Purification des progéniteurs du muscle squelettique

Résumé

Méthode pour la dissociation enzymatique, l'étiquetage de surface et de la purification par cytométrie en flux de fibro / adipogéniques et les progéniteurs myogéniques du muscle squelettique murin.

Résumé

Le muscle squelettique contient populations progénitrices multiples origines distinctes embryonnaire et potentiel de développement. Progéniteurs myogéniques, résidant habituellement dans une «position de cellule satellite» entre la membrane plasmatique fibres musculaires et de la membrane basale de laminine-riche qu'il ensheaths, sont auto-renouvellement des cellules qui sont uniquement engagés à ^1,2 lignage musculaire. Nous avons récemment décrit une deuxième classe de navire de progéniteurs associés qui peuvent générer des myofibroblastes et les adipocytes blancs, qui répond efficacement aux dommages causés par la prolifération d'entrer et offre un soutien trophique à cellules myogéniques pendant ^3,4 régénération des tissus. L'un des tests les plus fiables pour déterminer le potentiel de développement et de régénération d'une population cellulaire donnée repose sur leur isolement et de la transplantation ^5-7. À cette fin, nous avons optimisé les protocoles pour leur purification par cytométrie en flux à partir de muscle enzymatiquement dissocié, ce qui nous donnera un aperçu dans cet article. Les populations obtenues en utilisant cette méthode, soit des cellules contiennent des colonies myogénique ou fibro / adipogéniques formant: pas d'autres types cellulaires sont capables de développer in vitro ou in vivo dans la prestation de survivant. Toutefois, lorsque ces populations sont utilisées immédiatement après le genre d'analyse moléculaire (par exemple qRT-PCR), il faut garder à l'esprit que les sous-ensembles fraîchement triées peut contenir d'autres cellules contaminant qui n'ont pas la capacité de former des colonies ou greffant les bénéficiaires.

Protocole

1. Collection de tissus:

1. Utilisez la souris entre 7 et 12 semaines. Habituellement, au moins deux animaux sont utilisés: l'un est de mettre en place le FACS seule couleur contrôles requis pour l'indemnisation et pour la fluorescence-moins-un échantillons de contrôle isotypique. L'autre est l'échantillon réel pour le tri.
2. Euthanasier les souris par inhalation de CO ₂ ou selon un protocole d'éthique des choix. Placez la souris sur une serviette en papier, face vers le haut, et de pulvérisation avec de l'éthanol à 70% à fond pour éviter toute contamination avec la fourrure de la souris.
3. Soulever la peau dans la région abdominale avec une pince, puis prendre une petite coupe longitudinale avec des ciseaux pointus.
4. Peler les deux volets de la peau dans des directions opposées (haut et bas) complètement exposer les muscles des membres postérieurs en dessous.
5. D'accise du tissu musculaire en insérant et en étendant les ciseaux le long des deux côtés du tibia.
6. Répétez le même processus pour le fémur pour en extraire le tissu musculaire.
7. Placez tous les tissus musculaires excisées dans 60mm Pétri-vaisselle, en utilisant un seul plat pour le tissu de chaque souris.
8. Répéter l'opération pour toutes les souris.

2. Dissocier tissu en cellules isolées par digestion enzymatique:

Tout au long de cette section du protocole, l'utilisation des réactifs stériles et des outils et du travail dans des conditions stériles.

