
6. Repita o mesmo processo para o fêmur para extrair o tecido muscular.
7. Coloque todos os tecidos musculares excisadas em 60 milímetros petri pratos, usando um prato para o tecido de cada rato.
8. Repita o procedimento acima para todos os ratos.

2. Dissociar tecido em células isoladas por digestão enzimática:

Ao longo desta secção do protocolo, o uso de reagentes estéreis e ferramentas de trabalho e em condições estéreis.

9. Adicionar 2 mL de colagenase II (Sigma, cat # 6885, 500U / mL) e 20 mL de CaCl ₂ 250mm de ações para cada placa de Petri.
10. Rasgar o tecido muscular em pedaços pequenos (cerca de 1 mm ³⁾ com duas pinças (uma dentada, um com 2 dentes, a partir de Ferramentas Ciência Fine, cat # 11051-10, 11154-10), prestando atenção ao remover e descartar tanto contaminados não-tecido muscular possível.
11. Cobrir os pratos de Petri e incube-os a 37 graus Celsius por 30 minutos.
12. Recuperar os pratos de Petri e usar um êmbolo da seringa 3 mL para triture bem os pedaços de tecido. Use um êmbolo para cada amostra para evitar contaminações.
13. Adicione um pouco de (~ 5 mL) estéril fria PBS a cada Placa de Petri e transferência do lodo de tecido em um tubo Falcon 50 ml (lavar o prato Petri-se necessário para recuperar todo o tecido)
14. Agite vigorosamente o tubo Falcon, encha o tubo com PBS, centrifugue @ 800rpm x 5 minutos (Eppendorf modelo de bancada: 5810R) e aspirar o sobrenadante (repete 3 vezes)
15. Adicione a mistura de 1 ml de colagenase D (Roche, Cat # 11088882001, 1.5u / mL) / Dispase II (Roche, Cat #: 04942078001, 2.4u / mL) e 10μL de CaCl ₂ (250mm) para cada tubo, incubar a 37 graus Celsius com a rotação durante uma hora.
16. Adicionar 5-10 mL de frio estéril PBS, vortex, e pipetar cuidadosamente para homogeneizar o tecido.
17. Encha os tubos com PBS e misture bem.
18. Transferir o líquido para um filtro de células 40μm colocado em cima de um tubo de Falcon 50 mL para filtrar os pedaços restantes grandes de tecido. Divida cada amostra uniformemente em três tubos de 50mL Falcon. Encha cada um dos tubos com PBS, em seguida, centrifugar @ 1600rpm por 5 minutos a 8 graus Celsius.
19. Desprezar o sobrenadante e coletar células para a coloração.

3. Coloração de anticorpos e classificação:

Ao longo desta secção do protocolo, use FACS estéril e buffers de coleta e de trabalho em condições estéreis. Anticorpos comerciais são geralmente considerados estéreis se for manuseado correctamente.

20. Para única cor e amostras de controle isotipo, ressuspender a amostra em tampão FACS 1mL e dividir as células suspensas em nove tubos de 1,5 ml pré-rotulados Eppendorf (100 mL cada tubo).
    1. Configurar coloração única cor mistura de acordo com a tabela a seguir:
       ATENÇÃO: A concentração final de anticorpos isotipo controle na mancha deve coincidir com o anticorpo primário são o controle de. Por exemplo, se anti-Sca-1 é usado para uma μg/10 ⁶ células, o seu isotipo correspondente deverá ser usado na mesma concentração.
       

       Tubo #	Nome do tubo	Companhia	Cat #	clone	isotipo	diluição
       1	Não mancha
       2	Hoechst33342	sigma	B2261			2-5ug/ml
       3	PI	sigma	P4864			1ug/ml
       4	CD31-FITC CD45-FITC	eBioscience	11-0311-85	390	Rat IgG2a	500
       		Casa feita		I3 / 2	Rat IgG2b	500
       5	SCA1-PECY7	eBioscience	25-5981-82	D7	Rat IgG2a	5000
       6	α-7 APC	Casa feita		R2F2	Rat IgG2b	1000

    2. Configurar isotipo coloração controle mistura usando a seguinte tabela:
       

       Tubo #	Nome do tubo	Hoechst	PI	CD31- FITC	CD45- FITC	Scal- PE-Cy7	A-7- APC	Rat- IgG2b- APC	Rat- IgG2a- pecy7	Rat- IgG2a- FITC	Rat- IgG2b- FITC
       7	Iso- CD31 / CD45	+	+	-	-	+	+	-	-	+	+
       8	Iso- Scal- pecy7	+	+	+	+	-	+	-	+	-	-
       9	Iso- α-7-APC	+	+	+	+	+	-	+	-	-	-