9. Ajouter 2 ml de collagénase II (Sigma, cat # 6885, 500U / ml) et 20 ul de CaCl ₂ 250mm d'actions à chaque boîte de Petri.
10. Déchirer le tissu musculaire en petits morceaux (environ 1 mm ³⁾ avec deux pinces (une dentelé, une avec 2 dents, des outils de Fine Science, cat # 11051-10, 11154-10), en prêtant attention à enlever et jeter autant contaminés non tissu musculaire que possible.
11. Couvrir le Petri-vaisselle et les incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.
12. Récupérer le Petri-plats et d'utiliser une seringue de 3 ml plongeur au fond écraser les morceaux de tissu. Utilisez un poussoir pour chaque échantillon afin d'éviter les contaminations.
13. Ajoutez un peu (~ 5 ml) stériles PBS froid à chaque boîte de Petri et le transfert des boues de tissu dans un tube de 50 ml Falcon (rincer la boîte de Petri, si nécessaires pour récupérer tous les tissus)
14. Agiter le tube Falcon vigoureusement, remplir le tube avec du PBS, centrifuger @ 800rpm x 5 minutes (Modèle de paillasse Eppendorf: 5810R), et aspirer le surnageant (répéter 3 fois)
15. Ajouter le mélange de 1 ml de collagénase D (Roche, Cat # 11088882001, 1,5 U / ml) / dispase II (Roche, Cat #: 04942078001, 2.4u / ml) et 10 ul de CaCl ₂ (250mm) à chaque tube, incuber à 37 degrés Celsius avec rotation pendant une heure.
16. Ajouter 5-10 mL de froid, de PBS stérile, vortex et une pipette soigneusement afin d'homogénéiser le tissu.
17. Remplir les tubes avec du PBS et mélangez bien.
18. Transférer le liquide dans un tamis cellulaire 40μm placé sur le dessus d'un tube Falcon de 50 ml de filtrer les morceaux restants grande partie des tissus. Diviser chaque échantillon homogène dans des tubes Falcon 50 ml trois. Remplissez chacun des tubes avec du PBS, puis centrifuger @ 1600RPM pendant 5 minutes à 8 degrés Celsius.
19. Jeter le surnageant et de recueillir des cellules pour la coloration.

3. Coloration des anticorps et de tri:

Tout au long de cette section du protocole, l'utilisation FACS stérile et tampons de collecte et de travailler dans des conditions stériles. Anticorps commerciaux sont généralement considérés comme stériles si elles sont correctement traitées.

20. Pour seule couleur et d'échantillons de contrôle isotype, resuspendre l'échantillon dans un tampon de FACS 1ml et diviser les cellules en suspension dans neuf 1.5ml tubes Eppendorf pré-étiquetées (100 ul de chaque tube).
    1. Mettre en place des taches de couleurs simples mélanges selon le tableau suivant:
       ATTENTION: La concentration finale d'anticorps isotype contrôle de la tache doit correspondre à celle de l'anticorps primaire, ils sont le contrôle des. Par exemple, si l'anti-Sca-1 est utilisé pour une μg/10 ⁶ cellules, son isotype correspondant doit être utilisé à la même concentration.
       

       Tube #	Nom du tube	Société	Cat #	clone	isotype	de dilution
       1	Non-taches
       2	Hoechst33342	sigma	B2261			2-5ug/ml
       3	PI	sigma	P4864			1ug/ml
       4	CD31-FITC CD45-FITC	eBioscience	11-0311-85	390	Rat IgG2a	500
       		Maison faite		I3 / 2	Rat IgG2b	500
       5	SCA1-PECY7	eBioscience	25-5981-82	D7	Rat IgG2a	5000
       6	α-7 APC	Maison faite		R2F2	Rat IgG2b	1000

    2. Mettre en place coloration contrôle isotypique mixages en utilisant le tableau suivant:
       

       Tube #	Nom du tube	Hoechst	PI	CD31- FITC	CD45- FITC	Scal- PE-Cy7	A-7- APC	Rat- IgG2b- APC	Rat- IgG2a- pecy7	Rat- IgG2a- FITC	Rat- IgG2b- FITC
       7	Iso- CD31 / CD45	+	+	-	-	+	+	-	-	+	+
       8	Iso- Scal- pecy7	+	+	+	+	-	+	-	+	-	-
       9	Iso- α-7-APC	+	+	+	+	+	-	+	-	-	-