    3. Pipeta a única cor e mistura de isótopos de controle de marcação (que geralmente ajustar a concentração de anticorpos, para que entre 5 e 10 mL de coloração mix são adicionados a cada amostra) para o tubo Eppendorf apropriado a partir do Passo 20. Misturar bem e incubar no gelo por 1 hora.
21. Mancha células de rato amostra com 800μL do coquetel de anticorpos (abaixo) para separação de células FACS. Misturar bem e incubar no gelo por 1 hora.
    Cocktail de anticorpos: Hoechst, PI, CD31-FITC, CD45-FITC, SCA1-PECY7, α-7 APC
    ATENÇÃO: A proporção ideal de anticorpos para as células deve ser determinada por titulação individualmente cada anticorpo, como diferenças significativas possam existir entre os lotes. A quantidade ideal de anticorpos para ser usado deve ser expresso em μgs de anticorpos por 10 ⁶ células-alvo e mantida constante quando se utiliza o mesmo lote de anticorpos. Claramente, se o número de células alvo não muda significativamente entre experimentos, ou se o volume coloração é escalado com o número de células, uma diluição fixa de cada anticorpo também pode ser usado.
22. Lavagem: Adicionar cerca de 1mL de tampão FACS a cada um dos nove tubos de controle, adicionar cerca de 20mL de tampão FACS para o tubo de amostra.
23. Centrifugar a tubos Eppendorf @ 3000rpm por 5 minutos (bancada topo centrífuga Eppendorf modelo: 5417C). Centrifugar o tubo de amostra @ 1600rpm por 5 minutos (bancada topo centrífuga Eppendorf modelo: 5810R).
24. Aspirar e desprezar o sobrenadante de todos os tubos.
25. Ressuspender as células no buffer FACS (1mL para cada um dos controles, 4 ml da amostra de classificação), células Pipetar em "tubos FACS" através do filtro de células cap (BD gato Falcon # 352235, 40μm tamanho dos poros) para remover pedaços restantes que podem afetar o citômetro.
26. Configure o Sorter FACS com controles de cor única e controles isotipo.
27. Coletar células classificados de acordo com a tabela a seguir em um buffer de coleta de 3,5 ml (95% DMEM, 5% FBS) separadamente. Normalmente, quando a colheita ambos os membros posteriores, um único tipo de rato silvestre poderia render cerca de 150.000 células progenitoras miogênica ou 100.000 células progenitoras adipogénicos, com a viabilidade acima de 95%, a avaliar pela re-análise de células classificadas por FACS, no final do procedimento (Figura 1 )
    Definição de progenitores miogênicos e adipogénicos baseado em manchas na superfície
    

    Antibody / mancha	Progenitoras miogênica (MP)	Progenitoras adipogénicos (AP)
    Hoechst	+	+
    PI	-	-
    CD31-FITC	-	-
    CD45-FITC	-	-
    SCA1-PECY7	-	+
    α-7 APC	+	-

4. Transplante:

28. Centrifugar as células classificadas @ 1500rpm por 5 minutos, retire as células sobrenadante e transferir para autoclavado tubos Eppendorf (1,5 mL), lavar as células com 500 mL de PBS estéril (soro grátis!), Então centrífuga @ 3000rpm por 5 minutos. Manutenção de todos os reagentes em condições estéreis e trabalhando em uma capa de cultura de tecidos, ressuspender progenitores miogênicos em PBS, ou progenitor adipogénicos em Matrigel (BD cat # 354234) em aproximadamente 10 ⁶ células / mL.
29. Transplante de células progenitoras ou miogênica progenitor adipogénicos a camundongos destinatário.
    1. Anestesiar o rato com isoflouran acordo com sua política instituição.
    2. Raspar o cabelo em torno da região de injeção e, em seguida esterilizar a pele por fricção com álcool a 70%
    3. Injetar 20μL de células progenitoras ou células progenitoras miogênica adipogénicos (= 20k células) usando um 10/03 seringa de insulina CC (BD cat # 309300).
30. Depois de um tempo adequado (três semanas funciona bem, mas miofibras expressar doadores marcadores derivados transgênicos são geralmente evidente dentro de uma semana após o transplante), anestesiar os ratos destinatário a partir do passo 29 por injeção intraperitoneal de 400 mL Avertin (Sigma Cat # T04840-2, 25 mg / mL), então perfundir transcardially com 50mL de PBS (contém 10 mM de EDTA) em primeiro lugar, seguido de 15ml de PFA 4%. Coletar tecido alvo, pós-fix com PFA 4% durante a noite, se necessário, então a transferência para sacarose a 20% durante a noite. Incorporar em outubro congelar, e cryosection.

5. Resultados representativos:

MP quando são transplantadas no músculo esquelético do rato, eles prontamente se fundem com fibras musculares pré-existentes. Portanto, qualquer rótulo genético presente nas células do doador serão facilmente detectáveis ​​nas fibras que os recebeu. A Figura 2 mostra um exemplo onde as células transplantadas expressa phostphatase alcalinas humanos, revelou histoquimicamente.

AP quando são transplantadas o resultado é altamente dependente do ambiente do local de transplante: quando transplantadas por via subcutânea essas células dão origem aos adipócitos e miofibroblastos (ver figura 2). Em muitos outros sites, incluindo o músculo, não sobreviver, a menos degeneração gordurosa foi induzida ^3.

Figura 1. Classificação estratégia para o isolamento de populações de células progenitoras do músculo esquelético (A) estratégia de classificação:. Células viáveis ​​foram identificados com base na dispersão para a frente e dispersão lateral. Coloração Hoechst foi usada para excluir restos anuclear e propidium iodeto de coloração (PI) para excluir as células mortas. Hematopoiéticas (CD45) e endoteliais (CD31), as células foram excluídos os portões de classificação. O α7 ^{+ +} Hoechst PI ^- CD45 ^- CD31 ^- scal ^- subconjunto contém todos os progenitores miogênicos (MP). O scal ^{+ +} Hoechst PI ^- CD45 ^- CD31 ^- α7 ^{- População} contém progenitores adipogénicos (AP). (B) de fluorescência-menos-um controles (FMO) isotipo confirmar a especificidade da mancha. (C) Pureza cheques de subconjuntos MP e AP após a triagem.

Figura 2. Resultados representativos seguintes MP e transplante AP. AP foram transplantados subcutaneamente (painel superior) e MP por via intramuscular (painel inferior). Em ambos os casos, as células do doador se originou de um camundongo transgênico expressando fosfatase alcalina humana, identificados pela coloração marrom.

Discussão

O objetivo deste protocolo é conseguir um equilíbrio razoável entre os rendimentos elevados e alta viabilidade das células purificadas. O passo mais crítico para garantir que as células saudáveis ​​são recuperados é, previsivelmente, a dissociação enzimática do tecido de partida. O manuseio do tecido deve ser particularmente delicado, que é difícil de demonstrar ou apreciar ainda em um formato audiovisual. Outro fator importante é a duração do procedimento. O tempo que leva para ir do doador para o animal receptor, menor a viabilidade e, portanto, a eficiência de enxerto. Caso haja qualquer dúvida sobre a viabilidade de que não é imediatamente respondeu, olhando para a frequência de PI evento positivo nas amostras de células purificadas depois da classificação, sugerimos que um ensaio por diluição limitante para medir clonogenicity é realizada ^3. Espécie típica do músculo danificado rotineiramente produzir cerca de 1 em 15-20 células capazes de iniciar colônias miogênica ou fibro / adipogénicos in vitro. Embora essencialmente 100% das colônias iniciadas a partir de MPs contêm miotubos diferenciados, apenas cerca de um terço das colônias obtidas FAPs conter adipócitos, além de miofibroblastos actina músculo liso positivos.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Colagenase II	Sigma-Aldrich	C-6885,	500 u / ml
Colagenase D	Roche	11088882001	1,5 u / ml
Deslocar II	Roche	04942078001	2,4 u / ml
coador celular	BD	352340	40 mM
Tubo com filtro de células	BD	352235	40 mM
Hoechst33342	Sigma-Aldrich	B2261	2-5 ug / ml
CD31-FITC	Ebiosciences	11-0311-85	Clone 390
CD45-FITC	Home made		Clone I3 / 2
SCA1-PECY7	Ebiosciences	25-5981-82	Clone D7
α-7 integrina APC	Home made	Informe-se com Rossi laboratório	R2F2