    3. Déposer le mélange de couleurs simples et isotopiques coloration de contrôle (nous avons l'habitude d'ajuster la concentration d'anticorps de sorte qu'entre 5 et 10 uL de coloration mélange sont ajoutés à chaque échantillon) dans le tube Eppendorf appropriée de l'étape 20. Bien mélanger et incuber sur la glace pendant 1 heure.
21. Colorer des cellules de souris échantillon avec 800μL du cocktail d'anticorps (ci-dessous) pour le tri de cellules FACS. Bien mélanger et incuber sur la glace pendant 1 heure.
    Cocktail d'anticorps: Hoechst, PI, CD31-FITC, CD45-FITC, SCA1-PECY7, α-7 APC
    ATTENTION: Le rapport optimal des anticorps aux cellules doit être déterminée par titration individuelle chaque anticorps, comme des différences significatives peuvent exister entre les lots. La quantité optimale d'anticorps à utiliser doit être exprimée en μgs d'anticorps par 10 ⁶ cellules cibles et maintenue constante lors de l'utilisation du même lot d'anticorps. En clair, si le nombre de cellules cibles ne change pas significativement entre les expériences, ou si le volume est réduit avec coloration du nombre de cellules, une dilution fixe de chaque anticorps peut également être utilisé.
22. Lavage: Ajouter environ 1 ml de tampon FACS à chacun des 9 tubes de contrôle; ajouter environ 20 ml de tampon FACS au tube échantillon.
23. Centrifuger les tubes Eppendorf @ 3000rpm pendant 5 minutes (banc Eppendorf centrifugeuse, Modèle: 5417C). Centrifuger le tube de l'échantillon @ 1600RPM pendant 5 minutes (banc Eppendorf dessus centrifugeuse, Modèle: 5810R).
24. Aspirer et jeter le surnageant de tous les tubes.
25. Resuspendre les cellules dans le tampon FACS (1ml pour chacun des contrôles, 4ml pour le tri des échantillons), les cellules Pipeter dans des «tubes FACS" à travers le tamis cellulaire de la PAC (cat # 352235 BD Falcon, 40μm taille des pores) pour enlever les grumeaux restants qui peuvent affecter le cytomètre.
26. Mettre en place la trieuse FACS avec des contrôles seule couleur et de contrôle isotypique.
27. Recueillir les cellules triées selon le tableau suivant dans un tampon 3,5 ml de collecte (95% DMEM, 5% de FBS) séparément. Normalement, lorsque la récolte deux membres postérieurs, une souris de type sauvage unique pourrait produire environ 150.000 cellules progénitrices myogéniques ou 100.000 cellules progénitrices adipogéniques, avec la viabilité supérieure à 95%, tel que jugé par réanalyse cellules triées par FACS à la fin de la procédure (figure 1 )
    Définition des progéniteurs myogéniques et adipogéniques basée sur coloration de surface
    

    Anticorps / teinture	Progénitrices myogéniques (MP)	Progénitrices adipogéniques (AP)
    Hoechst	+	+
    PI	-	-
    CD31-FITC	-	-
    CD45-FITC	-	-
    SCA1-PECY7	-	+
    α-7 APC	+	-

4. Transplantation:

28. Centrifuger les cellules triées @ 1500rpm pendant 5 minutes, retirer les cellules surnageant et transfert à l'autoclave des tubes Eppendorf (1,5 ml), laver les cellules avec 500 ul de PBS stérile (sérum gratuit!), Puis centrifuger @ 3000rpm pendant 5 minutes. Maintenir tous les réactifs dans des conditions stériles et de travailler dans une hotte de culture tissulaire, resuspendre progéniteurs myogéniques dans le PBS, ou progénitrices adipogéniques de Matrigel (cat # 354234 BD) à environ 10 ⁶ cellules / ml.
29. Transplant progéniteurs myogéniques ou progénitrices adipogéniques aux souris receveuses.
    1. Anesthésier la souris avec isoflouran en fonction de votre politique de l'institution.
    2. Raser les poils autour de la région d'injection, puis stériliser la peau par frottement avec de l'éthanol à 70%
    3. Injecter 20 pi des progéniteurs myogéniques ou progéniteurs adipogéniques (= 20k cellules) à l'aide d'une seringue 3 / 10 CC insuline (BD # 309300 cat).
30. Après un moment approprié (trois semaines qui fonctionne bien, mais myofibrilles exprimer provenant de donneurs marqueurs transgéniques sont habituellement évidents dans la semaine après la transplantation), d'anesthésier les souris receveuses de l'étape 29 par injection intrapéritonéale de 400 ul Avertin (Cat Sigma # T04840-2, 25 mg / ml), puis perfuser transcardiaque avec 50mL de PBS (contient 10 pM de l'EDTA) en premier, suivis de 15 ml de 4% en PFA. Recueillir tissu cible, le post-fixer avec 4% PFA nuit si nécessaire, puis transfert à 20% de sucrose pendant la nuit. Intégrer dans les PTOM, geler et cryosection.

5. Les résultats représentatifs:

Lorsque MP sont transplantés dans les muscles squelettiques de souris, ils facilement fusionner avec pré-existante myofibrilles. Par conséquent, toute étiquette génétique présente dans les cellules du donneur sera facilement détectable dans les fibres qui les a reçus. La figure 2 montre un exemple où les cellules transplantées ont exprimé humaine phostphatase alcalines, a révélé histochimiquement.

Lorsque l'AP sont transplantés le résultat est très dépendante de l'environnement du site de transplantation: lorsqu'elles sont transplantées sous-cutanée de ces cellules donnent origines en adipocytes et les myofibroblastes (voir figure 2). Dans de nombreux autres sites, y compris les muscles, ils ne survivent pas à moins dégénérescence graisseuse a été induite ^3.

Figure 1. Tri stratégie pour l'isolement des populations progénitrices du muscle squelettique stratégie de tri (A):. Cellules viables ont été identifiés sur la base de dispersion vers l'avant et diffusion latérale. Coloration Hoechst a été utilisé pour exclure les débris anucléées et de l'iodure de propidium (PI) coloration d'exclure les cellules mortes. Hématopoïétiques (CD45) et endothéliales (CD31) des cellules ont été exclus de la porte de tri. Le α7 ⁺ Hoechst ⁺ PI ^- CD45 ^- CD31 ^- Scal ^- sous-ensemble contient tous les progéniteurs myogéniques (MP). Le Scal ⁺ Hoechst ⁺ PI ^- CD45 ^- CD31 ^- α7 ^- population contient des progéniteurs adipogéniques (AP). (B) Fluorescence-moins-un contrôle isotype (FMO) confirment la spécificité de la coloration. (C) Pureté contrôles de sous-ensembles MP et AP après le tri.

Figure 2. Les résultats représentatifs suivants MP et AP transplantation. AP ont été transplantés sous-cutanée (panneau supérieur) et le député par voie intramusculaire (panneau inférieur). Dans les deux cas, les cellules du donneur provenaient d'une souris transgéniques exprimant la phosphatase alcaline humaine, identifié par la coloration brune.

Discussion

L'objectif de ce protocole est de trouver un équilibre raisonnable entre les rendements élevés et une viabilité élevée des cellules purifiées. L'étape la plus critique pour s'assurer que les cellules saines sont récupérés est, sans surprise, la dissociation enzymatique du tissu de départ. La manipulation des tissus doivent être particulièrement doux, ce qui est difficile à démontrer ou à apprécier encore dans un format audiovisuel. Un autre facteur clé est la longueur de la procédure. Plus il faut aller chez le donneur à l'animal receveur, le bas de la viabilité et donc l'efficacité greffe. Faut-il y avoir aucune question sur la viabilité qui n'est pas immédiatement répondu en regardant la fréquence des PI événement positif dans les échantillons de cellules purifiées après le tri, nous suggérons qu'un test de dilution limite à mesurer clonogénicité est effectué ^3. Sortes typiques du muscle intact régulièrement le rendement d'environ 1 sur 15 à 20 cellules capables d'initier des colonies myogénique ou fibro / adipogéniques in vitro. Alors que pratiquement 100% des colonies initiée par les députés contiennent les myotubes différenciés, seulement environ un tiers des colonies obtenues à partir des adipocytes FAP contiennent, en plus de douceur myofibroblastes actine musculaire positif.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue	Commentaires
Collagénase II	Sigma-Aldrich	C-6885,	500 U / ml
Collagénase D	Roche	11088882001	1,5 U / ml
Déplacer II	Roche	04942078001	2,4 U / ml
tamis cellulaire	BD	352340	40 um
Tube avec filtre cellulaire	BD	352235	40 um
Hoechst33342	Sigma-Aldrich	B2261	2-5 ug / ml
CD31-FITC	Ebiosciences	11-0311-85	Clone 390
CD45-FITC	Fait maison		Clone I3 / 2
SCA1-PECY7	Ebiosciences	25-5981-82	Clone D7
α-7 intégrine APC	Fait maison	Renseignez-vous auprès du laboratoire Rossi	R2F2